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Ingeniería Genética INGENIERIA GENÉTICA Conjunto de técnicas nacidas de la Biología molecular que permiten manipular el genoma de un ser vivo y su transferencia a otro organismo, posibilitando la creación de nuevas especies, la corrección de defectos genéticos y la fabricación de numerosos compuestos. Aislamiento y manipulación de fragmentos de ADN de un organismo para introducirlo en otro (ADN recombinante) Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restricción y su aplicación en Genética Molecular) Enzimas de Restricción En 1953 se descubre el fenómeno de restricción: Ciertos virus bacteriófagos no son capaces de infectar determinadas cepas de bacterias En los años 60 se descubren las enzimas responsables de ese fenómeno: se denominan enzimas de restricción Premio Novel de Medicina en 1978 Smith Nathans Arber Son endonucleasas que cortan el ADN del fago impidiendo la infección En 1970 se aíslan las primeras enzimas de restricción capaces de cortar el ADN en sitios específicos Las enzimas de restricción se pueden comparar con tijeras moleculares TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE El ADN recombinante se obtiene cuando un fragmento de ADN específico de un individuo se inserta en el ADN de otro. El ADN recombinante es la base de los transgénicos y de la clonación molecular Clonación molecular de un fragmento de ADN: es la obtención de millones de copias de dicho fragmento (reproducción asexual). En la clonación molecular se utilizan generalmente plásmidos recombinantes que se incuban con un cultivo de bacterias ( por ejemplo E. coli). En estas condiciones, algunas de las bacterias se transforman al incorporar un plásmido recombinante. Después se seleccionan las bacterias con el gen incorporado (por ejemplo con el que da lugar a insulina humana) y se mantienen en condiciones de crecimiento para que se reproduzcan y originen millones de moléculas de ADN recombinante (Clon de ADN). Los clones producen la molécula deseada a gran escala. Se denomina Genoteca de ADN a la colección de clones obtenidos a partir de un ADN de interés. Clonación génica El proceso requiere cortar y pegar genes. Para cortar se necesitan tijeras y las tijeras que se utilizan en ingeniería genética son las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción). En 1968 se encontraron enzimas de restricción en bacterias y se observó que las utilizan para romper los ADN de virus infecciosos. La unión de fragmentos de ADN cortados es posible gracias a la complementariedad de las bases nitrogenadas. El proceso se lleva a cabo por medio de enzimas ADN-ligasas. Cuando se intercala un segmento de ADN extraño en un ADN receptor se obtiene un ADN recombinante. Clonación génica La enzima de restricción rompe las dos cadenas de la molécula de ADN dejando bordes cohesivos. El gen que se desea insertar en el plásmido se une a los bordes cohesivos por la acción de la ADN-ligasa. Molécula A Molécula B Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI Extremos cohesivos Mezclar Tratar con ADN-ligasa ADN recombinante Clonación génica • Se selecciona el gen que nos interesa. • Se fragmenta el ADN del gen y el del plásmido (vector elegido) con las enzimas de restricción. • El gen que nos interesa se inserta en el plásmido mediante las enzimas de restricción y se une mediante ligasas. Se obtiene un ADN recombinante. • Se introduce el ADN en una bacteria para que en su multiplicación se obtengan clones. Esquema de una bacteria Bacteria Escherichia coli Bacteriófago 1 Plásmido Plásmidos gen de resistencia a la ampicilina 2 3 Extremos cohesivos Molécula de ADN recombinante Plásmidos Moléculas de ADN extracromosómico de origen bacteriano Plásmido Ciclo lisogénico Ciclo lítico (f) (g) (h) Reacción en cadena de la polimerasa La técnica de “ La reacción en cadena de la polimerasa” (PCR) fue dada a conocer en abril de 1983 por Kary Mullis. Esta técnica consiste en obtener in vitro múltiples copias de fragmentos de ADN. Se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1ª Desnaturalización del ADN doble cadena (separación de las dos cadenas). 2ª Hibridación de los cebadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras 3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa En 1983 Kary Mullis da a conocer esta técnica y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por este descubrimiento Es un proceso cíclico (cada ciclo consta de 3 pasos) 94ºC desnaturalización (separación de las dos hebras de ADN) 50ºC Anillamiento de "cebadores" 72ºC copia de cada una de las hebras de ADN por la ADN polimerasa 35 ciclos 236= 68 billones de copias HUELLA GENÉTICA En 1985, un genetista británico , ALEC JEFFREY, descubrió un método para distinguir con facilidad unos individuos de otros a través de su “huella dactilar de ADN” Se basa en el hecho de que existen fragmentos cortos de ADN que se repiten a lo largo del genoma, una y otra vez, y dicho número de repeticiones varía de una persona a otra. Estos fragmentos repetitivos son considerados “ADN basura” por no codificar proteínas. Jeffreys comprobó su descubrimiento comparando muestras de ADN entre individuos de la misma familia y observó que había tanta variabilidad de una a otra, que se podía determinar quien era quien. APLICACIONES DE LA HUELLA GENETICA •Pruebas de paternidad •Criminología : identificación de sospechosos •Estudios de compatibilidad: donaciones de órganos •Identificación de restos humanos por comparación con familiares La huella genética Ciertas regiones del ADN se repiten. El número de veces que se repiten estas regiones difiere en cada individuo. Tiene aplicaciones en investigaciones criminales, en identificaciones y parentescos APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA º OBTENCIÓN DE PRODUCTOS INDUSTRIALES, FARMACÉUTICOS Y MÉDICOS Obtención de insulina transgénica • Antibióticos: hoy día la tetraciclina y la penicilina se obtienen de bacterias y hongos modificados genéticamente. • Enzimas: con aplicaciones industriales, como fabricar detergentes que eliminan las manchas de la ropa. Las enzimas se producen a partir de bacterias y hongos transgénicos. • Proteínas humanas: con fines terapéuticos y obtenidas a partir de microorganismos transgénicos, como: la insulina humana, el interferón y el factor antihemofilia. Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc... (insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales) Obtención de vacunas recombinantes (aternativa al uso de organismos patógenos inactivos) Extracción del ADN del virus Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levadura ADN plásmido bacteriano La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico Inyección de proteínas víricas en un chimpancé Diagnóstico de enfermedades de origen genético Mediante ingeniería genética se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo ADN sano ADN enfermo Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo Biochip Microarray DNAchip ADN complementario del ADN enfermo DIAGNÓSTICO Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomalía ¿Hibridación? Renaturalización ¿No hibridación? del ADN con la sonda fluorescente Desnatura lización del ADN ADN de la persona que se quiere diagnosticar Terapia génica Es el tratamiento de una enfermedad mediante la introducción de genes en el organismo. Los vectores más utilizados para la introducción de genes en el organismo receptor son determinados virus. En la terapìa génica se ha de conseguir: -Introducir el gen deseado en las células. -Introducir las células en el organismo. -Que los genes lleguen en condiciones a su objetivo. -Controlar la expresión de estos genes. La terapia congénita se ha realizado en personas con inmunodeficiencias congénitas (niños burbuja). La TG se puede llevar a cabo en : Células somáticas (terapia génica somática). Actualmente se investiga sobre la utilización de células transgénicas para curar el parkinson, alzheimer y algunos tipos de cáncer Células de la línea germinal (espermatozoides, óvulos o las células que las originan) en cuyo caso se denomina terapia génica germinal. Esta terapia presenta muchos problemas éticos y actualmente solo se realiza en ratones de laboratorio. Las alteraciones genéticas producidas en las células somáticas no se transmiten a la descendencia mientras que las modificaciones de las células germinales pueden transmitirse a las generaciones posteriores. Plantas transgénicas Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas.Produce tumores Agrobacterium núcleo Plásmido Ti Transgénesis= introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares. Ingeniero genético natural tras sutitución de genes onc por genes de interés cromosoma inductor de tumores contiene oncogenes (genes onc) cromosoma célula vegetal tumores Proliferación de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesión APLICACIONES MEDIOAMBIENTALES BIORREMEDIACIÓN Y BIOADSORCIÓN 1. Mejora del medio ambiente: Es el caso de los microorganismos empleados en la limpieza del medio ambiente. Por ejemplo para digerir el petróleo de las mareas negras o en el suelo (biorremediación). Biorremediación • Algunas bacterias, modificadas genéticamente, son capaces de eliminar residuos radiactivos. • Otras bacterias se han modificado para que produzcan plásticos biodegradables. 2. Producción de biocombustibles: algunas levaduras transgénicas pueden formar bioalcoholes y biodiesel. •Resistencia a herbicidas, insectos y enfermedades microbianas El maíz transgénico de Novartis es resistente al herbicida Basta y también es resistente al gusano barrenador europeo (contiene el Gen de resistencia a la toxina Bt de Bacillus thuringiensis) produce su propio insecticida Problemas:La toxina Bt en las plantas transgénicas tiene propiedades sustancialmente diferentes a la toxina Bt en su forma natural. La toxina puede ser transmitida a través de la cadena alimenticia, un efecto que nunca ha sido observado en la toxina Bt en su forma natural. Larvas de especies de insectos predadores benéficos (larvas verdes de crisopa) murieron cuando fueron alimentadas con el gusano barrenador europeo Gold rice de Monsanto con color amarillo por los altos niveles de vitamina A Mejora de la calidad de los productos agrícolas Producción de aceites modificados •Síntesis de productos de interés comercial Anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA PLANTAS TRANSGÉNICAS 1. Plantas resistentes a los herbicidas (modificadas con un gen bacteriano): soja, algodón y maíz. 2. Plantas resistentes a plagas de insectos (con genes bacterianos que producen venenos, no dañinos para personas ni para las plantas). 3. Plantas productoras de antibióticos y toxinas que atacan a los microorganismos. Cultivos en cámaras acondicionadas Cultivo de planta transgénica en un medio selectivo APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA PLANTAS TRANSGÉNICAS 1. Plantas resistentes a las heladas, las sequías o al exceso de salinidad del suelo. Por ejemplo en las fresas transgénicas se ha insertado un gen de pez ártico que produce proteínas anticoagulantes. 2. Plantas que retrasan la maduración: se ha hecho con tomates. 3. Plantas con mayor valor nutritivo: arroz amarillo que produce provitamina A 4. Plantas con fines farmacológicos: para producir algunas proteínas útiles como medicamentos. Tomates azules terapéuticos que, modificados genéticamente, sirven para crear vacunas, entre otros fines. Arroz convencional y arroz transgénico rico en b-caroteno. En naranja, los países que producen más del 95% de la producción total de los OMG Transgénesis en animales Gen humano (por microinyección de zigotos) Secuencia promotora para la síntesis de una proteína de la leche Gen híbrido humano rata Ovulos de cerda fecundados Desarrollo de una cerda transgénica Clonación de animales (TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CÉLULAS EMBRIONARIAS) Clonación de animales (TRANSFERENCIA DEL NÚCLEO DE UNA CELULA SOMATICA: CÉLULA DIFERENCIADA) http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=5zMtIj1h6xo CREACIÓN DE UN EMBRIÓN ARTIFICIAL (con células adultas) -embrión somáticoOBJETIVO ÚLTIMO: TRATAMIENTO de ENFERMEDADES OBJETIVO ÚLTIMO: AUTOTRASPLANTES (no hay rechazo) 1 Cultivo de blastocisto Fecundación 2 Eliminación de la capa externa Embrión temprano 3 Adición de sustancias que disgregan la masa celular interna 4 Transferencia de los agregados celulares a un nuevo pozo Fusión de célula somática y ovulo enucleado 6 Adición de factores de diferenciación seleccionados En caso de existir deficiencias a nivel genético se puede hacer terápia génica a nivel de células madre 7 Administración de células diferenciadas a tejidos dañados 5 Formación de células diferenciadas a tejidos dañados Las células madre abren la posibilidad a un nuevo mundo en las terapias de los trasplantes Calificada como una técnica "ineficaz e imperfecta" por científicos como Iam Wilmut, "padre" de la oveja Dolly, la clonación ha encontrado en las células "madre" su primera razón de ser. Retos técnicos 1. Las células embrionarias de ratón originan teratomas y teratocarcinomas en animales adultos 2. Conocimiento de las señales implicadas en el desarrollo y diferenciación 3. Asegurar la salud a largo plazo de las células a transplantar (edad biológica de las células) Clonan terneros en EE UU para producir anticuerpos humanos efe- Washington - agosto 2002 Terneros clonados y manipulados genéticamente (fábrica de anticuerpos humanos) genes para anticuerpos humanos recombinantes células dérmicas clonación Objetivo: Tratamiento de enfermedades inmunológicas Futuro: Tratamiento de una amplia gama de enfermedades ocasionadas por bacterias y virus, como hepatitis, ántrax (utilizada como arma biológica) Clonan cerdos destinados a trasplantar sus órganos a humanos La empresa escocesa PPL Therapeutics logra retirar de los cerditos el gen que provoca el rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3 galactosil transferasa" Enero 2002. AP Photo/Roanoke Times, Gene Dalton (IDEAL-EFE) Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia de células u órganos de una especie a otra) Ayudará a superar la escasez de órganos humanos para hacer trasplantes de todo tipo Un laboratorio de Texas clona al primer animal doméstico "Copycat" es el primer gatito nacido mediante clonación" El experimento abre las puertas de la clonación masiva de animales domésticos, un fin sin explorar cuya sola posibilidad había desencadenado ya el almacenamiento de células de mascotas por parte de sus ricos propietarios febrero 2002 Universidad College Station (Texas) El sexto día El ataque de los clones Declaración Universal de Derecho Humanos y Genoma Humano de la UNESCO (1997), adoptada en 1998 por la Asamblea General de ONU (busca un balance entre una continuación en las investigaciones y la salvaguarda de los derechos humanos) Frente a los múltiples beneficios de la ingeniería genética pueden surgir algunos problemas Problemas sanitarios nuevos microorganismos patógenos, efectos secundarios de nuevos fármacos de diseño, etc... Problemas ecológicos desaparición de especies con consecuencias desconocidas, nuevas contaminaciones debidas a un metabolismo incontrolado, etc... Problemas sociales y políticos en el campo de la producción industrial, agrícola y ganadera, pueden crear diferencias aún más grandes entre países ricos y pobres. El sondeo génico en personas puede llevar a consecuencias nefastas en la contratación laboral, por ejemplo, y atenta contra la intimidad a que tiene derecho toda persona (empleo, agencias de seguros, discriminación..). Problemas éticos y morales Poder conocer y modificar el patrimonio genético humano puede ser una puerta abierta al eugenismo "Eugenesia: la ciencia del incremento de la felicidad humana a través del perfeccionamiento de las características hereditarias". GENOMA HUMANO GENOMA HUMANO Genoma humano: secuencia de ADN de los cromosomas de la especie humana. Sólo el 2% del total del genoma humano está compuesto por genes que codifican proteínas, el resto son desechos. Se estima que el número total de genes que existe en cada célula humana es de unos 23.000. PROYECTO GENOMA HUMANO (PGH) En 1990 se inició el Proyecto Genoma Humano con el objetivo de localizar, secuenciar y cartografiar cada uno de los genes humanos. El plazo para ello fue de 15 años. El proyecto fue iniciado por dos equipos, con distintos métodos de trabajo: 1.Público: Se creó el Consorcio Internacional para la Secuenciación del Genoma Humano. Participaron numerosos científicos en 6 países diferentes. En la financiación participaron sobre todo el Reino Unido y EEUU. 2.Privado: desarrollado por la empresa Celera Genomics, fundada por Craig Venter. En junio de 2000, Francis Colins y Eric Lander (del consorcio público) junto Craig Venter anunciaron al presidente Bill Clinton la terminación de la secuenciación del genoma humano. En 2003 se terminó el borrador del genoma humano y el Proyecto Genoma Humano se dio por finalizado. Craig Venter PROYECTO GENOMA HUMANO 1. El genoma humano está formado por 3100 millones de pares de bases nitrogenadas. 2. El número de genes es de 23000 (se esperaban 100000). 3. Sólo un 2% del genoma codifica proteínas. 4. El 25% del genoma humano está formado por secuencias relacionadas con genes. 5. Un 70% del genoma contiene secuencias repetidas. Lo que se conoce como ADN basura. 6. Se calcula que existen unas 100.000 proteínas distintas. Por tanto cada gen podría estar implicado por término medio en la síntesis de unas diez proteínas. El comprensión del genoma humano puede ayudar a identificar genes que causan enfermedades hereditarias y a desarrollar métodos de prevención y tratamiento. GENOMA HUMANO 1. Un 2% del genoma humano está formado por genes que codifican proteínas. 2. Los genes son segmentos de ADN, en los que existen secuencias que codifican proteínas, denominadas exones, interrumpidas por secuencias que no codifican proteínas, los intrones. Antes de empezar la síntesis de proteínas se eliminas los intrones. 3. El 98% restante del genoma no codifica proteínas y está formado por intrones, genes de ARN y ADN basura. GENOMA HUMANO El ADN basura tiene una función desconocida. Algunas de estas regiones están compuestas por elementos repetitivos, el resto no sigue un patrón definido. GENOMA Y COMPLEJIDAD La complejidad del genoma humano no se debe al número de genes, sino en cómo parte de estos genes son usados para construir diferentes productos. Este proceso se conoce como ajuste alternativo. El ajuste alternativo permite obtener a partir de un transcrito primario de ARN mensajero distintas moléculas de ARNm maduro. Este proceso se ha visto principalmente en eucariotas. El ajuste alternativo invalida la vieja teoría “un gen una proteína”. Es necesario información externa para decidir que polipéptido será sintetizado. Este sistema permite obtener varias proteínas a partir de una única secuencia de ADN. GENOMA HUMANO Genómica: parte de la biología que estudia los genomas. La genómica tiene utilidad práctica en el estudio de determinadas patologías, como el cáncer. En el desarrollo de esta enfermedad intervienen conjuntos de genes (poligenes) que interaccionan entre sí Proteómica: es la ciencia que correlaciona genes con proteínas. Escenario de las enfermedades humanas propuesto por las ciencias «ómicas». 1: transcripción; 2: traducción; 3: modificaciones postraduccionales; 4: interacciones; 5: integración. MÁS DATOS SOBRE EL GENOMA HUMANO • El ser humano tiene solo el doble de genes que la mosca del vinagre, un tercio más que el gusano común y apenas 5.000 genes más que la planta Arabidopsis. Arabidopsis thaliana Mosca del vinagre • Los genes humanos están repartidos entre los 23 pares de cromosomas. Los cromosomas más densos (con más genes codificadores de proteínas) son el 17, 19 y el 22. Los cromosomas X, Y, 4, 18 y 23 son los más áridos. • Cada persona comparte un 99,99 por ciento del mismo código genético con el resto de los seres humanos. Sólo 1.250 letras separan una persona de otra. • El genoma humano coincide en un 96% con el del chimpancé. • Hasta ahora se han encontrado 223 genes humanos que resultan similares a los genes bacterianos. chimpancé GENÉTICA DEL DESARROLLO Trata de conocer los genes y proteínas implicados en el desarrollo de un animal pluricelular. Los investigadores: Antonio García Bellido y Ginés Morata han participan en la investigación en la Genética del desarrollo y han recibido el premio Príncipe de Asturias. Ginés Morata Antonio García Bellido GENÉTICA DEL DESARROLLO Existen genes, conocidos como homeobox, que codifican proteínas que controlan el tipo de estructura que tiene que desarrollarse en los segmentos de un embrión animal. Un homeobox es una secuencia de ADN que regula el desarrollo de un ser vivo. Los genes que contienen secuencias de este tipo se llaman genes homeobox. Gen homeobox Miembro de un grupo de genes involucrados en el control del desarrollo de las partes anteriores y posteriores del cuerpo. Los genes de este grupo contienen un segmento de ADN que se llama homeobox y que es casi idéntico en todas las especies Las proteínas formadas a partir de genes homeobox muestran a las células del embrión qué estructura deben desarrollar, por ejemplo una pata, un ala o una antena de un insecto. Secuencia homeobox y proteína GENÉTICA DEL DESARROLLO En los cromosomas los genes se ordenan según la parte del embrión cuyo crecimiento controlan. El desarrollo tiene lugar cuando grupos de genes se activan secuencialmente, determinando el patrón completo del cuerpo - parte delantera y trasera, por ejemplo, y superior e inferior – y, posteriormente, cascadas genéticas sucesivas determinan estructuras cada vez más localizadas. EPIGENÉTICA Ciencia que estudia las características de un individuo que no están determinados por la secuencia de nucleótidos del ADN. Las variaciones epigenéticas controlan la actividad de los genes, es decir, los cambios reversibles del ADN que hacen que unos genes se expresen o no, dependiendo de condiciones exteriores. El epigenoma es la información epigenética global de un organismo. Los factores que rigen estos caracteres son: • Metilación de la citosina: influye en la formación de ciertas proteínas. • El enrollamiento de la cromatina del núcleo: que puede inhibir la formación de algunas proteínas. • La existencia de determinadas proteínas en el citoplasma influyen en la síntesis protéica sobre los ribosomas. EPIGENÉTICA Hace poco se descubrió que en la cadena de ADN existe una capa en forma de moléculas adheridas, a la que se denominó “capa epigenética” por estar situada sobre la cadena de genes. Esta capa de información está constituida por proteínas, por radicales como los grupos metilo, acetilo, etc., y por metabolitos, que se adhieren al ADN sin alterar su secuencia. EPIGENÉTICA Tanto los hábitos de comportamiento como los riesgos de enfermar de tal o cual dolencia se pueden transmitir por una vía independiente a la genética clásica, una vía alternativa llamada epigenética. La proteína UHRF1 () es una proteína multidominio asociada a la proliferación celular y a la regulación epignética. UHRF1 se une mediante estos domínios específicos a dinucleótidos CpG y recluta repesores transcripcionales, la DNA metiltransferasa (DNMT1) y la histona desacetilasa 1 (HDCA1). http://www.dailymotion.com/video/xbtwz0_epigenetica-y-alimentacion-somos-lo_school http://www.dailymotion.com/video/xbv6qd_medicina-epigenetica-el-cancer_school http://www.dailymotion.com/video/x6y8mz_epigenetica_school http://www.dailymotion.com/video/xamswn_epigenetica-farmacos-del-futuro-dr_school ANIMALES TRANSGÉNICOS Obtenidos a partir de la inserción en sus células de un gen de otro organismo. Se emplean técnicas del ADN recombinante. Aplicaciones: 1. Mejora de la producción animal: como ovejas con mejor lana o cerdos con carme más magra. 2. Aumento de la resistencia a algunas enfermedades 3. Fabricar órganos para trasplantes (Xenotrasplante) : una de las especies más adecuada es el cerdo por su tamaño. Los trabajos que se realizan van encaminados a obtener cerdos trasgénicos con modificaciones inmunitarias para evitar el rechazo. 4. Creación de granjas farmacéuticas: para obtener moléculas biológicas empleadas en medicina. Por ejemplo a partir de la leche de vacas y ovejas transgénicas se pueden purificar las sustancias deseadas. http://www.iesmariazambrano.org/Departamentos/flash-educativos/animales_transgenicos.swf