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Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html Inma Martín-Burriel: [email protected] Contenidos • Introducción • Genómica estructural – Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio – Aplicaciones de los polimorfismos • Genómica funcional Definiciones • Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc. • Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome. Historia de la Genómica • 1977: Secuenciación completa del genoma de 5.400 nt del virus ØX174 (Sanger et al.) • Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos. 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger Pirosecuenciación Secuenciación a gran escala (NGS) GENÓMICA Estructural Funcional Secuencia descubrimiento genes, localización Función de los genes Regulación Comparativa Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas. Desarrollo de organismos modelo de enfermedades Genómica Caracterización molecular de genomas completos • ESTRUCTURAL: – Caracterización de la naturaleza física de genomas completos • FUNCIONAL: – Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Genómica estructural Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía Clasificación del DNA eucariota DNA eucariótico Genes funcionales de copia única DNA de secuencia repetida DNA separador Secuencias sin función conocida Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes Repeticiones heterocromatina Del centrómero Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) VNTR Familias de genes dispersos Secuencias derivadas De transposiciones Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones Polimorfismo genético Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1% • Polimorfismo bioquímico: – Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas • Polimorfismos del DNA: http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Poly morphisms.html – Variaciones presentes en la secuencia de bases • Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales • Polimorfismos del número de http://www.chinaphar.com/1671-4083/25/986.htm repeticiones en tándem http://www.systemsbiology.org/technology/data_generation/Microsatellite Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern 1-4pb Elec. Acrilamida Secuenciación Microsatélites pb Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem • DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat – Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) – Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) – Herencia mendeliana codominante Alelo 1 Alelo 2 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA • Visualización de los microsatélites Genotipado: Secuenciación: ACGT • Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: – Expansión de microsatélites de trinucleótidos: • Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n • Distrofia miotónica (DM) (CTG)n • Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n • Ataxia de Friedreich (FA) • Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) – Expansión de tetranucleótidos: DM2 – Expansión de pentanucleótidos: SCA10 Enfermedades humanas se han creado animales modelo Secuencias de DNA dispersas ¿DNA basura? ¿DNA egoista? - ¿Regulación de la expresión? - ¿Puntos de recombinación? - Control de la segregación de cromosomas (centrómeros) - Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros) ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements: - Protein or non-coding RNA - Protein binding - Specific chromosome structure Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales • Variación de un nucleótido en una posición determinada. • Frecuencia:1/1000pb • También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) 1. Cambios de bases: a. Transiciones: i. ii. b. Purina Purina: Pirimidina Pirimidina: Transversiones i. ii. PurinaPirimidina: Pirimidina Purina TACGAGCTA TACGGGCTA Alelo 1 Alelo 2 A G Purinas T C Pirimidinas • SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: – Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb) – 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano – Dos posibles alternativas en cada individuo – Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) – Fácil estandarización – Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética RFLPs-SNP • Origen: mutaciones puntuales • Variabilidad: 2 alelos • Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador • RFLPs – Detección mediante enzimas de restricción: • Southern Blot • PCR+RFLP – Normalmente determinados en exones • Detección de los SNP: – RFLP: • Southern Blot • PCR + RFLP – – – – – Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real… Detección de mutaciones puntuales RFLP: Alelo 1 Alelo 2 Aat II TGGACGTCT TGGATGTCT Sonda Alelo 1 MCL1 Alelo 2 Detección de mutaciones puntuales Minisequencing Marcador del DNA (genético) • Gen o secuencia de DNA cuya localización en el genoma se conoce. • Características: – Tienen que ser polimórficos (en la población). – Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES. – Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES. Tipos de marcadores • • • • • • • • • • • SNP (or Single nucleotide polymorphism) RFLP (or Restriction fragment length polymorphism) RAD markers (or Restriction site associated DNA markers) AFLP (or Amplified fragment length polymorphism) VNTR (or Variable number tandem repeat) Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat) STR (or Short tandem repeat) SSLP (or Simple sequence length polymorphism) RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA) SFP (or Single feature polymorphism) DArT (or Diversity Arrays Technology) • Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: – Diagnóstico genético – Identificación individual – Construcción de los mapas génicos – Ligamiento con fenotipos Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos X Gen alterado Marcador polimórfico Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado Identificación individual: •Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) •Análisis de marcadores microsatélites •PCR, secuenciación • Fingerprinting (minisat.) Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos Detección mediante RFLP + Southern • Mapas del genoma: – Mapa genético • Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico • Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis – Mapa físico • Posición exacta de un gen • Distancia entre marcadores determinada por nº de pb Secuenciación de genomas Construcción de librerías Secuenciación por síntesis PCR en puente Análisis bioinformático (NGS) - Preprocesado de las secuencias Control de calidad Alineamiento de secuencias: formación de contigs Alineamiento con las referencias Búsqueda de variantes • Asociación: Ligamiento con fenotipos • Ligamiento: – Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) – Análisis de 500 pols – Regiones candidatas y acotamiento de la región – Alelos raros de alto riesgo – Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos – Facilidad para la obtención de muestras – Necesidad de analizar miles de marcadores – Alelos de acción modesta en enfermedades comunes Secuenciación del Exoma - - Alineamiento con secuencias de referencia Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8) - Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante - Riesgo de falsos negativos Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres) Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales Genómica funcional • Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional • Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas • Identificación de su función • Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica Chips de DNA • Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos • En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos) • Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) • Se miden variaciones en la expresión de los tejidos RNAseq Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq. Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015 © The Author(s) 2010. Published by Oxford University Press. Aplicaciones de la Genómica • Conocimiento y comprensión de procesos patológicos • Precisión de diagnóstico: – Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) – “Farmacogenómica” respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia • Evaluación correcta del riesgo genético: – Predicción de la agresividad tumoral • Prevención conocido el riesgo genético – Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,.. Implicaciones del conocimiento del genoma • Análisis de recién nacidos • Detección de portadores • Desarrollo de terapias: – Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional – Terapia basada en la genética: • Diseño de nuevas drogas • Tratamientos basados en las bases moleculares • Elección del tratamiento • Identificación de genes con interés en producción. Videos de genómica Microarray: http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM& feature=related http://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6Jgcg&feature=related Exon Sequencing http://www.youtube.com/watch?v=ZY_vPbpPnrc&s ns=em