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PRÁCTICO N° 2 Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos Objetivo: Adquirir habilidad para el manejo de colorantes, microscopio, condiciones de asepsia y métodos de aislamiento 1) Métodos de coloración y observación de microorganismos 2) Manejo en condiciones de asepsia 3) Obtención de cultivos puros 4) Conservación de cultivos puros Síntesis del práctico anterior Práctico 1 Esterilización Laboratorio Medio de cultivo Práctico 2 Observación Aislamiento • Autoclave- horno • Radiación • Filtración • Productos químicos Composición química • Fuente de energía/carbono • Base mineral • Agua Preparación de medios Líquidos Sólidos • Pesar drogas • Disolver con agua destilada • Regular pH • Fraccionar • • • • • • Pesar drogas Disolver con agua destilada Regular pH Agarizar Fundir Fraccionar Esterilización en autoclave Siembra de suelo Incubación Métodos de coloración y observación de microorganismos Características del microscopio óptico Aumento: objetivo x ocular Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión) Tipos de microscopios Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia Métodos de coloración Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo Tipos de coloración: • Simples (un solo colorante) • Dobles (dos colorantes, coloraciones diferenciales) Colorantes más utilizados: • Safranina • Azul de metileno • Fucsina • Cristal violeta • Azul de algodón Secuencia de una coloración Preparación y fijación de un extendido por calor Coloración Observación Coloración de Gram 1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto) Todas las bacterias se tiñen de violeta 2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto) 3) Decolorar con alcohol Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran 4) Teñir con fucsina (30 segundos) Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas Secuencia de una coloración Equipo de coloración Extraer una alícuota Flamear un portaobjeto Extender Esterilizar el ansa Fijar al calor Secuencia de una coloración (cont.) Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar Secar Observar Secuencia de fijación con ácido y coloración Portaobjeto enterrado Colorear con fucsina Esperar 5 ?? minutos Fijación con ácido acético Manejo en condiciones de asepsia Atmósfera: cámara de flujo, lámpara UV Superficie de la mesa de trabajo: alcohol, hipoclorito Obtención del material: ansa estéril Flameado de recipiente Obtención de cultivos puros Cultivo puro: cultivo de microorganismos genéticamente iguales. Aislamiento: Método para obtener un cultivo puro. Métodos de aislamiento Aislamiento en medio sólido: Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio solidificado. Aislamiento biológico: Consiste en inocular animales o vegetales y aislarlas de la sangre, tejidos, etc. Obtención de cultivos puros Aislamiento en medio sólido por estriado Colocar en caja de Petri Dejar solidificar Fundir el agar Esterilizar el ansa Trazar estrías sobre el agar Incubar Obtención de cultivos puros Colonias aisladas Crecimiento confluente Cultivos puros en caja de Petri Conservación de cultivos puros Formas de conservación de cultivos puros • Liofilización: desecación mas congelación • Congelación: -90° C recubierto con glicerol • Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5°C) Síntesis del práctico N° 2 Técnicas microbiológicas Observación Microscopio Óptico Tipos: • Campo Claro • Contraste de Fase • Campo Oscuro • Florescencia Coloración tipos •Simples •Dobles Aislamiento Normas de manejo en microbiología Conservación • Medio sólido (estrías) Liofilización • Biológico (vegetales o animales) Congelación Subcultivos seriados Asepsia Atmósfera Sup. de trabajo Manejo de material y recipiente Actividades 1) Coloración simple: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético) 2) Coloración doble: observar al microscopio bacterias Gram + y Gram – 3) Aislamiento: observar estrías crecidas en caja de Petri Coloración doble (Gram) Bacterias G- Bacterias G+ Coloración simple (Rossy-Cholodny) Hongo tabicado Partícula de arena Bacterias Actinomycetes Hongos Taxonomía bacteriana • Concepto de especie y cepa • Nomenclatura binomial. Ej. Escherichia coli • Metodología Convencional: claves dicótomicas Molecular: coeficiente de similitud genética Caracteres morfológicos: forma, tamaño, presencia de esporas, carácter Gram, flagelación, capsulas, etc. Composición de bases del ADN Caracteres metabólicos: heterótrofos, fotótrofos, aeróbicos, anaeróbicos, etc. Secuenciación de nucleótidos Otros: condiciones ambientales, hábitat, patogeneidad, Hibridación del ADN Taxonomía convencional: Manual Bergeys: Claves dicotómicas Taxonomía molecular: Dendrogramas de coeficientes de similitud genética Rangos de similitud: 99 – 100 %: misma cepa >60%: misma especie >20%: mismo género
