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@TRABAJOS PRÁCTICOS DE
INGENIERÍA GENÉTICA 2011
Trabajo
Práctico Nº 5
Problemas de Ingeniería Genética: aplicaciones
Ejercicio N°1: ESTRATEGIAS DE CLONADO
Los plásmidos son las plataformas utilizadas en ingeniería genética para realizar construcciones
quiméricas con diferentes fines (clonado molecular, producción de proteínas, recombinantes, vectores
de transferencia para transgénesis, vacunas a ADN, etc), En los plásmidos utilizados como vectores de
clonado, se han insertado genes indicadores (que confieren resistencia a un antibiótico o que generan
un compuesto coloreado a partir de otro incoloro, por ejemplo). Los vectores contienen sitios de
clonado específicos para incorporar los fragmentos de ADN que se desean clonar. Asimismo la
mayoría, si no todos los vectores que se usan en la actualidad, se han construido de manera que se
detecte con facilidad si ha tenido lugar la incorporación de un fragmento de ADN en el sitio de clonaje.
En el primer ejercicio, estudiaremos dos vectores de clonado, utilizados rutinariamente en un
laboratorio de biología molecular, y cómo seleccionar los clones recombinantes en E.coli; en los dos
sistemas. Proponemos una serie de actividades (remarcadas en negrita para realizar durante el estudio de
la presente guía).
OBJETIVO: Se quiere colocar un fragmento de ADN que contiene el gen ahp (aminoglycoside 3'phosphotransferase) que codifica para la resistencia al antibiótico Kanamicina (kanr) en los vectores
pACYC184 y en pUC18, en un sitio adecuado de clonado. Dicho gen de resistencia a Kanamicina (kanr)
será obtenido desde el plásmidos pUC4K, en el cual esta flanqueado por varios sitios de restricción.
a) Averigüe qué tipo de vector es pUC4K.
b) Como realizaría dicho clonado en el laboratorio?
PROTOCOLO SUGERIDO
La siguiente es una guía básica, de cómo podemos realizar el clonado de un gen en el laboratorio de
biología molecular.
- Obtener cultivos de las cepas que contienen los vectores necesarios, en las condiciones óptimas de
cultivo.
- Aislar y purificar el ADN plasmídico mediante el método de miniprep alcalina.
- Obtener el fragmento BamHI, conteniendo el gen de resistencia a Kmr, por digestión del pUC4K con
dicha enzima.
- Correr la mezcla de digestión en un gel de agarosa, previa inactivación de la enzima de restricción
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(realizar un esquema del resultado esperado luego de la corrida electroforética)
- Purificar el fragmento conteniendo el gen de interés del gel de agarosa, podemos utilizar algún kit
comercial para este propósito (¿En que se fundamentan estos kits para purificar ADN?).
- Paralelamente debemos digerir con la enzima adecuada, lo que produce un único fragmento lineal, los
vectores, pUC18 y de pACYC184, con extremos cohesivos BamHI (realizar un esquema del
resultado esperado luego de la corrida electroforética).
- Ligación: mezclar el fragmento que contiene el gen de resistencia al antibiótico, obtenido de pUC4K
con los plásmidos linearizados en proporciones adecuadas, añadir ligasa, una enzima que reconecta los
fragmentos de ADN, para obtener el plásmido recombinante deseado.
- Transformar con la mezcla de ligación células competentes (obtenidas mediante el protocolo de
cloruro de calcio).
-Las células transformantes deberían haber recibido un plásmido recombinante con el gen de resistencia
a kan. Los transformantes tienen que seleccionarse en un medio selectivo, pues es la única forma de
distinguirlos de las células no transformadas que no han recibido el plásmido. El procedimiento de
selección se basa en las diferentes propiedades que distinguen a las células originales de aquellas que
adquirieron el plásmido recombinante por transformación.
El método de selección es diferente para cada uno de los vectores, pUC18 y pACYC184.
Para el primero, lo ideal es realizar selección de colonias azul/blanca y presión selectiva (utilizando los
antibióticos correspondientes), de acuerdo a las propiedades que permiten seleccionar a cada tipo de
célula. Éstas se resumen en la siguiente tabla:
Tipo de célula
Kanamicina
Ampicilina
Color de colonia
sin plásmido
sensible
Sensible
blanco
con pUC18
sensible
Resistente
azul
con plásmido recombinante
resistente
Resistente
blanco
Para pACYC184 utilizamos selección por inactivación insercional, a continuación una tabla resumiendo
los fenotipos posibles
Tipo de célula
Kanamicina
Tetraciclina
Cloranfenicol
sin plásmido
sensible
Sensible
sensible
con pACYC184
sensible
resistente
resistente
con plásmido recombinante
resistente
Sensible
resistente
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Proponer posibles usos y ventajas de las nuevas construcciones realizadas.
Ejercicio N°2: Estudio de la expresión diferencial de genes
Display diferencial (DD-PCR)
Introducción:
En la actualidad, la capacidad de secuenciar genomas completos ha impulsado a la investigación
científica en la dirección de definir la función de cada uno de los genes identificados (Genómica
funcional). Para contribuir con ese objetivo se han diseñado técnicas que permiten estudiar la
expresión génica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo.
Absolutamente todas las células que componen un organismo contienen la misma información genética
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en su ADN. Sin embargo, no todos los genes se expresan en todas las células, ni lo hacen todo el
tiempo, ni durante el mismo período. Decir que un gen se está expresando significa que, a partir de ese
gen, se está transcribiendo el ARNm (mensajero) que a su vez dirigirá la síntesis de la proteína
correspondiente. Es esa expresión diferencial de genes la que define que en un mismo organismo
existan muchos tipos celulares. Por ejemplo, sabemos que un osteocito no se parece a un fibrocito. Sin
embargo, ambos derivan de un mismo tejido básico, el tejido conectivo. Esto se debe a que existen
mecanismos de regulación de la expresión génica que definen qué genes se expresan y en qué momento
en cada tipo celular.
Objetivo: Obtener todos los clones de ADNc (de longitud completa), correspondientes a los ARNm que
se transcriben diferencialmente en los osteocitos y fibrocitos.
Para ello emplearemos la técnica de Display Diferencial de ARN, también conocida como huellas
digitales de ARN (RNA fingerprinting), está basada en la amplificación por PCR de subgrupos al azar
de transcriptos a partir de 2 o más muestras. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de
función relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de técnicas
comunes de biología molecular que no requieren equipos especializados de detección y análisis.
Protocolo:
1) Purificación de ARN Total:
a) Extracción con tiocianato de guanidina, fenol y cloroformo (nombre comercial del reactivo:
TRIZOL): el tiocianato de guanidina (inactiva las RNAsas) y fenol ácido forman una única fase con la
muestra (previamente molida) y luego se agrega cloroformo para formar las dos fases (ver esquema).
b) Precipitación: etanol 96% y acetato de sodio a -70°C. La purificación de ARNm se debe realizar para
ambos tipos celulares, y todos los pasos subsiguientes se realizan en dos tubos, uno para cada muestra
en este caso.
2) Purificación de ARNm: se puede realizar mediante cromatografía de afinidad con esferas de oligodT en columna.
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3) Síntesis de ADNc: se utiliza como cebador de la transcripción reversa a un oligo dT anclado con dos
bases adicionales al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplo 5’-(T)12AC-3’). Estos
oligonucleótidos se fijan al ARNm a través de la unión de las bases adicionales, impidiendo que el
poliT “resbale” sobre distintas zonas del poli A. Esto permite hacer una primera selección de un
subgrupo de mensajeros ya que el único grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el
integrado por las moléculas que llevan las bases complementarias adyacentes al poliA.
4) Amplificación de segmentos de los transcriptos: se realiza usando como cebadores el mismo oligodT empelado para la retrotranscripción en combinación con un cebador de 10 pb (decámero) de
secuencia arbitraria (al azar).
5) Electroforesis y revelado de los fragmentos: se realiza en geles de poliacrilamida y se puede revelar
marcando uno de los cebadores con un nucleótido radiactivo o un fluoróforo o sin marcar, tiñendo
posteriormente con nitrato de plata. Los fragmentos que están presentes en una muestra y ausentes en la
otra, o aquellos que están presentes con diferentes intensidades relativas en los distintos tratamientos
experimentales, representan potenciales transcriptos de ARNm de expresión diferencial.
6) Aislamiento, re-amplificación y secuenciación de bandas de interés: las bandas de amplificación de
interés son escindidas de gel, reamplificadas con los mismos cebadores y secuenciadas.
Los fragmentos de transcriptos obtenidos representan secuencias parciales de las regiones que se
transcriben de un genoma. Se estima que el uso combinado de 12 oligos dT anclados con 20 decámeros
al azar (240 combinaciones) representaría estadísticamente a todos los ARNm originalmente presentes
en la muestra. Estas secuencias cortas se denominan etiquetas de secuencia expresadas o ESTs (por
Expressed Sequence Tags). Estas secuencias pueden ser almacenadas en bases de datos específicas.
El DD-PCR es una técnica cualitativa y/o semicuantitativa que nos permite detectar a los genes
que se están expresando diferencialmente pero necesitan de la confirmación mediante técnicas
cuantitativas (como PCR en tiempo real) que nos pueden indicar cuanto más o menos se esta
expresando el gen en diferentes circunstancias.
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transcripción reversa usando el
oligo dT anclado 5’-(T)12AC-3’.
PCR mediante el cebador anclado
5’-(T)12AC-3’ y un decamero al azar
Muestra 1
Muestra 2
Una vez confirmada la expresión diferencial de los ESTs, podemos seguir dos caminos:
a) Síntesis de los extremos 3’ y 5’ del ADNc para conocer la secuencia completa del transcripto
correspondiente. Esto se puede realizar mediante la técnica de RACE (ver ejercicio Nº 4).
b) Si disponemos de una biblioteca genómica completa de ADN de osteocitos o fibrocitos usaremos los
ADNc diferenciales para generar sondas con las que haremos una búsqueda o “screening” en la
biblioteca para aislar los clones genómicos que contengan los genes correspondientes. Una biblioteca
genómica es una colección de clones (vectores de alta capacidad, BACs YACs, etc) realizada a partir de
un conjunto de fragmentos de ADN que representan al genoma de un organismo. Una sonda es un
fragmento de ADN de secuencia complementaria al gen que se desea aislar, que se marca
radioactivamente y al hibridar, etiqueta o marca la colonia donde está clonado nuestro gen de interés.
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Ejercicio N°4: PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA EUCARIOTA A GRAN ESCALA
MEDIANTE EXPRESIÓN EN UN SISTEMA DE EXPRESION HETERÓLOGO
Introducción
La expresión de proteínas heterólogas se ha convertido en una herramienta biotecnológica muy útil y se
logra mediante la inserción y consiguiente expresión del gen que expresa la proteína de interés en un
organismo diferente, lo que implica utilizar la maquinaria de síntesis de proteínas del mencionado
organismo para producirlas. La elección del organismo para expresar la proteína de interés depende en
gran medida del organismo de origen, y de las características fisicoquímicas de la proteína a producir.
Los sistemas eucariotas (levaduras, plantas, células de animales) tienen la ventaja de que introducen
modificaciones postraduccionales como glicosilaciones, eliminación de la metionina inicial, creación de
puentes disulfuro, entre otras, de manera similar a lo que ocurre con las proteínas endógenas de origen
eucariota. Los sistemas procariotas expresan proteínas solubles o en forma de agregados intracelulares o
cuerpos de inclusión. Son generalmente mucho más fáciles para trabajar y son útiles en la mayoría de
las aplicaciones, sin embargo tienen importantes limitaciones para expresar proteínas eucariotas
completamente funcionales. Esto es debido a que no realizan sobre las proteínas la mayoría de las
modificaciones postraduccionales que realizan las células eucariotas y que permiten a las proteínas
plegarse de forma correcta para ser plenamente funcionales. Escherichia coli es uno de los modelos más
simples para la producción de proteínas recombinantes.
Una de las formas de expresión heteróloga en E. coli es la producción de proteínas de fusión, que se
forman mediante la fusión del gen de interés a otras secuencias (colas o “tags”) que codifican para
péptidos o proteínas que facilitan la purificación y localización de las proteínas heterólogas.
En el siguiente caso de aplicación, estudiaremos cómo podemos resolver un problema bastante
frecuente en un laboratorio de estudio de proteínas utilizando una posible estrategia de clonado para la
expresión heteróloga de una proteína de un hongo, Colletotrichum lindemuthianum en E.coli.
Se detectó actividad subtilisina en un extracto de micelio proveniente del hongo C. lindemuthianum y
se identificó por electroforesis (en gel de poliacrilamida) la proteína que posee dicha actividad,
determinándose un peso molecular aproximado de 27 kDa. Luego de purificarla a homogeneidad
mediante técnicas cromatográficas, se consiguió secuenciar por métodos espectrométricos (análisis de
masas) dos péptidos, obtenidos por digestión tríptica de la misma, de 12 y 18 aminoácidos ubicados
hacia los extremos N y C terminal, respectivamente.
NH2
COOH
péptidos de secuencia conocida
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Objetivo: Clonado y expresión de una subtilisina de Colletotrichum lindemuthianum en E.coli.
Protocolo sugerido:
1) Diseño y síntesis de cebadores degenerados para PCR a partir de las secuencias aminoacídicas de los
péptidos conocidos (secuenciados anteriormente). Los cebadores degenerados se diseñan teniendo en
cuenta todos los codones posibles para cada aminoácido, resultando una mezcla de cebadores con las
diferentes combinaciones.
Los cebadores degenerados se representan de la siguiente manera:
F deg: 5´-MTNTTYGGNGCNGCNGCNACN-3´
R deg: 5´-TTYSWNTTYCCNATRKCNCGN-3´
Donde, por ejemplo, M representa las bases A o C y N corresponde a cualquiera de las cuatro bases.
2) Extracción del ARN total de un cultivo de C. lindemuthianum productor de la proteína de interés y
síntesis de ADNc mediante retrotrascripción, utilizando un oligo dT como cebador.
3) Amplificación de la región central del ADNc sintetizado, mediante PCR usando los cebadores
degenerados. En este paso el producto ya será un fragmento de ADNc correspondiente a nuestro gen de
interés.
4) Clonado del fragmento de amplificación en vectores adecuados (del tipo TA) y secuenciación.
F deg
R deg
5’
3’
Amplificación y secuenciación de este fragmento de ADNc
5) Para poder expresar esta proteína en E. coli necesitamos obtener la secuencia completa del
ARNm por lo que debemos ahora usar una técnica que nos permita avanzar hacia los extremos 5’ y 3’.
Para este fin se procederá a la construcción de una biblioteca de ADNc del tipo RACE (Rapid
Amplification of ADNc Ends) que consiste en sintetizar todos los ADNc correspondientes a los
ARNm de la muestra con fragmentos de secuencia conocida (que ya vienen en un kit comercial)
adosados en los extremos 5’ y 3’.
Lo primera que se realiza es una nueva purificación de ARNm, a los cuales se liga un oligonucleótido
de ARN en el extremo 5’ mediante una ligasa de ARN. Posteriormente se sintetiza la primera hebra de
ADNc pero esta vez con un cebador oligo dT que tiene una secuencia adicional conocida en el extremo
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5’ quedando de esta manera esa secuencia conocida en el extremo 3’ de la primera hebra de ADNc
sintetizada. El resultado de estos primeros pasos será una biblioteca que contiene todos los ADNc
modificados en sus extremos (ver figura).
6) Diseño de cebadores para realizar la técnica de RACE: los cebadores 5’ y 3’ (ceban la reacción de
amplificación hacia los extremos 5’ y 3’ respectivamente) son diseñados por el usuario a partir de la
secuencia conocida (fragmento central de nuestro gen problema), clonada y secuenciada previamente
(paso 4) y serán usados en combinación con los cebadores provistos por el kit, los cuales son
complementarios a las secuencias adosadas en el paso 5. Se realizan dos reacciones por separado, una
para obtener el extremo 5’ y otra para el extremo 3’. Al igual que en los pasos anteriores, el producto de
cada una de estas reacciones debe ser clonado en un vector adecuado, y secuenciado.
7) Las secuencias obtenidas en el paso anterior serán ensambladas con el fragmento central.
Esquema de amplificación de los extremos 5’ y 3’:
Secuencia conocida
Fragmentos adosados por la técnica RACE, de secuencia conocida
5’
3’
Cebadores diseñados por el usuario
Cebadores complementarios a las secuencias adosadas (Kit GENRACER de Invitrogen)
5’
'
Fragmentos 5’ y 3’ amplificados cuya secuencia
será ensamblada con la anterior para tener la secuencia completa del ARNm
(ADNc)
3’
Secuencia completa del ADNc del transcripto maduro:
atgcacttctcgaccctttttggcgccgcggctactgctgctctcgctggcagcacgaacgcaagg
tacgtcgccggcggctccttgggcccttgacacagacaccccagactgacacaactcacagccctc
tcgcccgtcgccaggttcccgtgggcacacccatcctccagtgcacccagcctggtctggttgccc
tgacctacgacgacggtcccttcaccttcaccccgcagctcctcgacatcttgaagcagaacgacg
tcagggcgacctttttcgtcaacggcaacaactgggccaacatcgaggccggatccaaccccgaca
ccatccgccgcatgcgcgccgacggccacctcgtcggctctcacacgtacgctcacccggacctca
acacgctctcctccgcggaccgcatctcccagatgcggcacgtcgaggaggctacccgccgcatcg
acggcttcgcgcccaagtacatgcgcgcgccctacctgtcgtgcgacgcgggctgccagggcgacc
tcggcggcctcggataccacatcatcgacaccaacctcgacaccaaggactacgagaacaacaagc
ccgagaccacgcacctctcggccgagaagttcaacaacgagctgagcgccgacgtcggcgccaaca
gctacattgtcctctcgcacgacgtccacgagcagacggtcgtctccctcacgcagaagctgattg
acacgctcaagagcaagggctaccgcgccgtcaccgtcggcgagtgcctcggcgacgccccggaga
actggtacaaggcgtaa
8) Una vez obtenida la secuencia completa del ADNc del transcripto maduro se procede al clonado del
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mismo en un vector de expresión que permita sintetizar una proteína de fusión marcada en el extremo
C terminal con una cola de 6 residuos de Histidina (6xHis-tag).
Para esto se seguirá el siguiente protocolo:
Diseño de cebadores de PCR que hibriden en los extremos de la secuencia del ADNc de nuestro gen de
interés: se deberá tener en cuenta el vector de expresión a usar, si queremos fusionar un tag de histidinas
en un extremo de la proteína, y ese tag (o sea el fragmento de ADN que codifica para los seis residuos
de histidina, se encuentra en el vector de clonado y expresión. Se deberá excluir el codón de
terminación del ADNc para que la traducción continúe y se sintetice el tag de histidinas fusionado a la
proteína en el extremo C terminal. La traducción terminará en este caso gracias a un codón de
terminación ubicado también en el vector luego de la secuencia codificante del tag. Es conveniente
introducir en los extremos de los cebadores secuencias de sitios de corte de enzimas de restricción (una
enzima diferente a cada extremo) que produzcan extremos cohesivos y permitan orientar la ligación del
ADNc en el vector (que en su MCS tendrá los mismos sitios de corte).
El plásmido recombinante obtenido será introducido por transformación a una cepa de E.coli: se
deberá elegir cuidosamente la cepa de E. coli a utilizar dependiendo de la proteína que deseamos
expresar. Existen actualmente cepas con la capacidad aumentar la síntesis de proteínas heterólogas en
las cuales algunos aminoácidos están codificados por codones que no son de uso frecuente en E. coli, y
esto se debe a la presencia de plásmidos multicopia compatibles que producirán los ARN de
transferencia de dichos codones. Asimismo, existen nuevas cepas con una mayor capacidad de
introducir algunas modificaciones postraduccionales, por ejemplo formación de puentes disulfuro,
cuando estas son importantes para la funcionalidad de la proteína a expresar.
9) Una vez expresada la proteína recombinante en E. coli, se procederá a su extracción y purificación.
Esto último puede realizarse mediante una cromatografía de afinidad usando una columna de Ni2+-NTA
(níquel-ácido nitrilotriacético) agarosa la cual une específicamente el His-tag que posee la proteína
recombinante.
Finalmente cabe señalar que en el vector, entre la secuencia del tag de histidinas y la secuencia de la
proteína a expresar, muchas veces se encuentra también codificado un sitio de clivaje o corte para
alguna proteasa que luego de la purificación, permitirá liberar la proteína recombinante del His-tag.
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Gen sin codón de terminación
Codón de
terminación
en el vector
terminación
ligación
Transformación en E. coli
Expresión y purificación
Sitio de
corte de
proteasa
Subtilisina con tag de histidinas
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