Download cromatina y epigenetica actualizada 2016

Refuerzo de conceptos sobre
CROMATINA
Necesidad biológica de empaquetamiento del
DNA en núcleo en eukas
1 bp = 0,33 nm
Por lo tanto, 1 cromosoma humano (108 bp)
mediría (si no estuviera plegado):
0,33 x 10-9 m/bp x 108 bp =
0,033 m = 3 cm!!
(y un núcleo mide unos pocos micrones
de diámetro)
Nucleosoma: unidad estructural: octámero de histonas
(básicas, cargadas +): 2 x (H2A*, H2B, H3, H4) MUY
conservadas
ensamblable in vitro con cualquier tipo de DNA incluso
proka!!
* hay variantes llamadas H2AZ (4%) y H2AX (10%)
modelos de un nucleosoma:
(cada color: un tipo de H diferente)
• Modelos del nucleosoma: ¿quien envuelve a quien? 2 vueltas de DNA
(aprox 160 pb) alrededor del octámero (carretel) = + 40 pb linker
(asociada a H1) = 200 pb
• Arquitectura in vivo: cintas 10 nm (eucromatina, laxa) ↔ cintas 30 nm
(heterocromatina facultativa, compacta), a su vez super-enrollable en
estructuras de alto orden, muy emapaquetada, como la heterocromatina
constitutiva.
colitas
de histonas
RNA
histonas “flojas”
genes aptos para ser transcriptos
Histonas
“que aprietan”
genes inactivos
al microscopio electrónico
The 30 nm fiber has a coiled structure.
modelos
Paradigma de región de
heterocromatina constitutiva:
centrómeros
•
No sufren recombinación homóloga en meiosis
•
Pueden medir hasta varias Mb: contienen clusters de satélites (repeats) de
150-300 pb dispuestos en tandem cabeza-cola y transposones o elementos
derivados.
La cromatina en el centrómero contiene una variante de H3 llamada
CENH3, dimetilada en su lisina 4 (H3K4) y fosforilada en Ser/Thr
•
•
En Schizosaccharomices pombe, la heterocroatina se forma solamenete el
el centrómero, telómeros y en el locus mating-tpe (HM). Paradójicamente,
la formación de heterocromatina en el centrómero depende de la
transcripción por Pol II y RNA interferente (RNAi) (Sugiyama et al, PNAS 2005)
Proteína (no-histónica) de heterocromatina, paradigmática :
Heterochromatin Protein1 (HP1) (“swi6” en levaduras),
descubierta en Drosophila; se une a H3K9Me2
Similar al de polycomb (HMT),
heterocromatiniza
Se une a histona metilada
Modificadores o remodeladores
los que incorporan o quitan marcas:
•
•
•
HAT: pone acetilos en Lys, es decir “aflojan” las histonas; reclutadas
por TFs típicos, que ya de por sí desplazan a las histonas
DHAC: quita acetilos en Lys, es decir compactan las histonas;
reclutadas por grupos metilo
HMT: pone metilos en Lys o Arg, aflojan o compactan, según la posición del
aa.
los que no dejan marca:
tipo SW/SNF, que aflojan o compactan nucleosomas, recorriendo DNA con gasto de
ATP
• Relación de cromatina con transcripción:
modelos “naive” sin histonas? No son útiles
modelos con histonas totalmente desplazadas? Tampoco
•
Relación con recombinación o transposición: ?? (no estudiado)
Relación entre cromatina y transcripción
Identificando regiones de cromatina activa
transcripcionalmente (nucleosomas laxos)
Metodologías “in vivo” con nucleos enteros
(Pierre Chambon, 1975)
Ensayos de sensibilidad a nucleasas
Cromatina de
reticulocitos
tratados con
nucleasa
micrococal (NM),
(a baja concentr.)
que corta solamente
entre nucleosomas
(Pierre Chambon,
1980s)
Con sondas para genes inactivos
Dio lo mismo
“escalera” de fragmentos
que difieren en 200 pb
(protegidos por nucleosomas)
con sondas para genes
inactivos
dio lo mismo
en cambio con DNAsa I, da un “chorreado” (no bandas
discretas) solamente donde la cromatina está laxa (activa)
→ la DNAsa I (más invasiva) corta dentro de nucleosomas en cromatina activa
Interpretación de ensayos de sensibilidad a
DNAsa I
sitio sensible
aquí no corta
etilos
Interpretación de ensayos de sensibilidad a
nucleasas
• Nucleosomas estan presentes (aunque
“flojos”) en cromatina transcripcionalmente
activa (se deduce porque el DNA sigue
estando protegido contra la NM)
• Nucleosomas sueltos conservan la
estructura que tenían cuando formaban
parte de la cromatina nativa
Para identificar genes/sitios DNA a los cuales hacen binding
proteínas de interés: ChIP (Inmunoprecipit. de cromatina)
núcleos enteros (in vivo)
con cromatina nativa
con formaldehido
(tuvo que haber sido purificada antes para poder generar anticuerpos)
deep sequencing o
de DNA
*el formaldehído es para no perder las interacciones no covalentes, sobre todo las
indirectas
ChIP (con Ab específicos)
Para saber la secuencia de DNA que precipitó:
• ChIP-chip (ChIP-microarray)
• ChIP-secuenciación (de genes individuales mediante
clonado convencional en vectores o PCR con
adaptadores o masiva con adaptadores [deep seq]:
“ChIP-seq”)
Sirve para (dependiendo el Ab usado):
• conocer targets de TF
• monitorear regiones siendo elongadas por RNA Pol II
• identificar loci con marcas (epigenéticas) en histonas
• identificar loci con marcas de daño
• averiguar posicionamiento de nucleosomas (post-NM)
Posicionamiento
ChIP post-NM con anti-H2AZ + deep seq reveló:
•
1) Posicionamiento evidente en el primer exón y ultimo, se pierde en exones e
intrones intermedios. Región upstream al +1 en genes activos: desprovista de
nucleosomas
•
2) nucleosomas preferentemente ubicados en exones! → interacción entre RNA Pol e histonas → la
RNA Pol va mas lenta cuando llega a los nucleosomas (160 pb carretel) (“lomas de burro” para RNA Pol
II) facilitando interacción entre los factores de splicing 3’ (en intrón “izquierdo”) y 5’ (intrón “derecho”) a
una distancia óptima (= largo de DNA en un nucleosoma = tamaño de un exón).
El splicing entonces ejercería una presión selectiva para mantener una apropiada ubicación de los
nucleosomas en exones. La cromatina contribuiría así a una definición pre-transcripcional de exones!
EPIGENETICA
Modificaciones en el ADN:
Modificaciones epigenéticas en general
 Son modificaciones covalentes sobre el
ADN o sobre la cromatina asociada
 No implican cambios en la secuencia
nucleotídica
 Son mitótica y meióticamente estables
Attwood et al., Cell Mol Life Sci, 2002
Modificaciones en histonas:
enmascara carga
(+) de lisina
 Pueden ser adquiridas o perdidas como
consecuencia de factores ambientales
externos
 Son mantenidas por complejas
maquinarias enzimáticas
 En plantas, pueden ser transmisibles a
la línea germinal y ser heredadas
transgeneracionalmente
Lic. Rodrigo Matías González - Tesis
Doctoral
Latham & Dent, Nat Struct Mol Biol, 2007
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MAQUINARIAS ENZIMÁTICAS (para metilación en citosinas
en contextos GC) en ANIMALES
• Citosina metil transferasas (DNMTs), de novo
(ej. DNMT3 en mamíf) que se activan por alguna
señal; esenciales (ratón KO letal embrionario)
• se llama DNMT2 en insectos
y de mantenimiento (DNMT1) que reconocen
hebra ya metilada de antes (dsDNA hemimetilado) y metilan la otra
• también hay glicosilasas que desmetilan
(indirectamente, a través del intermediario HOmetilC)
Epigenética en plantas
Metilación en citosinas del ADN en distintos contextos
CG
• Debida a la enzima Metiltransferasa I (MET1).
• Sobre la región promotora de los genes, reprime su transcripción.
• Sobre el cuerpo de los genes, estimula su transcripción.
CNG (N = A, T o C) (EXCLUSIVA DE
PLANTAS !!)
• Debida a la enzima Cromometilasa 3 (CMT3).
• Mantiene silenciados los trasposones y otros elementos repetitivos.
CNN (asimétrica) (N = A, T o C) (EXCLUSIVA DE
PLANTAS !!)
• Debida a la enzima Domains Rearranged Methyltransferase 2
(DRM2) en conjunto con pequeños ARN de interferencia.
• Mantiene silenciados los trasposones y otros elementos repetitivos.
Lic. Rodrigo Matías González - Tesis
Doctoral
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Lo que se sabe:
 Caracterización de fenotipos mutantes
de MET1 y DRM2 en Arabidopsis: tardía
floración debido a hipometilación y
expresión
del
gen
FWA
(que
normalmente está silenciado en tejido
vegetativo) (Fujimoto el at 2011, Plant Journal 66,
Falta determinar:
 Mecanismo de
mantenimiento de la
metilación asimétrica
831–843)
Determinación de la estructura
tridimensional de la CMT3 de maíz
mediante cristalografía de rayos X
 Al ser asimétrica,
es más difícil
entender cómo la
maquinaria metila
usando como molde
un hebra que no
tiene C
 Se
sabe
que
intervienen siRNAs,
que guían a la
metilasa DRM2
Du et al., Cell, 2012
Lic. Rodrigo Matías González - Tesis
Doctoral
 Caracterización
bioquímica de las
metilasas DRM1 y
DRM2
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Metodología
Citosinas metiladas se detectan por enzimas de restr.
sensibles a o dependientes de metilación o por
la técnica de bisulfito, o…
La reacción de bisulfito sobre ADN genómico total
 Reacción diferencial del
bisulfito con las citosinas
metiladas y no metiladas (da
uracilo a partir de las no
metiladas)
Bisulfito
C
mC
desaminación
oxidativa
PCR
U
mC
no hay reacción
en C5 (↓)
T
C
Consta de 3 pasos.
Los primeros 2 (sulfonación
y desaminación) se engloban
en la etapa de conversión, a
pH = 5, con temperatura y
tiempos variables.
El tercer paso es el de
desulfonación, en medio
alcalino (pH = 13) a 37°C
↓
Lic. Rodrigo Matías González - Tesis
Doctoral
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las histonas también se metilan…
Histone methyl transferases (HMTs) reciben
distintos nombres:
• sobre H3K9: Suv39 en animales;
Kriptonita en plantas
• sobre H3K27: Polycomb en animales
y se desmetilan: sobre H3K27: por la
desmetilasa UTX (tritorax) en genes HOX
del desarrollo durante diferenciación.
Código de histonas en animales
Código de histonas en plantas
En plantas, CG metilado en el cuerpo de gen es
marca activadora de transcripción
marcas estudiadas en el LFBM
(FBMC) 2do piso
FCEN
Lauria & Rossi, Biochim Biophys Acta , 2011
Lic. Rodrigo Matías González - Tesis
Doctoral
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¿Qué tipo de metilación ocuure
“primero”?
evidencia: Hongos con hipometilación en
DNA generalizada resultaron mutantes en
HMTs, no en DNMTs que era lo esperado!
→ interacción entre ambas maquinarias:
de metilación en DNA e histonas
2 tipos de modelos
el de Michael Carey, Gen Dev 2007:
• MeH3K9 ----→ HP1-----→ DNMT
colocada por HMT
condensa
coloca Me en C
el de Johnson et al, Curr Biol 2007 y Fuks et al, NAR 2003:
además de reclutar
a DHAC…
• MeCit-------→ MBP-------→ HMT
colocada por DNMT
Methyl-binding proteins
coloca Me en H3K9,
coloca
Me en
H3K9
que recluta
a HP1:
condensa
Marcas epigenéticas durante el desarrollo de mamíferos
controla genes de pluripotencia
controla genes de desarrollo corporal
controla genes de desarrollo corporal
oleada de DNA desmetilacion (influyen factores citopl.)
excepto en genes sujetos a imprinting y transposones
MEFs
hay lineas ES humanas
a partir de embriones de
descarte en fertiliz. in vitro
controla genes de pluripotencia
Nature (2007), 447: 425
Resumiendo sin describir las marcas
• Del cigoto a adulto ocurren oleadas de expresión y
represión génica que resultan en diferenciacion
• En otras palabras: modificaciones epigenéticas junto con
factores de transcripción van definiendo linajes celulares
• ¿Y cómo? Células de cada linaje (incluyendo el germinal)
adquieren (o pierden) una combinación de marcas que se
heredan a nivel celular (mitosis), p. ej. mediante la DNMT
de mantenimiento
• Células primordiales germinales (PGCs) pueden mantener
marcas (heredadas) que existían en ES cells o
resetearlas, que serán transmitidas (meiosis, DNMT de
mantenim.) a la generación siguiente
Ejemplo de gen de pluripotencia reprimidos en
embrionarias somáticas
• Oct-3/4 gen se expresa en ES cells
• Función: pluripotencia
• Despues de la implantación, se inactiva por metilación de la H3K9 que
lo envuelve
Nature Cell Biology (2006), 8: 188
¿se puede ir para atrás en el laboratorio?
es decir ir desde somáticas a pluripotentes?
Sí; lo hizo Shinya Yamanaka
• clase teórica de Alejandra Guberman
• paper de seminario
• Lo que hizo Yamanaka (2006 ratón; 2007
humano) fue justamente introducir tres o
cuatro genes maestros (de pluripotencia)
en fibroblastos embrionarios (MEFs) o de
adulto, donde normalmente no se
expresan y convertirlos en células madre
pluripotentes (iPCs), con patrones
epigenéticos y estructura de cromatina
similares a los de ES normales!!
adaptación frente al estrés provocado por
estímulos externos
La epigenética muestra mecanismos adaptativos rápidos:
un nexo entre los genes y el ambiente
ejemplo de efecto epigenético
en plantas
¿y estos personajes?
Detección de marcas de metilación en citosinas por la técnica
del bisulfito (que convierte C no metilada en T)
diferentes
epialelos
en plantas: distintos contextos de metilación:
CG, CNG, CNN
sala de torturas
el estrés provoca pérdida de marcas de
inactivación en genes de adaptación
el estrés afecta a la cromatina:
marcas en lisinas (histonas) acompañan a marcas en
citosinas (DNA)
Experimentos de ChIP
con Ab anti-histonas
estrés: correlación de pérdida de marcas epigenéticas
con aumento de expresión de genes de respuesta
al estrés (y fenotipos visibles de tolerancia y adaptación)
ejemplo de estudio epigenético
en animales
cuanto más GR hay en
hipocampo, menos cortisol hay
en sangre y baja la ansiedad
p. ej. cortisol
efecto de cuidado maternal
(Michael Meaney):
explorando los orígenes de la ansiedad
Blanca!
Ojo los errores!
High!
el color aquí debería ser el mismo
que cuando eran recién nacidos!
Rats raised by mothers that display low licking-and-grooming behaviour exhibit more anxiety-related behaviour
than rats raised by high licking-and-grooming mothers.
Resumen de los resultados
ratas que amamantan (madres biológicas o adoptivas) con fenotipo
“muy maternal” inducen en las crías:
a nivel molecular: cromatina laxa y desmetilación de CpG en promotor
de gen GR en hipocampo (medido por bisulfito), mayor binding del
TF “NGF-1” (medido por ChiP anti-TF seguido de Southern)
→ bajos niveles de gluco- corticoides en sangre
a nivel fenotípico: mayor tolerancia al estrés (menor miedo y ansiedad)
en la adultez (adquirido en la lactancia, no heredado)
Todo lo contrario con amamantadoras “no cuidadoras”
Nicostatin (inhibidor de DHAC → afloja la cromatina) inyectada en
hipocampo de las crías hace desaparecer las diferencias entre los 4
grupos de crías, tanto a nivel molecular como fenotípico → efectos
mediados por eventos epigenéticos
Weaver IC et al. Epigenetic programming by maternal
Behavior. Nat Neurosci. (2004) 7: 47-54
Conclusiones (de Michael Meaney)
1) una actitud cariñosa de las madres en los primeros días de vida
repercute favorablemente en la vida emocional de los hijos y que
perdura en la vida adulta (también sugiere que es extrapolable a humanos:
es decir que una buena contención familiar en los primeros años condiciona en
gran medida nuestra estabilidad emocional durante toda la vida).
2) algunos fenotipos de comportamiento en el adulto (p ej. los
relacionados con grados de temor y ansiedad) no son heredados
genéticamente sino que son inducidos por la hembra amamantadora
(que obviamente en la mayoría de los casos, es la madre biológica).
3) los efectos de ese estimulo sobre las crías durante la lactancia son
mediados por eventos epigenéticos.
Lo que no estudiaron es el fenotipo “Low o High Licking” de las hembras
adultas F1 de los 4 grupos, cuando fueron madres. Hubiera sido
interesante....
Herencia epigenética
transgeneracional
(memoria epigenética)
en plantas: es posible porque las germ
cells surgen tardíamente (floración),
después de que la planta sufre el estrés,
ya nacen con la marca epigenética
adquirida que tenía la cell somática
antecesora
¿y en animales?
lo que sigue
co-localiza con HP1
kinasa p38
el gen “pigmento rojo” normalmente se encuentra
en eucromatina de cromosoma X, pero para
este trabajo, se usaron moscas mutantes (m4)
con una inversión de una gran región, por lo tanto
el gen quedó en zona pericentromérica →
no se expresa y se aprovecha como reporter
endógeno (alelo white):
ojos blancos antes del estrés
Inheritance of Stress-Induced, ATF-2-Dependent Epigenetic Change
Seonq et al, Japon
Cell 145 (2011) 1049 - 1061
no estresadas
G
e
n
e
r
a
c
i
ó
Generación
siguiente (G2) sin estresar!
n
el gen del pigmento se activó
s
i
g
u
i
e
n
Cell Volume 145, Issue 7 2011 1049 - 1061
no estresadas
Ojo: el alelo white reporter en G2 vino
de la madre, no estresada,
lo cual indica que el macho
transmitió un epialelo “aflojador” cuyo
producto actuó durante el desarrollo
sobre el alelo white presente en el
complemento genético
y el fenotipo de ojos rojos se sigue heredando en las subsiguientes generaciones…
Figure 7 Multigenerational Transmission of Disrupted Heterochromatin Induced by HS Male w m4 flies and female w m4 flies
carrying two w m4 genes were mated (G0). In series #2 experiments, the embryos generated were exposed to HS (37°C for 1 hr)
f...
Ki-Hyeon Seong , Dong Li , Hideyuki Shimizu , Ryoichi Nakamura , Shunsuke Ishii
Inheritance of Stress-Induced, ATF-2-Dependent Epigenetic Change
Cell Volume 145, Issue 7 2011 1049 - 1061
Y en vertebrados?
Muy improbable porque las germ cells surgen muy
tempranamente en el embrión
Cuando el adulto sufre un estímulo que repercute
p. ej. en el sistema nervioso, difícilmente las
marcas epigenéticas lleguen a las gametas!
Pocos ejemplos: dieta rica en grasas en ratón
macho parental afecta expresión en hígado de
genes de metabolismo en progenie con dieta
normal!
-
F1 con
dieta
normal
representación informática en colores
dependiendo el patrón de expresión
3 meses
RNAs de hígado
cDNA de un color
cDNA de otro
color
Cell (2010) 143:1084-96
grupo de Oliver Rando, USA
cambia la expresión de muchos
genes de síntesis de colesterol
en los F1 alimentados
con dieta normal!
hígado
en el mismo paper:
effects of paternal diet on methylation
of the Ppara enhancer en hígado
(gen regulador de la síntesis de
lípidos)
gametas
No ven diferencias en gametas
Masculinas. Mmmmm!
Ojo! No midieron nada en los padres
antes o después de la dieta grasa!
Comparan siempre entre F1 de
de distintos cruzamientos
otro paper apuntando en el mismo
sentido
Chronic high-fat diet in fathers programs
β-cell dysfunction in female rat
offspring (2010)
Nature 467, 963–966
Parental olfactory experience influences behavior and
neural structure in subsequent generations
Brian G Dias & Kerry J Ressler
Nat Neurosci. Jan 2014; 17(1): 89–96.
muestran hipersensibilidad a acetofenona (volatil, olor
fuerte) en la progenie F1 de ratones F0 que habían sido
expuestos a ese olor
experiencia en los padres: simultáneamente al olor
tambien se los sometió a un electroshock, generando un
reflejo condicionado, de manera que después, la
exposición al olor les provoca una reacción mucho más
marcada que a animales control no condicionados.
recuerdan experiencia
traumática del progenitor
desmetilación de
gen del olfato (acetofena)
en gametas de los
padres!
Se activa el promotor de un gen del olfato (acetofenona)
(en transgen fusionado a β-gal) solamente
en los hijos “naive” de padres expuestos al olor
¿entonces podemos hablar de
epigenomas (p. ej. metilomas)?
Pues, claro hombre! Pero hay infinitos: tantos
como tipos celulares, momentos y estímulos
Metodologías posibles:
• Alta resolución: Bisulfito genome-wide. Difícil
alinear con seq control (sin tratamiento con
bisulfito) porque se convierten muchísimas C a
T
• Baja resolución*: fragmentos DNA precipitados
con Ab anti-metilcitosina + microarray chip o seq
(*ojo: pocas citosinas metiladas en un fragmento
tal vez no alcancen para lograr inmunoprecipit.)
Epigenética: conceptos importantes
• Se ocupa de las marcas químicas (covalentes) en la cromatina, que
se mantienen en las divisiones celulares -pero también adquiridas o
reversibles- que tienen poderosa influencia en la expresión genética
¿cuáles son? son citosinas y diferentes lisinas de histonas a
través de metil transferasas (de novo y mantenimiento) y de las
enzimas que remueven tales marcas
•
en embriones de mamíferos en desarrollo: “oleadas” de desmetilación (sobre
todo genes de pluripotencia) y metilación (sobre todo en genes del desarrollo
tardío y diferenc) en embrión temprano desde cigoto hasta ES cells, y luego,
patrones particulares en distintos linajes celulares incluyendo germinales,
que recapitulan las oleadas de estadíos muy tempranos del embrión
• dan plasticidad a los organismos adultos pues les permite adaptarse
rápidamente a condiciones nuevas (desfavorables), en comparación
con la secuencias génicas que requieren varias generaciones, sujeto
a selección natural
• en plantas (en animales más improbable): las adquiridas (no
heredadas) en la adultez son transmisibles a células de línea
germinal, generando nuevos epialelos con nuevos patrones de
expresión, heredables trans-generacionalmente (Lamarck-like?),
lo cual puede tener relevancia en la evolución. En animales hay
muy pocos ejemplos convincentes.