Download metodos microbiològicos para la enumeraciòn e identificaciòn

Microbiologia de alimentos
 Dely Rubi Chavez Garay
 HectorRoberto Jimenez Campos
Identificación bacteriana
 Cada género, inclusive especie, tiene diferentes reacciones cuando se les
enfrentan diferentes reactivos, esto se hace a partir de un cultivo puro, ya
la bacteria aislada, con estas pruebas podremos decir casi con exactitud
de que género y qué especie es esta bacteria.
 Cada género de bacteria, inclusive especie,
tiene diferentes reacciones cuando se les
enfrentan a diferentes reactivos, esto se hace a
partir de un cultivo puro, ya la bacteria aislada,
con estas pruebas podremos decir casi con
exactitud de que género y qué especie es esta
bacteria. A estas pruebas se les ha como
primarias, secundarias y complementarias.
Pruebas Primarias (identificación)
Tinción de Gram
Revela la forma de la bacteria, agrupación y grupo
taxonómico al que pertenece: Gram (+) o Gram (-).
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las
paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
se deshidratan los poros cerrándolos, impidiendo
que escape el complejo cristal violeta/yodo,
Gram (+) Staphylococcus
no retiene el complejo de cristal violeta/yodo
Gram (-) E. coli cells
Tinción de Ziehl Neelsen
Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para
la identificación de microorganismos patógenos.
Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una serie de
bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las
micobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias gram
positivas y gram negativas, sino en ácidos micólicos. Esta particularidad las
hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se produce en casi
ningún otro tipo bacteriano.
Utiliza tres reactivos. El colorante primario es la
fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante.
Como mordiente se utiliza flameado de la
preparación con el colorante. La solución
decolorante elimina el colorante primario
excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes.
(BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de
azul el resto de la preparación
Tinción de esporas
La espora es un mecanismo de defensa generalmente de los géneros Bacillus y
Clostridium.
Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas
esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras
de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones
desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las condiciones
ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a
generarse formas vegetativas.
Están descritos varios métodos para teñir esporas.
El de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita.
Este colorante se une fuertemente a las esporas
gracias a la utilización de calor como mordiente.
La fase de decoloración en este caso se realiza con
agua abundante. Las formas vegetativas pierden el
color verde y se tiñen con el colorante de contraste
(fucsina o safranina).
Prueba de catalasa
 La catalasa es una enzima que descompone al peróxido
de hidrógeno en oxígeno y agua, esta enzima es similar a
la estructura de la hemoglobina. Excluyendo al género
Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.
La base de esta prueba es demostrar la presencia de la
enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo.
El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia.
 Catalasa (+): Staphylococcus aureus, E. coli,
Pseudomonas sp.
 Catalasa (-): Streptococcus spp.
Prueba de oxidasa
 Básicamente es la detección de la enzima oxidasa, muy útil en la identificación
de bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del
sistema de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxígeno
molecular, por la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de
transferencia de electrones.
 El sistema de citocromos está generalmente presente en organismos aeróbicos.
Utilizando un tubo capilar con tetrametil-p-phenylendiamina al 1%, se adiciona
una pequeña cantidad a un cultivo bacteriano colocado sobre un papel filtro y
obtenemos las siguientes reacciones:
Oxidasa(+), presencia de oxidasa se indica por un
color púrpura obscuro en el papel, en menos de 10 seg.
Ej. Pasteurella multocida
Oxidasa (-), que consiste en una ausencia de color
púrpura.
Ej. Escherichia coli
Ácido de la Glucosa
 muchas de las bacterias de interés médico usan la glucosa como fuente de carbono,
como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa la
glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de dicho carbohidrato.
En un tubo con agua peptonada al 1% tapado,
y un tubo de Durham, se inocula la bacteria
por agitación teniendo cuidado de no mover
el tubo de Durham e incubándolo 24 horas y
37°C se obtienen los siguientes resultados.
Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido
y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se
observará rosa, si produce gas, se observará
Una burbuja en el tubo de Durham.
(+) Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli
(-)Negativo a producción de gas: Proteus stuartii.
Prueba de O/F
 para realizar esta prueba se usa el medio básico de
Hugh y Leisfon con un pH de 7.1. Es un medio
semisólido de color verde que se inocula por picadura,
contiene carbohidratos como: glucosa, lactosa, sacarosa
o maltosa al 10%. Como indicador de pH tiene Azul de
bromotimol. Se usa en dos tubos, uno sin aceite y otro
con acetie o vaselina sellándolo. Se inoculan los dos
tubos con la bacteria por picadura y se mantiene a 37°C
por 24 horas, obteniéndose:
Prueba MIO
(Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)
 Esta prueba bioquímica permite identificar
bacterias de acuerdo a su motilidad a la
reacción de Indol a la descarboxilación
de la ornitina.
 Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro
organimos en el medio de cultivo e
incubar por 24 horas a 37° .
Prueba TSI
(Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
 El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la
capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y
lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la
producción de SH2.
 Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en
la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
bacterias fermentadoras de la glucosa, lactosa, sacarosa, aerogénicas,
productoras de SH2.
 Prodedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto).
Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo
del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el
pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar
a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el
pH de los cultivos.
Prueba LIA
(Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro
 Esta prueba permite diferenciar los
microorganimos que producen
descarboxilación o desaminación de la lisina.
Se pude detectar ademas la produccion de
SH2 y es más sensible que el TSI para la
detección de SH2. Es muy utilizado par
descartar Salmonella de aislamientos
primaros.
 Procedimiento:
Inocular en forma de estría las cepas
de micro organimos en el medio de
cultivo e incubar por 24 horas a 37°
Agar Citrato
 La utilización de citrato como única fuente de carbono es
una prueba útil en la identificación de enterobacterias.
La utilización de citrato como única fuente de carbono se
detecta en un medio de cultivo con citrato como única
fuente de carbono mediante el crecimiento y la
alcalinización del medio. Este aumento de pH se
visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al
alcalino a pH 7,6.
 Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico.
Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y
cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se
pueden producir falsos positivos por crecimiento a
partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C
durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa
crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de
un viraje del indicador al azul.
Indol
 El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido
triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La
producción de indol es una característica importante para la identificación de
muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la
formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del
p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y
Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
 Procedimiento:
Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18
a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la
pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del
reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de
indol y una prueba positiva.
 Resultados:
(+) Escherichia coli
( - ) Klebsiella pneumoniae
Rojo Metilo
 Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los
diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de
productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa.
Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación
del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman
fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En
la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y
succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y
4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de
fermentación ácido mixta.

Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no
más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 hr.
Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo d
e rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable.
Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del
indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta.
Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado
como positivo.
Vogues Proskauer
 En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol
descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un
producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia
de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol
dando un color rojo-fucsia.
 Procedimiento:
 Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo
en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación
transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y
0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno
atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojofucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la
acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.
 Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(-)Escherichia coli
 Se trata de conocer el número total de microorganismos
presentes en el alimento. Este número no guarda relación con el
de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como
índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de
las características higiénicas generales del alimento.
 -Dependiendo de las características del medio utilizado (medio
rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no
láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de
incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos
analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general
se investiga la presencia de microorganismos aerobios o
aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas
situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés
hacer recuentos de anaerobios totales.
Contaje de Placa
 Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen
conocido del alimento que se analiza. El resultado es
función de una serie de factores como son el método de
muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y
las características del medio de cultivo. Los cultivos pueden
hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que
considerar que los cultivos en masa son letales para la flora
psicotrofa. Cada bacteria viable formará una colonia, el
plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de
un plaqueador en espiral que va depositando
concentraciones progresivamente más diluídas de la
muestra.
Filtros de membrana
 Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son
filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las
bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro
sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La
muestra puede haber sido procesada para
epifluorescencia previamente, lo que facilita el
recuento (la epifluorescencia se puede provocar con
naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos
nucleicos).
Microcolonias en DEFT
DEFT son las iniciales en inglés de Direct Epifluorescence
Filter Technique (técnica deepifluorescencia directa en
filtro). En esta técnica las bacterias se filtran para retenerlas
en una membrana apropiada que posteriormente se trata con
un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para
teñir las células bacterianas (se somete el filtrado a un
tratamiento previo con detergentes para destruir las células
somáticas). La detección de los microorganismos ha de
hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por
cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En
ciertos casos, las membranas se incuban para producir
colonias que son más fácilmente dtectables.
Contaje de microcolonias al
microscopio
 Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un
porta y se incuba para seguir la formación de
microcolonias al microscopio.
Gotitas de agar
 Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y
se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri
(gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento
de las colonias en las gotitas tras la incubación.
Films secos (Petrifilm)
 Son películas deshidratadas de medios de cultivos
generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la
muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se
hace el recuento.
Método del número más probable
 Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del
número de bacterias presentes en las diluciones más
altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es
popular aunque poco exácto.
Métodos basados en la reducción
de colorantes
 Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes
reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de
color y esto es medible. Usado en medios líquidos
(lácteos).
Tubos rodantes
 Son tubos herméticamente cerrados en los que
haciéndolos girar se forma una fina capa de agua.
Utiles para recuento de anaerobios.
Contaje microscópico directo
 Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen
determinado y se recuentan las bacterias.
Nucleasa Termoestable
 S. aureus produce una nucleasa termoestable con
mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina
responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede
detectarse experimentalmente como un índice de la
presencia de S. aureus incluso en concentraciones
demasiado bajas para que hayan producido unas
cantidades detectables de enterotoxina.
Lisado de Limulus
 Usado para detección de endotoxinas (derivadas del
lipopolisacárido LPS de las bacterias Gram negativas).
Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito
de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por
cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede
detectar 300 células de E. coli. El método detecta
células viables y no-viables. Es muy rápido.
Sondas de ácidos nucleicos
 Sirven para identificar microorganismo desconocidos
por medio de Southern.
PCR
 Método para detectar número extremadamente bajos
de microorganismos con una cierta rapidez basado de
la producción de copias de genes específicos de un
microorganismo en cuestión.
Medida de ATP
 Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa,
aunque hay algunos problemas experimentales que
hacen que la técnica sea controvertida.
Radiometria
 Medida de la transformación de un substrato con 14C
en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es
inversamente proporcional a la cantidad de
microorganismos presente.
Substratos Fluoro y Cromogénicos
 Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para
facilitar y acelerar la detección de los
microorganismos.