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Técnicas moleculares I “Tecnología del ADN” Estructura y características de los ácidos nucleicos mRNA Propiedades físico-químicas de los AN Temperatura de melting Procariotas vs Eucariotas Genoma de un mamífera 3 Gb Genoma de E.coli 1,2 Mb Tecnología del ADN recombinante Clivaje del ADN en sitios específicos mediante endonucleasas de restricción, que facilitan el aislamiento y manipulación de genes. Hibridización de AN que hace posible detectar secuencias específicas de ADN y ARN. Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la técnica de PCR Secuenciación de los nucleótidos que componen un determinado fragmento de ADN Monitoreo de la expresión de genes en una célula mediante microarrays Enzimas como herramientas de la tecnología del ADN Clivaje de secuencias específicas del ADN: Enzimas de restricción Extremos romos En general reconocen secuencias palindrómicas Extremos cohesivos 5’ extendido 3’ extendido Técnicas electroforéticas: separación, purificación e identificación de AN Permiten separar las moléculas de AN por tamaño. Geles de: Agarosa Poliacrilamida Clivaje y purificación de secuencias específicas de ADN MAPA DE RESTRICCION PURIFICACIÓN DEL ADN Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucleótido quinasa Oligonucleótidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuya secuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Southern blot Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Northern blot Ejemplos de Southern blot y Northern blot Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda Calle 1-9: muestras a chequear Calle L: ladder, patrón de tamaño Calle 10: control positivo Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda Calle M: ladder, patrón de tamaño Detección de secuencias de AN específicas: Hibridización in situ Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado Componentes mínimos: 1- Origen de replicación 2- Gen marcador de selección 3- Sitios de restricción “polylinker” Vectores de clonado: Plásmidos Estructura CCC y su tamaño es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb Otros tipos de vectores Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb Cósmidos: híbrido plásmido y fago L (30-40 kb) Fásmidos: híbrido plásmido y fago M3 Cromosomas artificiales: BACs, PACs y YACs (100-500 kb) Transferencia de la químera de ADN a la célula huesped Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Ciclos: Desnaturalización (92-95 ºC) Hibridación (35-60 ºC) Polimerización (72 ºC) http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html PCR : incorporación de secuencias de restricción EJEMPLO: Objetivo comparar genomas y aislar gen X del jerbo. Aislar ADN genómico de ambos animales e identificar y comparar gen X en ambas especies Calle Calle Calle Calle Calle ER1 L: Ladder patrón de tamaño 5, 7 y 9: controles negativo 6: ADN del jerbo digerido con ER1 8: ADN del ratón digerido con ER1 10: gen X de ratón ER2 ER2 ER3 L 3 1 ER3 Southern blot 2 purificación del gen Gen x jerbo + gen X + ADN ligasa ER3 Gen x jerbo PCR Digerir con ER3 plásmido y fragmento de PCR ER3 Ligación Transformar bacterias Extracción de ADN plasmídico: TECNICA DE MINIPREP Chequeo de colonias Introducción a los TP 1 y 2 Extracción de ADN plasmídico a partir de bacterias Miniprep- Hidrólisis alcalina Cuantificación y análisis de pureza Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa TP nº 1: Extracción y cuantificación de DNA plasmidico
