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PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE
SALMONELLA EN ALIMENTOS POR
MÉTODO CONVENCIONAL
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
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OBJETIVO
Detectar la presencia de Salmonella en los alimentos mediante método cualitativo recomendados
por organismos internacionales
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos que de acuerdo a las normativas
vigentes en el país requieran este análisis.
3.
FUNDAMENTO
De acuerdo con las normas internacionales y al reglamento sanitario de los alimentos la sola
presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo.
La técnica permite realizar compósitos de muestras y según el número de unidades que
componen el compósito agregar el caldo de preenriquecimiento manteniendo la proporción 1:9
a no ser que no esté indicado. Para muestras no analizadas sobre una base de peso exacto,
referirse a instrucciones para el método específico.
El fundamento del método para la detección en alimentos se basa en que la presencia de
Salmonella está en menor número que el de la flora acompañante especialmente en alimentos sin
tratamiento previo o bien que los microorganismos se encuentran estresados por los procesos
tecnológicos a que son sometidos (calor, radiación, congelación etc.)
En el laboratorio los métodos convencionales para su recuperación consideran todos estos
factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de preenriquecimiento y
enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realización
de pruebas bioquímicas y Serotipificación.
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La etapa de preenriquecimiento recomendada en alimentos para el aislamiento de Salmonella
difiere del método empleado en muestras clínicas debido a varios factores entre los cuales
estarían:
a) El Nº de células es usualmente más bajo que en muestras clínicas.
b) Los procesos tecnológicos que se aplican a los alimentos debilitan a la bacteria.
c) La constitución propia del alimento: nutrientes, pH, aw, etc. influye en la sobrevivencia o en
su multiplicación.
La presencia de substancias tóxicas para las bacterias presentes en el alimento
4.
REFERENCIAS
4.1
Bacteriological Analytical Methods On line, Diciembre 2007.
4.2
A.P.H.A. Asociación Americana de Salud Pública.-1992. Formules antigeniques des
serovars de Salmonella. WHO colaborating centre for reference and research on
Salmonella.-Michel y. Popoff and Leon le Minor, Institute Pasteur.28 rue du Dr.Roux
75724. Paris cedex 15, France.1992.
4.3
Tablas T.L.M. Instituto de Salud Pública de Chile. 1991. M.E.Valenzuela y J. Astorga.
4.4
AOAC International. 2000. Official methods of analysis, 18th ed., Methods 967.25,
967.26, 967.27, 967.28, 978.24, 989.12, 991.13, 994.04, and 995.20. A.O.A.C, md.
International, Gaithersburg.
5.
TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
EQUIPOS
6.1.1 Baño termoregulado a 42 y 43 ± 0,2°C.
6.1.2 Incubadora a 35ºC +/- 2ºC.
6.1.3 Vortex mixer
6.2
MATERIAL DE LABORATORIO
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6.2.1 Placas Petri de 15x100mm
6.2.2 Pipetas estériles de 5m con 0.1vol, 1mL con 0.01 vol L
6.2.3 Asa de nicrón (aprox. de 3mm de diámetro).
6.2.4 Tubos estériles de 16x160 mm.
6.2.5 Mondadientes de madera o asa de vidrio
6.2.6 Mecheros Bunsen
6.2.7 Frascos de capacidad ± 300 mL.
6.3
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS
6.3.1
Caldo Rappaport Vassiliadis (RV)
6.3.2
Caldo base Tetrationato (T.T)
6.3.3
Agar Xilosa Lisina-Desoxicolato (XLD agar)
6.3.4
Agar Bismuto Sulfito(B.S.)
6.3.5
Agar Hektoen (HK)
6.3.6
Agar Triple azúcar (TSI)
6.3.7
Lisina Iron Agar (LIA)
6.3.8
Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO)
6.3.9
Agar citrato Simmon's
6.3.10
Caldo Urea
6.3.11
Caldo malonato
6.3.12
Caldo con indicador para carbohidratos (Glucosado ,Lactosado Sacarosado)
6.3.13
Solución de verde brillante al 1%
6.3.14
Solución de yodo yodurada
6.3.15
Etanol 70%
6.3.16
Novobiocina al 1% esterilizada por filtración
6.3.17
Reactivo Kovac's
6.3.18
Control positivo: Cepa Salmonella enteritidis ATCC 13076
6.3.19
Control atípico: Cepa Salmonella typhimurium H2S negativa
Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H2S positiva.
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6.3.20
6.4
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Cepa Control negativo: S. aureus
DISTRIBUCIÓN DEL ENVASADO DE LOS MEDIOS
6.4.1 CALDO DE ENRIQUECIMIENTO
6.4.1.1
Caldo Base Tetrationato (T.T) que se prepara a partir del medio base comercial en
tubos tapa rosca (10ml) al que se le agrega por tubo al momento de ser usado 0,2 mL
de solución de yodo yodurado y 0,1 mL de solución de verde brillante al 1%.
6.4.1.2
Caldo Rappaport Vassiliadis Modificado (CRV.) Se prepara a partir del medio
comercial en tubos tapa rosca (10 mL).
6.4.2 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS SÓLIDOS
6.4.2.1
Agar Hektoen
6.4.2.2
Agar Xilosa Lisina Dexocicolato (X.L.D) (1,2 mL de novobiocina al 1% x litro).
6.4.2.3
Agar Bismuto Sulfito comercial y distribuido en 20 mL en placas Petri.
6.4.3 MEDIOS DIFERENCIALES SÓLIDOS
6.4.3.1
Triple Sugar Agar (TSI) distribuir 4 mL en tubos tapa rosca.
6.4.3.2
Lisina Iron Agar (LIA) distribuir 4,5 mL en tubos tapa rosca.
6.4.3.3
Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) distribuir 3 a 4 mL en tubos tapa rosca.
6.4.3.4
Agar Citrato Simmon's distribuir 3 mL en tubos semitendido.
6.4.4 MEDIOS DIFERENCIALES LÍQUIDOS
6.4.4.1
Caldo malonato de Na, distribuir 2,5 ml en tubo tapa rosca.
6.4.4.2
Caldos base para carbohidratos: distribuir 5 ml en tubos y agregar el carbohidrato
mantenido en soluciones al 10 %: glucosa, lactosa, sacarosa, y eventualmente otros
azúcares como sorbitol.
6.4.4.3
Caldo Urea, distribuir 1,5 a 3,0 mL en tubos tapa rosca de 13 x 10 mm.
6.4.5 SUEROS
6.4.5.1
Suero Polivalente Somático para Salmonella Poly A-I (DIFCO)
6.4.5.2
Suero polivalente flagelar.
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7.
DESARROLLO
7.1
En el laboratorio “Enterobacteriaceae “se reciben las muestras homogeneizadas desde el
laboratorio “Recepción de muestras”.
7.1.1
Anotar en cuaderno de Inscripción del laboratorio de Enterobacteriaceae la clave y
número de las muestras.
7.1.2
Someter a incubación la muestra en caldo de preenriquecimiento a 35 °C por 18-24
horas para continuar con el proceso.
* Nota: En el caso de las muestras que deben traspasarse a caldo de enriquecimiento
previo a un día feriado, el caldo de preenriquecimiento incubado se guarda en
refrigeración hasta por 72 horas.
7.1.3
Después de la incubación por 18 horas a 35°C sembrar el caldo de preenrequecimiento
en los medios líquidos de enriquecimiento distribuidos en cantidades de 10 mL en
tubos de 16x160mm con tapa rosca e identificados con el número y la clave
correspondiente antes de ser inoculados.
7.1.4
Sellar la bolsa con calor. Eliminar para su incineración en bolsas rojas.
7.1.5
Inocular 1 mL en caldo Tetrationato reconstituido al momento de usarse agregando 0,2
por 10 mL de solución de yodo y 0,1 por 10 mL de verde brillante al 1%.
7.1.6
Inocular 0,1 mL en caldo Rappaport Vassiliadis (C.R.V.)
7.2
INCUBACIÓN DE LOS MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
7.2.1
Alimentos con una carga microbiana alta. Incubar el caldo RV 24 ± 2 horas a 42 ±
0,2 °C en baño de agua con agitación. Incubar el caldo TT 24 ± 2 horas a 43° ± 0,2 °C,
en baño de agua con agitación.
7.2.2
Alimentos con una carga microbiana baja. Incubar el medio RV 24 ± 2 horas a 42 ±
0,2 °C en baño de agua con agitación. Incubar el caldo TT 24 ± 2 horas a 35 ± 2°C.
7.3
7.3.1
SIEMBRA EN AGARES SELECTIVOS
Con lápiz azul, marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Tetrationato y con
lápiz negro marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Rappaport.
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7.3.2
Sembrar cada uno de los caldos con los cultivos en: una placa de Agar X.L.D/N
(xilosa-lisina-dexocicolato/novobiocina); una placa de Agar Bismuto Sulfito (plaqueado
el día antes y guardadas en oscuro a la temperatura ambiente) y una placa de Agar
Hektoen.
7.3.3
Cada tubo de caldo de enriquecimiento se debe vortear y con asa de 3 mm (inóculo10
µl) extraer una asada e inocular las placas identificadas con negro y azul según caldo a
sembrar.
7.3.4
Inocular el Agar Hecktoen en forma de estrías y sin flamear el asa, agotar el inóculo en
el agar X.L.D./N; extraer otro inóculo con el asa y sembrar el Agar Bismuto sulfito.
7.3.5
Incubar las placas invertidas con la parte inferior hacia arriba a 35ºC ±.0,5 por 24 horas
y realizar la lectura.
7.3.6
Si las placas de agar Bismuto sulfito no presentan desarrollo o este es escaso incubar
por 24 horas más.
7.3.7
Ordenar según clave y número consecutivo para su lectura.
7.3.8
Anotar resultados en registro RG-712.00-072.
7.4
7.4.1
INTERPRETACIÓN DE LA LECTURA DE AGARES SELECTIVOS
Agar Hektoen (HK.) Colonias azul-verdes a colonias azules con o sin centros negros.
Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros grandes,
brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente negras
Algunos cultivos atípicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centros
negros.
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7.4.2
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato/novobiocina (XLD). Colonias rosadas con o sin
centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros
grandes, brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente
negras. Excepciones: serotipos S. paratyphi A y S. choleraesuis, pueden dar colonias
transparentes sin centro negro; algunos cultivos atípicos de Salmonella producen
colonias amarillas con o sin centros negros.
7.4.3
Agar Bismuto Sulfito (B.S) Colonias marrón, color gris, o colonias negras; a veces
tienen un brillo metálico y el medio circundante es por lo general marrón al principio,
pero puede virar a negro con el tiempo que la incubación aumenta, produciendo el
efecto de halo supuesto.
• Atípicamente algunas veces se producen colonias verdes con oscurecimiento
pequeño o ninguno del medio circundante.
• Si las colonias típicas o sospechosas no se detectan sobre el agar B.S después de
24 ± 2 horas, entonces, no escoja ninguna colonia y reincubar de nuevo por 24 ±
2 horas.
• Si hay colonias típicas presentes sobre el agar después de 24 ± 2 horas de
incubación, entonces escoger 2 o más colonias y reincubar de nuevo el agar por
24 ± 2 horas. repicar 2 colonias o más típicas del agar B.S, solamente si las
colonias escogidas incubadas por 24 ± 2 horas dan reacciones atípicas en hierro
triple de azúcar agar (TSI) y agar lisina (LIA) y que ocasione que el cultivo halla
sido desechado como Salmonella.
7.4.4
7.5
CONTROLES: Salmonella enterica subespecie enterica y control negativo (S
aureus). En BAM on line 2007 se recomienda incorporar cepas control de
Salmonella atípicas como: Salmonella diarizonae ATCC 12325, lactosa positiva y
H2S positiva, Salmonella abortus equi ATCC 9842, lactosa negativa y H2S negativa,
Salmonella diarizonae ATCC 29934 lactosa positiva y H2S negativa. La Sección de
Microbiología de Alimentos del ISP, dispone de Salmonella typhimurium H2S
negativa, Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H2S
positiva, para ser usadas como control atípico.
IDENTIFICACION BIOQUÍMICA
7.5.1
Traspasar 2 a 3 colonias por placa, con un máximo de 5 colonias a cada uno de los
tres medios de cultivo:
7.5.1.1
Agar TSI, semi-inclinados (fondo de unos 3 cm y superficie de 2 cm.),
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7.5.1.2
Agar LIA semi inclinados (fondo de 4 cm de alto debido a que la descarboxilación
de la lisina es estrictamente anaerobio) y
7.5.1.3
Agar MIO
7.5.2
Marcar los tubos identificando la procedencia del caldo de aislamiento (lápiz azul caldo
Tetrationato y lápiz negro caldo Rappaport).
7.5.3
Toque ligeramente el centro de la colonia escogida con la aguja estéril de inocular e
inocule el TSI rayando la inclinación y picando el fondo; sin quemar, inocule el LIA
por picado del fondo dos veces y luego rayando la inclinación. Incubar los tubos con
las tapas sin apretar para mantener condiciones aeróbicas en la incubación y así
prevenir la producción excesiva de H2S. En el caso del TSI, incubar un poco inclinado
para evitar la producción excesiva de gas.
7.5.4
Sembrar en picadura con asa aguja los tubos de agar Movilidad Indol Ornitina (M.I.O)
cuidando no mover la aguja del asa para no romper el agar y poder leer bien la
movilidad.
7.5.5
Guardar las placas de agar selectivo a 5-8 °C.
7.5.6
Incubar TSI, LIA y MIO a 35 °C +/- 1ºC por 24 +/- 2 horas.
7.5.7
Alternativamente se pueden utilizar kit bioquímicos comerciales aprobados por AOAC
como API 20 E, Enterotubo II, Enterobacteriaceae, Micro-ID o Vitek GNI, para
identificación presuntiva. Los kit comerciales no deben ser utilizados como sustituto
de los test serológicos.
7.6
LECTURA. Y BASE DE LAS REACCIONES BIOQUIMICAS
7.6.1
Salmonella típica en agar TSI produce la inclinación alcalina (roja) y el fondo ácido
(amarillo), con o sin la producción de H2S (ennegrecimiento de agar).
7.6.2
En LIA, produce la reacción alcalina (púrpura) en el fondo del tubo. Considere el
amarillo en el fondo de tubo como la reacción ácida (negativa).
7.6.3
No eliminar cultivos en los que se produce la decoloración en el fondo del tubo
únicamente. La mayor parte de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA.
7.6.4
Algunos cultivos que no son Salmonella producen una reacción roja ladrillo en
inclinaciones de LIA (Deaminación de la lisina).
7.6.5
Todos los cultivos que dan el fondo alcalino (azul) en LIA, independientemente de la
reacción de TSI, deberían ser considerados como potencial Salmonella.
7.6.6
Aislar y someter a bioquímica y pruebas de serológicas.
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7.6.7
Las cultivos que dan el fondo ácido en LIA (Amarillo) y una inclinación alcalina
(azul) y el fondo ácido en TSI, también deberían ser consideradas como potencial
Salmonella y debería ser subcultivada.
7.6.8
Pruebas de cultivos positivos en TSI proseguir para determinar si ellos son de la
especie de Salmonella, incluyendo S. Arizonae.
7.6.9
Si los cultivos de TSI no logran dar reacciones típicas para la Salmonella (inclinación
alcalina y fondo ácido) escoger colonias adicionales sospechosas de placas de medio
de cultivos selectivo de supuestas-positivas e inocular TSI y LIA Aplicar pruebas de
identificación bioquímicas y serológicas.
7.6.10
Examinar un mínimo de 6 cultivos de TSI por cada 25 g de la unidad analítica o cada
375 g del compuesto, provenientes de ambos caldos de enriquecimiento.
7.6.11
Si los cultivos en TSI son mixtos, se recomienda reaislar en agar XLD, Hecktoen o
Mac Conkey, en este último las colonias típicas se observan, transparentes incoloras,
con o sin centro negro y pueden presentar un halo de precipitación biliar causado por
otros microorganismos.
7.7
INTERPRETACION DE ACUERDO A LOS CAMBIOS DE LOS TRES MEDIOS DE
CULTIVO UTILIZADOS
7.7.1
AGAR TSI
La lectura empleada universalmente es la siguiente:
K= Cambio debido a alcalinización (rojo)
A= Cambio debido a la producción de ácido
Lectura:
¾ Fermentación de la Glucosa: fondo amarillo y tendido rojo. →Informar K/A
¾ Fermentación de la Lactosa y/o Sacarosa: Tendido Amarillo.→informar A/A ó K
¾ Producción de Gas: Ruptura del agar. Informar la producción de gas de 1 a 3 cruces (+).
¾ Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio que puede ser de intensidad variable.
Informar la presencia de 1 a 3 cruces (+)
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Ejemplo registro de informe de laboratorio: K/A +,+++
N ° del tubo
TSI
Fermentación
de glucosa
Fermentación
Lactosa/o
sacarosa
Producción de
H 2S
Ejemplos
típicos
Tubo 4
7.7.2
1
2
3
4 -4A
5
-
+
+
+
+
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+++
Pseudomonas Morganella
Providencia
Shigella
Citrobacter
Salmonella
Edwarsiella
Proteus
E.coli
Enterobacter
Klebsiella
E. coli H2S
+
Salmonella
lactosa
positiva
Abundante gas evidenciado por ruptura de agar
AGAR LISINA IRON AGAR (L.I.A)
Interpretación de los cambios decarboxilación de la lisina:
Positivo: Fondo color morado (Descarboxilación) el tubo azul. Informar K / K. Se forma
amino cadaverina la cual causa que el indicador de pH púrpura de bromocresol cambie a
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color violeta. Como la decarboxilación solamente ocurre en medio ácido (bajo pH 6) el
cultivo es acidificado por la fermentación de la glucosa.
Negativo: el fondo amarillo. Informar K/ A
Desaminación de la lisina: positivo: el tendido rojo. Informa R/A. La deaminación de la
lisina produce α-ácido ketocarboxílico compuesto que reacciona con la sal de yodo
presente en el medio, bajo la influencia del oxígeno y forma compuestos café rojizo.
Correspondencia por numero
Desaminación de la lisina(rojo
oscuro en tendido)
Decarboxilación de Lisina
Fermentación de glucosa
Ejemplos típicos
1
2
-
3
+
4*
-
-
+
+
+
+
+
Citrobacter Proteus
E.coli.
Salmonella
Providencia Enterobacter Edwarsiella
Morganella
*H2S positivo usualmente positivas en Salmonella y Edwarsiella se muestra en el tubo 4.
El LIA no es un indicador de la producción de H2S como TSI o Kligler
7.7.3
AGAR MIO
Se usa para identificación de Enterobacterias sobre la base de: MOVILIDAD, actividad de
ORNITINA DESCARBOXILASA y la producción de INDOL.
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Movilidad: se demuestra por un enturbamiento del medio o por un crecimiento en que el
cultivo difunde desde la línea de inoculación. Los cultivos no móviles crecen solo a lo
largo de la línea de inoculación.
Ornitina: Los cultivos negativos a Ornitina se mantienen amarillos y a veces en la parte
superior pueden ser púrpura.
Producción de Indol a partir del triptofano se detecta con el aldehído presente en el
reactivo de Kovacs, que se añade después de la lectura de Ornitina y Movilidad.
Numero Correspondiente en
Pares
Deaminación de la ornitina
(alcalino en aerobiosis)
Movilidad
Decarboxilación de ornitina
Producción de indol
Fermentación de la glucosa
Ejemplos típicos
1
2
3
+
+
+
+
+
Klebsiella
oxytoca
+
+
+
Enterobacter
aerogenes
+
+
+
+
Escherichia
coli
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Tabla TLM INTERPRETACIÓN DEL GÉNERO SALMONELLA BASADO EN TRES
MEDIOS DE CULTIVOS: AGA TSI, LIA y MIO. (M.E. Valenzuela, J. Astorga, ISP
1991.
T.S.I GAS H2S
K/A −
+
L.I.A GAS H2S
K/K
− +
+
Mov Indol-
Microorganismo
Ornitina.
+
−
+
−
+
−
+
K/A +
-
K/K
K/A
-
K/K
−
−
+
−
−
+
K/K
K/A
−
+
+
−
+
+
−
−
−
+
-
K/A −
K/A +
-
K/A K/A −
+
A/A, +, +
K/A +
+
K/A
K/A −
K/K, +
K/ K +
+
+
+
+
−
+
+
+
−
−
+
+
K/A
K/A
+
+
−
+
+
+
+
Salmonella subespecie I Otras
Salmonella
Salmonella choleraesuis. Otras
Salmonella
Salmonella thyphi.
Salmonella .typhi
Salmonella sp.
Salmonella.Paratyphi A
Salmonella.Paratyphi A
Salmonella.typhi (excepción)
Salmonella subg.3 (Arizona)
Salmonella sub-especie I y
Salmonella .sub especie III (Arizona)
Salmonella. sp. y Citrobacter
freundíi
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PRUEBAS BIOQUÍMICAS COMPLEMENTARIAS
7.7.5.1 En casos de duda se puede ampliar la batería con las pruebas señaladas en el Anexo N°
2.
7.7.5.2 Si la combinación de los tres medios corresponde al Género Salmonella, inocular 2
tubos de agar base sangre triptosa sin sangre, tendido en estría e incubar 18 hrs. para
realizar estudio serológico.
7.8
SEROLOGÍA
7.8.1
Confirmar con suero polivalente somático y suero polivalente flagelar (Anexo Nº 5)
7.8.2
Enviar para confirmación serológica al "Centro de Referencia de Enterobacterias del
I.S.P.”
7.9
INFORME DE RESULTADOS
7.9.1
En caso de no detectar Salmonella se informa “Negativo en 25 o 50 g”.
7.9.2
En caso de detección de Salmonella, informar el Género y grupo somático o Serotipo
y/o por el biotipo, sí la cepa autoaglutina.
8.
REGISTROS
Identificación
Almacenamiento Protección Recuperación
del registro
RG-712.00-072
Archivador “Registro Libre
Papel
Registro de resultados de lectura e informe acceso
análisis de Coliformes, de
resultados”. personal de
E. coli y Salmonella en Laboratorio 348
Microbiolog
muestras de alimentos
ía
de
Alimentos
RG-712.00-050
Archivador registro Libre
Papel
Registro control de cepas
control acceso
ambiente Laboratorio incubadoras
personal de
Enterobacterias
laboratorio 348
Microbiolog
ía
de
Alimentos
Tiempo retención
y disposición
Almacenar por 5
años
y
luego
eliminar en la
basura picado en
trozos
Almacenar por 5
años
y
luego
eliminar en la
basura picado en
trozos
PROCEDIMIENTO DETECCIÓN DE
SALMONELLA EN ALIMENTOS POR
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9.
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TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº
5
5
5
Pág.
Modificada
1
3
3
5
5
3
3
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5
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4
5
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7
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5
5
5
8
9
9
9
9
9
9
10
14
Motivo del cambio
Cambio formato actual
Se agrega d)
Se elimina la palabra REFERENCIA por
estar repetida
Se actualiza referencia AOAC
Se incluye baños termoregulados a 42 y 43
ºC.
Se cambia agar base Urea por Caldo Urea
Se elimina letra “y” entre 6.4.2.2 y 6.4.2.3
Se agrega recomendación
Se elimina 6.4.3.5
Se agrega 6.4.4.3
Se corrige indicaciones de incubación de
agares selectivos.
Se corrige Nº de registro.
Se escribe Salmonella en cursiva
Se incluye recomendación de uso de cepas
atípicas.
Se cambia redacción en 7.5.1, 7.5.2, 7.5.3,
7.5.4 y 7.5.5, quedando como 7.5.1,
alterándose la numeración siguiente
Se corrige condiciones de tendido de agar
TSI
Se cambia H2S por H2S
En 7.5.7 se agrega recomendación
Se corrige tiempo de incubación.
Se cambia H2S por H2S
Se escribe Salmonella en cursiva
En 7.6.10, se agrega frase.
Se agrega 7.6.11
Se cambia H2S por H2S
Se elimina item 9.0
Fecha Aprobación
30-03-2009
30-03-2009
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Revisión Nº
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5
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5
5
5
5
17
17
17
17
17
17
17, 18 y 19
5
5
18 y 19
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5
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21
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Motivo del cambio
Fecha Aprobación
Em 7.8.1 se agrega “Ver anexo 5”
Se cambia indicación del medio a usar.
Corrige tiempo de incubación en el
esquema.
Se cambia agar por caldo.
Se agrega temperatura de incubación.
Se agrega una observación
Se agrega una opción para el test de urea.
Se cambia redacción
Se escribe Salmonella en cursiva
Se corrige anexo 2 dando a las pruebas el
orden establecido por el BAM. En el punto
b) Rojo fenol, c) pruebas derivadas de caldo
triptona en VP, rojo metilo y citrato se
hacen algunas correcciones de contenido y
de redacción.
Se escribe Salmonella en cursiva
Se hacen correcciones en los puntos 2, 3 y 5
de la letra a)
Se escribe Salmonella en cursiva
Se eliminan tabla 1, esta repetida la
información en la tabla 1 del BAM On line
Se agrega referencia a la tabla
Se agrega referencia a la tabla
Se realiza corrección en punto 2 y cambio
de redacción en puntos 3 y 5.
Se agrega una instrucción después del
primer párrafo.
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ANEXOS
Anexo Nº 1 Esquema de trabajo
Anexo Nº 2 Pruebas complementarias para la identificación de Salmonella
Anexo Nº 3 Tabla 1 BAM On line Diciembre 2007 reacciones bioquímicas y serológicas de
Salmonella y Tabla 2 BAM On line Criterios parta descartar las cepas que no sean Salmonella.
Anexo N° 4 Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies.
Anexo N° 5 Serología de Salmonella (BAM online 2007)
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ANEXO Nº 1
Pesar y agregar caldo prenriquecimiento (25 g +225 mL (o 50g + 450 mL )
↓
Homogeneizar ±2 minutos. Dejar reposar 60 ± 5 min. Tomar PH y ajustar.
Incubar la bolsa a 35°C por 18-24 horas.
↓
Inocular
1 mL
Caldo Tetrationato Verde brillante
Incubar18-20 hrs a 42ºC± 1ºC
↓
(Marcar Las Placas Con Azul)
↓
Incubar 24 a 48 horas a 35 ºC.
0,1 mL
Caldo Rappaport modificado
Incubar 24-48 hrs. a 42-± 1C
↓
( Marcar Las Placas Con Negro.)
↓
↓
Incubar por 24 horas a 35 ºC
↓
Lectura de placas
↓
Inocular colonias sospechosas en agar T.S.I., L.I.A y M.I.O
↓
Incubar 24 h a 35ºC
↓
Lectura tubos Pruebas diferenciales
↓
Confirmación serológica
↓
Informe de resultado
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ANEXO N°2
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA LA IDENTIFICACION DE SALMONELLA
(CULTIVOS PUROS)
PRUEBA DE UREASA (CONVENCIONAL).
Con la aguja estéril, inocule el crecimiento de cada cultivo de la inclinación de TSI positiva
en los tubos de caldo urea.
Si los tubos inoculados de agar urea viran a púrpuras
(la prueba es positiva); incluir tubos no inoculados
de este agar como control, a veces este medio vira a
púrpura sin ser inoculado. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.
Opcionalmente se puede realizar el test de Caldo Urea
Rápido, se siembra 2 asadas de cultivo, con asa de 3
mm y se incuba 2 horas en baño de agua a 37ºC +/- 0,4 ºC.
Deseche todos los cultivos que dan la prueba positiva.
Conserve para el estudio posterior todos los cultivos que dan la prueba negativa (ningún
cambio en color en el medio).
Los cultivos puros que resulten urea negativos pueden ser sometidos a las siguientes pruebas:
a) Caldo lisina descarboxilasa: Si los resultados en LIA fueron satisfactorios no necesita
ser repetido, si por el contrario los resultados en LIA han sido dudosos, inocular el caldo
Lisina con cultivo proveniente de TSI e incube por 48 +/- 2 horas a 35ºC, pero examinar a las
24 horas. La especie de Salmonella causa la reacción alcalina indicada por el color púrpura
en todas partes del medio. La prueba negativa es indicada por el color amarillo en todas partes
del medio. Si el medio no aparece decolorado (ni púrpura ni amarillo) añadir unas gotas de
púrpura bromocresol 0.2 % y releer las reacciones del tubo.
b) Caldo rojo fenol dulcitol al 0.5 %. Inocular el caldo con cultivo de TSI. Incubar 48 ±
2 h en 35°C, examinar después de 24 h. La mayor parte de especies de Salmonella da la
prueba positiva, indicada por la formación de gas en el interior del tubo de fermentación y pH
ácido (amarillo) del medio. La producción de ácido puede interpretarse como reacción
positiva. El test negativo esta indicado por ninguna formación de gas en el interior del tubo
de fermentación, y no hay variación en el color rojo (con el fenol rojo como indicador) o
púrpura (con bromocresol púrpura como el indicador).
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c) Caldo Triptona (o triptofano). Inocule el caldo con inoculo proveniente del agar TSI.
Incube 24 ± 2 h en 35°C.
•
•
•
Prueba de Indol: Transfiera 5 mL de cultivo a un tubo de ensayo limpio y estéril.
Añada 0.2-0.3 mL el reactivo de Kovacs. Los cultivos de Salmonella dan la prueba
negativa (la carencia de color profundo rojo en la superficie de caldo). Registre los
tonos intermedios de naranja y rosado como +/-.
Caldo Malonato. Transfiera una asada de 3 mm del cultivo proveniente de caldo
triptona a caldo malonato. Incluir un tubo no inoculado como control debido a que
ocasionalmente los tubos no inoculados de caldo malonato viran azules (prueba
positiva). Incube 48 ± 2 h en 35°C, examinar a las 24 h. La mayor parte de los cultivos
de especie de Salmonella dan la prueba negativa (verde o inalterado).
Caldo Cianuro de Potasio (KCN). Transfiera una asada de 3 mm del cultivo
proveniente de caldo triptona a caldo KCN. Incube 48 ± 2 h en 35°C, examinar a las
24 h. Interprete el crecimiento (indicado por la turbiedad) como positivo. La mayor
parte especie de Salmonella no crece en este medio, indicado por la carencia de
turbiedad.
Si hasta ahora no se ha realizado las pruebas serológicas, estas deben ser realizadas en este
punto. (Ver anexo 5)
Pruebas complementarias en caso de reacciones no típicas de Salmonella.
Realice las siguientes pruebas adicionales sobre cultivos que no dan reacciones típicas de
Salmonella para pruebas descritas en la Tabla 1 (ver anexo 3) y que por consiguiente no
clasifica como Salmonella.
a) Caldo de Lactosa Rojo Fenol o Caldo de lactosa púrpura bromo cresol: Del TSI,
inocular el caldo con una pequeña cantidad de cultivo. Incubar 48 ± 2 h en 35°C, examinar
después de 24 h.
Positivo - producción ácida (amarillo) y producción de gas en tubo de fermentación interior.
Considerar la sola producción de ácido como reacción positiva. La mayor parte de cultivos de
Salmonella dan resultado negativo de prueba, indicado por ninguna formación de gas en el
interior del tubo de fermentación y rojo (cuando el rojo fenol es el indicador) o púrpura (con
púrpura bromocresol como indicador) en todas partes del medio.
b) Caldo Rojo Fenol o púrpura bromo cresol sacarosa: Descartar como no Salmonella,
los cultivos que dan pruebas de sacarosa positivas, excepto aquellos que dan ácido en la
inclinación del TSI y reacciones positivas en el LIA
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c)
Caldo MR-VP. Inocular el medio con la pequeña cantidad de crecimiento de cada
inclinación de TSI clasificada sospechosa de Salmonella. Incube 48 ± 2 h en 35°C.
•
Vogues-Proskauer (VP) Realizar a temperatura ambiente de la siguiente manera:
Transfiera 1 mL de 48 h de cultivo un tubo de ensayo limpio e incube el resto del
caldo un tiempo adicional de 48 h en 35°C.
Agregar 0,6 mL alfa-naftol y agitar bien. Agregue 0,2 mL de solución KOH al 40 %
y agitar bien. Para intensificar y apresurar la reacción, agregue unos cristales de
creatina.
Resultados leídos después de 4 h; el desarrollo de color rosado- rojo en todas partes
del medio es la prueba positiva. La mayor parte cultivos de Salmonella son VP
Negativas, indicadas por la ausencia de desarrollo de color rosado-rojo en todas partes
del caldo.
•
Rojo metilo: A 5 mL de cultivo de 96 horas del caldo VP, agregue 5-6 gotas del
indicador rojo metilo. La mayor parte cultivos de Salmonella da la prueba positiva,
indicada por el color rojo difuso en el medio. Un color distinto, como el amarillo es la
prueba negativa. Descartar, como Salmonella, los cultivos que no dan positivo:
d) Agar Citrato Simmon's: Inocular este agar usando aguja de inoculación con cultivo
proveniente de agar TSI no clasificado. Inocular rayando la inclinación y picando el extremo.
Incubar 96 ± 2 h en 35°C. Lectura: Positivo - presencia de crecimiento, por lo general
acompañado por cambio en color de verde a azul. La mayor parte cultivos de Salmonella son
citrato - positivas. Negativo - ningún crecimiento o muy poco crecimiento y ningún cambio en
color.
Descartar por no pertenecer a Salmonella, los cultivos que dan pruebas de lactosa positivas,
excepto los cultivos que presentan inclinaciones ácidas TSI y reacciones positivas en LIA, o
los cultivos que dan reacciones positivas al caldo malonato. Realice posteriormente más
pruebas sobre estos cultivos para determinar si ellos son S. arizonae.
Clasificar como Salmonella a los cultivos que tienen el modelo de reacción de la Tabla1 (ver
anexo 3). Descartar, como no perteneciente a Salmonella, los cultivos que den cualquiera de
los resultados presentados en la Tabla 2 (ver anexo 3). Cultivos que no han sido claramente
clasificados, pueden ser sometidos a pruebas adicionales de clasificación de enterobacterias
de Edwards y de Ewing.
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ANEXO Nº 3
Tabla 1. Reacciones bioquímicas y serológicas Salmonella BAM on line Diciembre
2007
Test o substrato
Resultado
Salmonella
especies
Positivo
Negativo
reacción(a)
1. Glucosa (TSI)
Fondo amarillo
Fondo rojo
+
2. Lisina decarboxilasa
Fondo púrpura
Fondo amarillo
+
(LIA)
3. H2S (TSI y LIA)
ennegrecimiento
Sin ennegrecimiento
+
4. Ureasa
Color rojo púrpura Sin cambio de color
5. Caldo Lisina
Color púrpura
Color amarillo
+
decarboxilasa
6. Caldo Rojo fenol
Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio
+(b)
dulcitol
gas
de color
7. KCN caldo
desarrollo
Sin desarrollo
(c)
8 Caldo. Malonato
Color azul
Sin cambio de color
9. Indol test
Color rojo en
Color amarillo en
superficie
superficie
10. test Polivalente
aglutinación
Sin aglutinación
+
flagelar
11 test. Polivalente
aglutinación
Sin aglutinación
+
somático
12. Caldo lactosa rojo
Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio
-(c)
fenol
gas
de color
13. Caldo sacarosa rojo
Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio
fenol
gas
de color
14. Test VogesColor Rosado a rojo Sin cambio de color
Proskauer
15. Rojo metilo test
Color rojo difuso
Color amarillo difuso
+
16. Citrato Simmons
Crecimiento ; Color No crece ; no cambia
v
azul
de color
a
+, 90% mas positivo en 1 o 2 días; -, 90% o mas negativo en 1 o 2 días; v, variable.
b
Mayoría de cultivos de S. arizonae son negativos
c
Mayoría de cultivos de S. arizonae son positivos.
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Table 2. Criterios para descartar las cepas que no son Salmonella BAM online
Diciembre 2007
Test o substrato
Resultados
1. Ureasa
positivo (color púrpura )
2. Test Indol
positivo (color rojo en superficie)
y
Polyvalente flagelar (H) test;
negativo (no aglutina)
O Test Indol
positivo (rojo en superficie)
y
Spicer-Edwards flagelar test
negativo (no aglutina)
3. Lisina decarboxilasa y caldo KCN
4. Caldo lactosa Rojo fenol
negativo (amarillo)
positivo (crecimiento)
positivo(amarillo y/o gas)(a), (b)
5. Caldo sacarosa Rojo fenol
positivo(amarillo y/o gas)(b)
positivo (crecimiento))
6. Caldo KCN
positivo (rosado a rojo)
test Voges-Proskauer,
negativo (color amarillo difuso)
y test Rojo metilo
Caldo de cultivo malonato positivo es necesario determinar si no es S. arizonae.
b
No descartar los caldos de cultivo positivos, si los cultivos correspondientes a LIA y
que dan reacciones típicas de Salmonella; realizar test adicionales para determinar si
hay Salmonella especies.
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ANEXO N° 4
Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies*
SALMONELLA ENTÉRICA
S.
BONGORI
SUBESPECIE
entérica
salamae arizonae diarizonae houtenae indica
Dulcitol
+
+
d
+
ONPG(2h)
+
+
d
+
Malonato
+
+
+
Gelatinasa
+
+
+
+
+
Sorbitol
+
+
+
+
+
+
Cultivo en
+
+
KCN
L(+)-tartrato(a) +
Galaturonate
+
+
+
+
+
(*)
+
+
+
+
+
+
Yglutamyltrans
ferasa
Bd
d
+
d
glucoronidasa
Mucato
+
+
+
- (70%)
+
+
Salicina
+
Lactosa
- (75%) + (75%)
d
Lisis por fago +
+
+
+
d
O1
Habitat usual Animales de
Animales de sangre fría y ambientales
sangre caliente
(a)
d-tartrato (*) Typhimurium d, Dublin + 90% o más reacciones positivas
- 90% o más negativas
d Diferentes reacciones dadas por distintas serovariedades
*Formules antigeniques des serovars de salmonella 1997 Michel Popoff et L .LeMinor pag 12
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ANEXO Nº 5
SEROLOGIA DE Salmonella (BAM online 2007)
Antígeno Somático. (O)
a) Prueba (O) polivalente somática.
1) Usar lápiz de cera, separar 2 secciones aproximadamente de 1 x 2 cm cada una sobre el
interior lamina o placa Petri (15 x 100 milímetro). Hay diapositivas en el comercio que
pueden ser usadas.
2) Emulsionar 3 milímetros de cultivo de 24-48 h de la inclinación de TSI, o preferentemente,
de agar base triptosa sangre sin sangre diluida en 2 mL de solución salina al 0.85 %.
3) Colocar 1 gota de suspensión del cultivo en la parte superior de cada sección rectangular
marcada con barra de lápiz y una gota de solución salina en la parte inferior de una sección, 1
gota de antisuero Salmonella polivalente somático (O) en otra sección aislada.
4) Con mondadientes o asa limpia y estéril, mezclar la suspensión de cultivo con la solución
salina en una sección y repetir para la otra sección que contiene el antisuero.
5) Mezclar en vaivén de atrás y adelante durante 1 minuto y observar contra el fondo oscuro
con buena iluminación. Considerar cualquier grado de aglutinación una reacción positiva.
6) Clasificar resultados de la prueba con polivalentes somáticos:
Positivo: aglutinación en mezcla de prueba; ninguna aglutinación en control de salina.
Negativo: ninguna aglutinación en mezcla de prueba; ninguna aglutinación en control de salina.
No específico: aglutinación en prueba y en mezclas de control.
b) Pruebas de grupo somáticas (O).
Ensayar usando grupos individuales de antisueros somáticos(O) con inclusión de antígeno Vi,
si esta disponible, en lugar de Salmonella antisuero polivalente somático (O). Para el tratamiento
especial de cultivos que dan la reacción de aglutinación positiva Vi, refiérase al seg.. 967.28B
en los Métodos Oficiales de Análisis (FDA). Los cultivos que dan la aglutinación positiva con el
antisuero individual somático (O) se registra como positivo para aquel grupo. Las cultivos que
no reaccionan con el antisuero individual somático (O) se registran negativo para aquel grupo.
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Los cultivos que contienen antígenos de Salmonella demostrables como el test flagelar (H)
positivo, pero que no tienen las características bioquímicas de Salmonella deberían ser
purificadas y probadas de nuevo.
Antígeno flagelar polivalente (H).
Inocule el crecimiento de cada TSI ureasa negativo en Caldo BHI e incubar 4-6 h en 35°C
antes de que el crecimiento visible ocurra (para probar el mismo día); o en Caldo tripticasa e
incubar 24 ± 2 h a 35°C.
Agregar 2,5 mL de de solución salina fisiológica formalizada a cada uno de los caldos
incubados.
a. Seleccionar 2 cultivos de caldo formalizado y realizar prueba con antisuero Salmonella
flagelar polivalente (H). Si la aglutinación se va ha realizar al día siguiente, se puede guardar
el cultivo formalizado en refrigeración.
b. Colocar 0.5 mL de la Salmonella diluida en forma apropiada con antisuero flagelar
polivalente (H) en tubos de ensayo serológicos de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm.
c. Agregar 0.5 mL del antígeno para ser probado.
d. Control: Preparar con solución salina mezclando 0.5 mL
formalinizada con 0.5 mL antígeno formalinizado.
solución de salina fisiológica
Incubar las mezclas en el baño de agua termorregulado a 48-50°C. Observe en intervalos de 15
minutos y lea el final.
Lectura:
Positivo - aglutinación en mezcla de prueba y ninguna aglutinación en control.
Negativo - ninguna aglutinación en mezcla de prueba y ninguna aglutinación en control.
No específico - aglutinación en mezcla de prueba y en control. Ensayar los cultivos que dan a
tales resultados con antisueros Spicer-Edwards.
1. Prueba serológica de Spicer-Edwards Use esta prueba como una alternativa a la prueba de
flagelar polivalente (H). Esto también puede ser usado con cultivos que presentan la
aglutinación no específica flagelar polivalente (H). Realice la prueba de Spicer – Edwards de
la misma forma que con antisuero flagelar (H).
2. Realice pruebas bioquímicas adicionales sobre cultivos que dan resultados de prueba de
flagelar positivos.
Si ambos cultivos formalinizados de caldo son negativos, realizar pruebas serológicas sobre los
4 cultivos de caldo adicionales.