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BIOTECNOLOGÍA
INGENIERÍA
GENÉTICA
Biotecnología: Conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de
los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas,
hormonas, antibióticos ….), para la obtención de productos, bienes y
servicios
Biotecnología tradicional:
procesos de fermentación
de bacterias y levaduras
desde hace miles de años
Biotecnología contemporánea
Clonación, nanotecnología,
biomateriales, reprogramación
Biotecnología moderna: en los últimos
30 años, avances en microbiología,
inmunología e ingeniería genética, con
manipulación selectiva y programada de
material genético
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
ROJA - Aplicaciones médicas
• Obtención de nuevos productos y fármacos por organismos
• Producción de Ac monoclonales
• Desarrollo de terapias génicas y celulares
VERDE – Aplicaciones agrícolas y ganaderas
• Desarrollo de cereales resistentes a plagas
• Desarrollo de animales resistentes a enfermedades
• Desarrollo de plantas que expresen pesticidas
AZUL – Aplicaciones acuáticas y marinas
• Uso de plantas y productos marinos para obtener nuevos fármacos
• Restauración y preservación de especies acuáticas
• Uso de genes de organismos acuáticos para obtener resistencias
BLANCA – Aplicaciones a procesos industriales
• Producción de nuevos compuestos
• Desarrollo de combustibles nuevos
• Uso de bacterias para eliminar vertidos de petróleo
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS
Organismo transgénico: es aquél que ha sufrido la alteración de su material
hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un
gen exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente.
Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos
especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y
descomponer al DNA, intercambiando así fragmentos específicos de ADN de
distintas especies e incluso transferirlos a bacterias.
Se descubrió posteriormente que esta práctica se venía haciendo en la
naturaleza de forma espontánea desde hace millones de años en los
vegetales a través de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens.
Las bacterias producen hoy en día, proteínas humanas por ingeniería genética
como el interferón, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran
importancia en la medicina.
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS
Microorganismos transgénicos
Producción de alimentos
Eliminación de basuras
Obtención de materias primas para la industria
Descontaminar lo que las industrias han contaminado
Animales de granja
(cerdos, ovejas, borregos)
"biorreactores“ de proteínas terapéuticas humanas en
su leche (antitripsina, factor VIII de coagulación…)
Plantas transgénicas "nueva revolución verde“
Resistentes a sequías, a herbicidas o a plagas de insectos,
Maduración tardía o con características para mantener el color y
sabor después de congelación
Ejemplos : algodón, la soja, la papa, el tomate y al maíz
INGENIERÍA GENÉTICA
La Ingeniería Genética
Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo
que carece de ellos
Se realiza por
Incluye
Enzimas de restricción
Capaces de cortar el ADN por puntos
concretos
Técnicas biotecnológicas
Se obtiene
•Recombinación de ADN
•Secuenciación del ADN
•Reacción en cadena de la polimerasa
•Aplicaciones diversas
ADN Recombinante
Segmento de ADN extraño intercalado
en un ADN receptor
Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética
Entre los años 70 y 80 se desarrollaron
herramientas de la biología molecular y la
ingeniería genética, lo que se conoce
como técnicas del ADN recombinante
La técnica se fundamenta en:
•Doble cadena del ADN
•Complementareidad de bases
•Siempre que se encuentren
secuencias complementarias se unen
•Orden de las bases determina
información de proteínas
•Código de transcripción universal
Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética
La tecnología del ADN recombinante incluye diferentes
técnicas de las que destacan:
• La rotura específica del ADN mediante endonucleasas de restricción, que
facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales.
• La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado
de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de
aminoácidos que codifica.
•La hibridación de los ácidos nucléicos que hace posible localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas
moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucléicos.
• La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento
de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus)
que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN
puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas.
• La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN
produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar
a células u organismos.
Enzimas: Endonucleasas de restricción
Endonucleasas de
Restricción:
Enzimas que pueden cortar el
ADN y lo hacen en secuencias
concretas
Enzimas que las bacterias usan
para destruir ADN que ingresa a
ellas, por ejemplo ADN de virus
bacteriófagos
Enzimas: Endonucleasas de restricción
Se conocen mas de 1200
enzimas de restricción
Eco RI (E. coli) reconoce
secuencias GAATTC y
corta entre G y A
Construcción de ADN recombinante
1 ADN plásmido
2 ADN extraño
3 Corte del plásmido y ADN
extraño con Eco RI
(endonucleasa de restricción)
4 Formación de
extremos cohesivos
5 Formación de ADN
recombinantes
6 Acción de ADN ligasa
que sella los extremos
Construcción de ADN recombinante
Clonación del ADN
La clonación de un gen consiste en introducirlo en una célula de modo que se
copie y se mantenga
El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonación (plásmidos),
capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una célula huésped
Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen
insertado en la célula hospedadora adecuada apropiada
Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un
organismo
Un plásmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo
obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plásmido
Clonación del ADN
Proceso de clonación de un gen en bacterias
1. Obtención de plásmido
recombinante
2. Transformación de
bacterias
3. Selección de bacterias
transformadas
4. Crecimiento de bacterias
transformadas
5. Aislamiento de los
plásmidos recombinantes
Clonación del ADN
Prácticas de ejercicios similares en la página indicada
Ejercicios:
http://personales.ya.com/geopal/biologia_2b
/unidades/ejercicios/act8abiointema6.htm
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que permite
amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de
pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN.
Es un método alternativo a la clonación muy rápido y eficaz
Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un
solo cabello, una célula somática o un espermatozoide.
Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de
personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de
muestras del niño y de su abuela materna
Aplicaciones médicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnóstico:
Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C
Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)
Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres
seropositivas.
Diagnóstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, o
reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas
a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente
entre veinte y cuarenta veces
Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos
cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalización".
Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de
cada una de dos cadenas cortas de oligonucleótidos (inicidores o primers)
con cada una de las hebras separadas del ADN molde.
Los “primers” son sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal
que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar
Tercer paso: la ADN polimerasa produce la “extensión” de los primers, en el
espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias
complementarias de las hebras del ADN molde (la Tª la condiciona la
polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
ADN polimerasa de E. coli
se desactiva a la alta
temperatura de la
desnaturalización del ADN,
por lo cual debía
agregarse enzima fresca al
comenzar el tercer paso
de cada ciclo.
Este inconveniente fue
solucionado de manera
ingeniosa cuando se la
reemplazó por su
equivalente de la bacteria
"termófila" Thermus
aquaticus
http://www.youtube.com/watch?v=N6
kBo_pTOA8
Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
APLICACIÓN: amplificar ADN
•Fragmentos de ADN antiguos (momias,
fósiles..)
•ADN de la escena de un crimen
•ADN de células embrionarias para
diagnóstico prenatal
•ADN de genes virales
SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Sanger
•Métodos y técnicas para determinar el orden de los nucleótidos de un
determinado fragmento de ADN
•Utilidad importante en biología básica y aplicada (forense…)
•Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonación)
Método Sanger o didesoxi:
•Fragmento de ADN (cantidad)
•Cebador en el extremo 3´ (20 bases)
•ADN polimerasa
•Desoxiribonucleótidos (A,T,C,G)
•Didesoxiribonucleótidos marcados
radiactivamente (paran la síntesis)
Cuatro tubos diferentes con:
Polimerasa
dATP, dCTP, dTTP y dGTP
Un solo didesoxi marcado
(ddATP)
Se forman fragmentos de distinto
tamaño terminados en A
SECUENCIACIÓN DEL ADN
Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaños con electroforesis
Cada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gel
Terminada la electroforesis se ponen en contacto con una película fotográfica
SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Automático
Marcaje de ddNTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo
tiempo losADNs de las cuatro mezclas
Comparativa de los dos
métodos
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
•Tradicionalmente se han mejorado los cultivos por selección de ejemplares
•Actualmente se mejoran características con técnicas de ADN recombinante:
-Plantas transgénicas-
El plásmido Ti o T-ADN
de Agrobacterium
contiene genes (onc) que
provocan una mayor
producción de hormonas
de crecimiento con la
formación del tumor o
agalla.
Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese
clonar, se habrá obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la
planta, evitando la aparición de la enfermedad
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Actualmente se consiguen mejorar diferentes características con técnicas de
ADN recombinante -Plantas transgénicas•Resistencia a herbicidas
(mejora vegetal)
•Resistencia al glifosfato herbicida
no selectivo, con gen de E. coli
resistente, clonado e incorporado
•Resistencia a plagas, con toxina de
Bacillus turingiensis
•Resistencia a virus, con proteínas
de la cápsida de dicho virus
FASES:
1. Transferencia
de genes
2. Regeneración
de plantas
completas
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
•Mejora del producto (alimentos)
•Arroz transgénico –arroz dorado- con
βcaroteno (vit A)
•Plantas farmaceúticas
(biofarmaceútica)
•Producción de proteínas humanas,
vacunas, anticuerpos, mas económicas y
contienen mecanismos de modificación
postraduccional de las proteínas, a
diferencia de las bacterias
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
•Medio Ambiente:Utilización de organismos genéticamente modificados para eliminar contaminantes
Biorremedación: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos
Bioadsorción: Bacterias modificadas que
adsorben en su superficie metales pesados
INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente
Fitorremedación: Plantas transgénicas que transforman contaminantes
peligrosos en sustancias inocuas
chopos modificados para acumular metales,
actualmente en condiciones controladas en
invernadero
La fitoestabilización :plantas que inmovilizan los
metales en el suelo por absorción o adsorción en las
raíces. Los contaminantes permanecen retenidos bajo
la superficie del suelo
La fitoextracción : plantas tolerantes capaces de
absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su
biomasa aérea. Posteriormente, esta biomasa es
cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso
INGENIERÍA GENÉTICA y GANADERÍA
•Inserción de genes en óvulos o células madre embrionarias:
Quimeras transgénicas
sólo sobre algunas
células del embrión
Células modificadas
Células no modificadas
Organismos transgénicos
todas las células
modificadas
Transmisión a la descendencia,
órganos y tejidos para trasplantes
1.Secuencia hibrida de gen de
interés y secuencia promotora
de una proteína de la leche
2. Introducir el transgén en
óvulo fecundado
3.Implantación en la hembra
que lo expresará junto con la
leche
Ejs.: α1-antitripsina, factor VIII,…
INGENIERÍA GENÉTICA y MEDICINA
APLICACIONES
Obtención de productos
farmacéuticos
Insulina
Interferón
H. De crecimiento
Factor VIII
Medicina forense
Marcadores
genéticos
Huella genética
Terapia génica
Diagnóstico de
enfermedades
Detección en personas o
fetos enfermedades
hereditarias por técnicas
de ADN recombinante
Inserción de genes
funcionales para corregir
un defecto genético
En células germinales
En células somáticas
Producción de insulina humana
La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están
codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener
en cultivos bacterianos separados.
Promotor
Subunidad A del
gen de la insulina
Promotor
Subunidad B del
gen de la insulina
Proteína de fusión con subunidad A
del gen de la insulina
Transformación
en E. coli
Extracción de
Separación de
las proteínas de los polipéptidos
fusión
AyB
Proteína de fusión
con subunidad B del
gen de la insulina
Formación
de insulina
activa
CONSTRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE