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Tecnología del ADN recombinante
A tres décadas de la primera planta
transgénica
Definir plásmido
 Definir DNA recombinante
 ¿Qué es un transgénico?
 Definir vectores
 Definir células recombinantes
 ¿Qué es la biolística y la electroporación?
 Explicar la formación de una planta transgénica
 ¿Para qué se utiliza la biotecnología? (Ingeniería
genética)


ADN recombinante: es una molécula que
proviene de la unión artificial de dos
fragmentos de ADN (a menudo de especies
diferentes) que se combinan in vitro en la
misma molécula de DNA.
ADN Recombinante

La tecnología de ADN recombinante es
el conjunto de técnicas que permite aislar
un gen de un organismo para su posterior
manipulación e inserción en otro
diferente. De ese modo podemos hacer
que un organismo (animal, vegetal,
bacteria, hongo) o un virus produzcan una
proteína que le sea totalmente extraña.
¿Cómo lo logramos?
Necesitamos:
Reconocer el gen adecuado que
queremos copiar
 Cortar y pegar el fragmento de ADN
 Usar un medio de transporte para ese
nuevo fragmento de ADN
 Insertar en el nuevo organismo
 Clonación
 Estudiar el éxito del procedimiento

¿Cómo encontrar el gen adecuado?
IMANES BIOLÓGICOS: Sondas
Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena
complementarias a la región de ADN o ARN que queremos
encontrar. Además contiene una “marca” que permite revelar su
unión a la secuencia elegida.
Son coloreadas durante su síntesis con
nucleótidos marcados con isótopos
radioactivos, con fluorescencia, con un
marcador químico que puede ser detectado
por un Ac o por una enzima cuya actividad
produce el cambio de color de un sustrato.
¿Cómo cortar y pegar el fragmento
de ADN?
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Video:
http://www.mhhe.com/sem/Spanish_Animations/sp_restrictn_endonucleases.swf
Enzimas de restricción
Son endonucleasas específicas capaces de
reconocer secuencias palindrómicas de
DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del
material genético en un punto específico.
 Palindrómicas quiere decir que leen en
direcciones opuestas el mismo orden de
nucleótidos.
5’ G T T A A C 3’
3’ C A A T T G 5’

Enzimas de restricción
Son suceptibles a cambios de temperatura,
pH, etc.
 Estas enzimas se obtienen de células
bacterianas.
 El nombre de estas está dado según el
género y la especie de la bacteria de dónde
se aisló por primera vez esta enzima.

Enzimas de restricción


La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos
indican la especie, la cuarta letra indica la cepa y el número al final
indica el número de enzima que se ha aislado de esa cepa.
Por ejemplo:
EcoRI
Escherichia
(género)

Primera enzima aislada
de ese organismo.
coli
(especie)
cepa R
Otros ejemplos:
◦ BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens
◦ SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens
◦ HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de Haemophilus influenzae
Tipos de corte

“Blunt” o abruptos
◦ Ejemplo
 SmaI

“Sticky”/ pegajosos/
cohesivos – es más fácil
para volver a ligarse los
extremos.
◦ Ejemplos
 EcoRI
 Bam HI
 HindIII
Enzimas de restricción



Las endonucleasas son de gran importancia
para la ingeniería genética, ya que permiten
desarrollar técnicas de clonación.
Permite realizar mapas de restricción y
determinar si existe homología entre otras
moléculas de DNA.
Son extraídas de bacterias, donde actuan
como mecanismo de defensa para degradar
material genético extraño que entre en la
célula.



Enzimas que cortan moléculas de DNA en
una cantidad limitada de ubicaciones
específicas.
Son específicas y reconocen una secuencia
de DNA corta determinada (sitio de
restricción), para cortar ambas cadenas de
DNA en puntos específicos de este sitio.
El DNA de una célula bacteriana se protege
de las propias enzimas de restricción
agregando –CH3 a las adeninas o citosinas
dentro de las secuencias reconocidas por las
enzimas (Mecanismo de metilación)
Sitios de restricción simétricos (5´ 3´)
 Reconocen secuencias que contienen que
contienen entre cuatro y ocho nucleótidos
(pb)
 Produce muchos cortes produciendo un
conjunto de fragmentos de restricción
 La mayoría dividen los esqueletos de azúcar y
fosfato en ambas cadenas de DNA de forma
escalonada.


Los fragmentos resultantes tienen un extremo
monocatenario (extremo cohesivo o
pegajoso/romos), los cuales pueden unirse con los
extremos cohesivos complementarios en otras
moléculas de DNA de forma temporal a través de
uniones pte. de hidrógeno

Las asociaciones son permanentes a través de una
ligasa que cataliza la formación de enlaces covalentes
que cierran los esqueletos de azúcar-fosfato
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:

1.
Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b.
Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I
cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río
abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que
reconocen.
c.
Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el
lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

2.
a.
b.
c.
d.
Tipo II:
Sólo tienen actividad de restricción.
Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que
reconocen.
Sólo requieren Mg++ como cofactor.
No necesitan ATP.
Endonucleasas
Usos de las enzimas de restricción

Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones
que son de gran importancia en investigaciones en biología
molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología
moderna:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o
bacteriófago. El ADN se corta con varias enzimas de
restricción, solas y en parejas, para determinar el número
de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molécula,
el orden y la distancia entre ellos.
2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los
fragmentos obtenidos después de la actuación de las
distintas enzimas de restricción, se pueden separar por
tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar
los distintos fragmentos. Por ejemplo: para la técnica de
Southern blotting o en las usadas para identificar
polimorfismos de ADN en distintos individuos.
3. Generación de fragmentos para ser clonados en los
vectores apropiados, y crear ADN recombinante. Se puede
cortar una molécula de ADN con una enzima y con el
mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de
interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas
de ADN, generando así una molécula de ADN
recombinante. Este vector recombinante puede usarse para
transformar células que expresen el gen de interés clonado
(si se usó un vector de expresión con el promotor
adecuado) o puede usarse simplemente para tener clonado
(“guardado”) ese fragmento de ADN de interés. Por
ejemplo: para los proyectos de secuenciación de genomas.
4. Generación de fragmentos para ser usados como sondas
marcadas en “Southern” y “Northern” blotting.
¿Cómo introducir ADN
recombinante en el nuevo organismo?
MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA
INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBIANTE
Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados
son los siguientes:
Transformación
Microinyección
Lipofección
Electroporación
Transfección
Microproyección
o biobalística
Microinyección: método físico activo en el que se
introduce el ADN recombinante en el interior
celular con una micropipeta. Este método es
utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse
que se ha introducido el ADN. Debido a la
laboriosidad del proceso, sólo es utilizado sobre
ovocitos o cigotos. Por contra, puede prescindirse
del vector e introducir directamente el ADN
seleccionado.
Lipofección: El ADN recombinante se introduce en
liposomas, que son pequeñas vesículas
fosfolipídicas. Estos liposomas se unen con la
membrana celular y el ADN contenido en su
interior se introduce en la célula.
Electroporación: método físico activo
en el que una solución con células y
ADN recombinante es sometida a
descargas eléctricas de alto voltaje.
Esto altera la permeabilidad de la
membrana, permitiendo la entrada del
ADN recombinante.
Transfección: método físico activo de
gran eficacia, donde el vector es un
virus. El virus introduce el ADN
recombinante mediante el mecanismo
normal de infección viral.
Microproyección o biobalística: método físico
activo en el que se utiliza una micropistola que
dispara microbalas de acero en las que va
impregnado el ADN. Se utiliza sobre suspensiones
celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre
órganos como piel, hojas, etc.
Transformación: es un tratamiento físico-químico para
bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de
la membrana. En ese momento se dice que la célula
es competente, ya que pueden penetrar los ADN
recombinantes en el interior celular. Las células se hacen
competentes cuando en un cultivo celular a 0ºC, con
presencia de Ca++, se produce un brusco cambio de
temperatura, llegando a 37º-43ºC. Requiere un vector.
¿Qué es un vector?
Son plásmidos, virus, fagos (virus que infectan exclusivamente a las bacterias),
cósmidos (vectores de clonación, que han sido ampliamente usados en la
elaboración de genotecas de DNA genómicos de gran tamaño) capaces de
mover genes de un organismo a otro y son capaces de ingresar a una
célula y replicarse dentro de ella.
TIPOS
Naturales
• Plásmidos
• Bacteriófagos
Artificiales
• Cósmidos
• YACs
• MACs
Tipos de vectores
Plásmidos
Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y
aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de
ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de
manera natural y que se replican autónomamente dentro de las
células bacterianas.
Generalmente son derivados del pBR322.
- Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN
relativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases).
- Tiene un origen de replicación (ORI) y puede producir hasta 500
copias de los fragmentos de ADN insertado por célula.
- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de
reconocimiento para enzimas de restricción que se han agrupado en
una región denominada polylinker.
- Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya
que contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce
colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en
el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color blanco.
Tipos de vectores
Bacteriófago lambda
Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN
foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar cápsides.
Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de
restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los
unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las
cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de las bacterias,
los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento
de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20
kb (20000 nucleótidos)
Cósmidos
Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos.
Tienen una sección del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de
su cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes
de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.
YACs
Los YACs son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un
origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de
selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno.
Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.
MACs
Cromosomas Artificiales de Mamíferos.
Tipos de vectores
En resumen
Plásmido: Molécula de ADN circular que se replica
de manera autónoma dentro de una bacteria.
Fago: Molécula de ADN lineal cuyas secciones
pueden remplazarse con ADN extraño sin
interrumpir su ciclo de vida.
Cósmido: Molécula de ADN circular extracromosómico que combina características de
plásmidos y fagos.
YACs: Cromosomas Artificiales de Levadura.
MACs: Cromosomas Artificiales de Mamíferos.
Partes necesarias de un vector
Orígen de Replicación (ORI): Es la región que codifica para el inicio de
la síntesis de DNA, el cual le da la cualidad de poder replicarse de
manera independiente al DNA cromosómico, ya sea en un sistema
bacteriano o en un sistema de expresión en levaduras.
Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector,
los cuales le confieren características adicionales al sistema de clonación
(bacterias, levaduras, etc.), que permiten la identificación y selección de
las clonas recombinantes, es decir, clones que contienen el fragmento de
DNA de interés. Ejemplos de esto son los genes que codifican para la
resistencia a antibióticos, como lo son los de resistencia a la ampicilina o
a la tetraciclina, o por el contrario, pueden ser marcadores metabólicos
como el gen Lac Z, que codifica para la síntesis de la enzima beta
galactosidasa.
Polilinker o Sitio de Multiclonación: Múltiples sitios de
reconocimiento para las enzimas de restricción, que permiten la inserción
de los fragmentos de DNA que se desea clonar en un sistema.
Plásmido
1- Los plásmidos son moléculas de
DNA extracromosómico,
covalentemente cerrados y
generalmente de tamaño pequeño.
2- Se encuentran en muchas especies
bacterianas.
3- Son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una
secuencia de iniciación (ORI). Esto le permite replicarse de
manera independiente del ADN genómico.
4- Pueden contener genes que contribuyen a la
superviviencia en condiciones especiales.
Plásmido
Así, los plásmidos se utilizan como vectores de fragmentos de
ADN. Para esto, se combina el fragmento de ADN con el
plásmido, generando un nuevo plásmido con dicho gen en su
secuencia.
¿Cómo?
Plásmido

Para esto, se debe utilizar
sobre el plásmido, la
misma enzima de
restricción, que rinda los
mismos extremos del
fragmento de ADN
previamente seccionado.Y
por medio de una ligasa,
permita la unión entre en
fragmento de ADN y el
plásmido utilizado.
¿Cómo decido qué enzima de restricción
debo utilizar sobre el plásmido?
Cada plásmido utilizado, posee una secuencia específica de nucleótidos.
En base a dicha secuencia, se reconoce qué enzima de restricción se pueden
utilizar y en qué sector de plásmido van a realizar el corte. Teniendo en cuenta
que debe corresponderse al fragmento de ADN seleccionado.
Ejemplo: Plásmido pBR322


Fue el primer plásmido artificial y es uno de los
vectores más comúnmente usados en E. coli
Contiene 4361 pb y su principal característica es que
contiene dos genes de restricción a antibióticos:
Ampicilina y Tetraciclina.
Plásmido pBR322
Secuencia de bases
Plásmido pBR322
Mapa de restricción
Plásmido pBR322
En conjunto de su secuencia de
bases y su mapa de restricción,
puedo diseñar el siguiente diagrama:
Referencias:
•
ApR: Gen de resistencia a la Ampicilina
•
TcR: Gen de resistencia a la Tetraciclina.
•
EcoRI: Zona de corte de la enzima de restricción EcoRI
•
BamHI: Zona de corte de la enzima de restricción BamHI
•
PstI: Zona de corte de la enzima de restricción PstI
•
ColE1 origin: ORI del plásmido.
Plásmido
Una vez seleccionado el plásmido y la
secuencia recombinante, debo elegir la enzima
de restricción a utilizar.
Prestando especial atención a:
 Cortes en ADN recombinante, así como en
plásmido.
 Prestar atención a las zonas del plásmido
que quiero mantener o eliminar.
Origen de replicación
Genes plasmídicos
Clonación
Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la
maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante
en una célula anfitriona.
Los tipos de células anfitrionas son:
Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta
velocidad de replicación, un bajo costo de mantenimiento de las
colonias y son fácilmente manipulables.
Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general,
difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales:
Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la
investigación de la expresión y la regulación génica y la
síntesis de proteínas eucariotas.
Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación,
ya que la velocidad de replicación es muy alta y se
mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son
muy estables.
Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la
entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana
celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes
moléculas.
Resumiendo
http://www.bionova.org.es/animbio/anim/IngGen2web.swf
Proceso mediante el cual se
obtiene la insulina
Ingeniería genética (otros usos)
USOS Y APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA
Entre los usos y aplicaciones podemos nombrar:
- Mejorar las vacunas contra las enfermedades de los animales.
- Productos humanos puros, como la insulina y la hormona del crecimiento humano en
cantidades comerciales.
- Antibióticos existentes por métodos más económicos.
- Nuevos tipos de antibióticos.
- Plantas con resistencia a algunos pesticidas, insectos y enfermedades.
- Plantas con cualidades nutricionales mejoradas.
En un humano, se pueden resaltar los siguientes usos:
- Para reparar un defecto genético.
- Para incrementar un proceso natural del organismo (como la tasa de crecimiento).
- Para crear resistencia a las enfermedades o al daño externo.
- Para evitar que el organismo haga algo que no haría normalmente.
- Para obtener microorganismos que producen la insulina de los humanos para los
diabéticos.
- Han aumentado las expectativas de los científicos en eliminar enfermedades como el
cáncer, y aumentar la longevidad eliminando las desventajas del crecimiento.
- La clonación y el genoma humano