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Genética Médica – Tema 2
Tema 2
Estructura y organización del
genoma humano: genes,
familias génicas y
polimorfismos del DNA
Bibliografía:
Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp376-378
Tamarin RH (1996) pp203-220, pp414-419
Klug WS y Cummings MR (1999) pp277-298, pp528-539
Inma Martín Burriel
Curso 2008-09
• Estructura y organización del Genoma
• Polimorfismos genéticos:
– Variaciones en el número de repeticiones
– Mutaciones puntuales
• Aplicaciones de los polimorfismos
genéticos en Medicina
Genética Médica. Tema 2
Estructura y organización del genoma
Genoma
Estructura en doble hélice del DNA:
DNA eucariótico
Genes funcionales
de copia única
DNA de secuencia
repetida
DNA separador
Secuencias sin función
conocida
Secuencias funcionales
Secuencias funcionales
No codificantes
Repeticiones heterocromatina
Del centrómero
Familias de genes codificantes
(y pseudogenes asociados)
VNTR
Familias de genes dispersos
Secuencias derivadas
De transposiciones
Familias de genes en tándem
Transposones
Retrotransposones
10pb /vuelta
Destrógira
Bases apiladas perpendicularmente
Genoma
Genes de copia única
Gen eucariota
DNA eucariótico
Genes funcionales
de copia única
Inicio
transcripción
DNA de secuencia
repetida
DNA separador
Promotor
Exón 1
Intrón 1
Intrón 2
Exón 2
Exón 3
Secuencias sin función
conocida
Secuencias funcionales
Secuencias funcionales
No codificantes
Familias de genes codificantes
(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
Región
reguladora
aguas arriba
Repeticiones heterocromatina
Del centrómero
5’UTR
Región reguladora
interna
Intrón 3
Fin
transcripción
Exón 4
Región
reguladora
aguas abajo
Unidad de transcripción
VNTR
Secuencias derivadas
De transposiciones
Familias de genes en tándem
Transposones
Retrotransposones
• Codifican para una única proteína
• Se encuentran en una única posición del
genoma (un individuoÆ 2 copias)
1
Genoma
Familias génicas
• Familia génica:
DNA eucariótico
Genes funcionales
de copia única
DNA de secuencia
repetida
– “grupo de genes de un genoma que derivan
de un ancestro común”
DNA separador
Secuencias sin función
conocida
Secuencias funcionales
Secuencias funcionales
No codificantes
Familias de genes codificantes
(y pseudogenes asociados)
Familias de genes dispersos
¾Familia de las globinas (beta globina):
ƒ 5 loci en HSA11
ƒ Orden según la expresión en el desarrollo
ƒ Posición y longitud de intrones similar
ƒ Evolución concertada
Repeticiones heterocromatina
Del centrómero
VNTR
Secuencias derivadas
De transposiciones
Familias de genes en tándem
Transposones
Retrotransposones
Familias de genes en tándem
– Genes cuyos productos son requeridos
en grandes cantidades:
• Organizador Nucleolar (NO):
– Localizado en los brazos cortos de cromosomas
acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque
pueden traslocarse
– Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S
+ 28S)
• Genes del RNAt:
– 50 sitios cromosómicos
– 10 a 100 copias/sitio
• Genes de las Histonas
– Se mantiene la identidad de secuencia
Genoma
Familia de genes dispersos
• Familias de genes dispersos:
–
–
–
–
–
–
–
Actinas: de 5 a 30 genes
Queratinas: + de 20
Cadena pesada de la Miosina: 5-10
Tubulinas: 3-15
Globinas: hasta 5
Región variable de las inmunoglobulinas: 500
Histonas: 100-1000
• Las secuencias entre genes pueden variar
• Genes homólogos pueden tener funciones
diferentes
• Algunos pierden la función Æ pseudogenes
DNA eucariótico
Genes funcionales
de copia única
DNA de secuencia
repetida
DNA separador
Secuencias sin función
conocida
Secuencias funcionales
Secuencias funcionales
No codificantes
Familias de genes codificantes
(y pseudogenes asociados)
Repeticiones heterocromatina
Del centrómero
VNTR
Familias de genes dispersos
Secuencias derivadas
De transposiciones
Familias de genes en tándem
Transposones
Retrotransposones
2
Variación en el número de
repeticiones
DNA repetido
Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem
¿DNA basura?
- ¿Regulación de la expresión?
- ¿Mecanismo de reparación?
- ¿Puntos de recombinación?
Entrecruzamiento desigual
DNA repetido en tándem
• DNA satélite:
– repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y
algunas Mb)
– DNA no transcrito
– Regiones de heterocromatina, principalmente en
centrómeros (DNA alfoide)
Fallo en la alineación de cadenas
de DNA en la replicación
DNA repetido en tándem
• DNA minisatélite (VNTR)
–
–
–
–
Repeticiones de tamaño moderado (60pb)
Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros
Normalmente no se transcriben
Tipos:
• DNA minisatélite hipervariable
• DNA telomérico
Función DNA telomérico:
Solucionar los problemas de
replicación de los extremos
del cromosoma
Modelos de organización centromérica
DNA repetido en tándem
• DNA microsatélite (STR):
– Short Tandem Repeat
– Pequeñas formaciones (generalmente <
150pb) de repeticiones en tándem de
secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)
– Repartidas por todo el genoma, normalmente
en intrones. Frecuentes y altamente
polimóficos (número medio de alelos 10)
– Herencia mendeliana codominante
Alelo 1
Alelo 2
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
DNA repetido en tándem
VNTR
Tamaño
(Kb)
Unidad
repetición
Método detección
Satélites
100-500
20 kb
Centrifugación ClCs
Elec. campos
pulsados
Minisatélites
(VNTR)
0,1-20
20-40 pb
Elec. agarosa
1-4pb
Elec. Acrilamida
Secuenciación
Microsatélites pb
(STR)
3
DNA repetido en tándem
Genética Médica
Tamaño
(Kb)
Unidad
repetición
Método detección
Satélites
100-500
20 kb
Centrifugación ClCs
Elec. campos
pulsados
Minisatélites
(VNTR)
0,1-20
20-40 pb
14-100 pb
Elec. agarosa
1-4pb
Elec. Acrilamida
Secuenciación
VNTR
Microsatélites pb
(STR)
• Polimorfismo genético:
– Cuando un locus presenta al menos 2 alelos
y la frecuencia alélica del más raro es > 1%
Æ locus polimórfico.
– El polimorfismo (la variación) garantiza la
adaptación de una especie a condiciones
ambientales cambiantes, a expensas de
producir mutaciones graves causantes de una
enfermedad.
Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población
DNA minisatélite hipervariable
DNA minisatélite hipervariable
Detección del polimorfismo: RFLP + Southern (hibridación
con sonda)
• Localización dispersa en todos los
cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud,
de repeticiones en tándem cortas
• Secuencia repetida común (core):
GGGCAGGAXG
• Son muy polimórficas
• Se encuentran en intrones
• Estas secuencias se han empleado como
“huellas dactilares”
INDIVIDUO 2
4
5
6
7
8
9
10
1
1’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
2
2’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
INDIVIDUO 1
3
1
2
3
4
3’
1
2
3
4
1
1’
2
2’
3
3’
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
3
4
5
VNTRs
11
INDIVIDUO 1
INDIVIDUO 2
4
DNA minisatélite hipervariable
• Funciones de los VNTRs:
– Regulación de puntos activos de
recombinación
– Control de segregación de los cromosomas
(por su localización centromérica)
– Estabilización de los cromosomas durante la
replicación (por su localización en telómeros)
– Podrían dar estabilidad a los cromosomas
• Aplicaciones:
– Identificación individual (medicina forense)
DNA microsatélite
Detección del
polimorfismo:
PCR
• Localización dispersa en
todos los cromosomas
• Se encuentran en intrones
y DNA espaciador,
raramente en secuencia
codificante.
• A veces asociados a
secuencias repetidas
dispersas por el genoma
(SINES o LINES).
• Secuencia repetida de 1 a
4 pb.
• Las secuencias
flanqueantes a la
repetición son únicas.
• Son muy polimórficas.
DNA microsatélite
DNA microsatélite
• Visualización de los microsatélites:
– http://www.unizar.es/lagenbio/recursos/
Secuenciación:
ACGT
Genotipado:
• Implicaciones de las secuencias microsatélites en
medicina:
– Expansión de microsatélites de trinucleótidos:
• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n
• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n
• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n
• Ataxia de Friedreich (FA)
• Nueve formas de ataxia espinocerebelar
(SCA)
– Expansión de tetranucleótidos: DM2
– Expansión de pentanucleótidos: SCA10
5
DNA microsatélite
DNA microsatélite
• Mecanismos de patogeneicidad de los
microsatélites:
• Aplicaciones:
– Enfermedades de herencia recesiva ligada al X Æ
expansión de tripletes que interfiere la transcripción
del gen mutado (no proteína)
– Enfermedades con herencia dominante Æ expansión
de tripletes produce una proteína alterada
– Enfermedades con herencia dominante producidas
por expansiones en regiones no codificantes Æ
expansiones en el ARN Æ función celular alterada?
– Identificación individual
– Análisis evolutivo de poblaciones
– Diagnóstico directo en enfermedades
genéticas causadas por expansión de
trinucleótidos
– Diagnóstico indirecto de enfermedades
genéticas:
• Ligamiento entre microsatélites polimórficos y
genes causantes de enfermedad.
Diagnóstico individual
Diagnóstico directo
Ejemplo: Diagnóstico corea de Huntington
Nº repet
Clasificación
E.H.
<27
Normal
No
27-35
Intermedio
No
36-39
Penetrancia I
+/-
>39
Penetrancia T
Si
45
Análisis de 15 marcadores
microsatélites
1
2
22
20
18
3
4
5
6
16
7
12
1
Diagnóstico indirecto
Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas
Ms3
Etiología
Microsatélites
errores de DNAp
(short tandem
repeats)
slippage
Minisatélites
entrecruzamiento
no equilibrado
VNTRs
?
?
CFTR*
222
152
1
220
220
154
150
125
125
123
CFTR* CFTR*
2
220
220
154
150
CFTR*
3
127
129
?
?
220
222
154
152
4
123
129
?
?
218
220
152
150
5
5
6
7
127
129
?
?
218
222
152
152
Detección
PCR
Frecuencia genómica
1/30.000 bp
STRs
(variable no of
tandem repeats)
123
4
Resumen de polimorfismos genéticos
Fibrosis quística
Ms1
125
3
HSA7
CFTR
Ms2
127
2
Southern
variable, baja
unequal crossing over
RFLPs
mutaciones
SNPs
mutaciones
Southern-PCR
baja
(restriction fragment
length polymorphisms)
PCR
1/1000 bp
(Single nucleotide
Polymorphisms)
218
152
6
6
Metodología para determinar
mutaciones puntuales
Mutaciones Puntuales
Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales:
• Variación de un nucleótido en una posición determinada.
• Frecuencia:1/1000pb
• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
TACGAGCTA
TACGGGCTA
Alelo 1
Alelo 2
En regiones codificantes:
¾Mutaciones con cambio aminoacídico
GCA (Ala) Æ GTA (Val)
¾Mutaciones sin sentido
AAA (Lys) Æ TAA (stop)
¾Mutaciones silentes
GCA (Ala) Æ GCC (Ala)
Mutaciones:
- Cambio de base
- Inserción
- Deleción
• SNP:
• RFLPs:
– Mutaciones puntuales
detectable por un variado
número de técnicas:
– Mutaciones puntuales que se
localizan en una secuencia
reconocida por una enzima de
restricción.
– Detección mediante enzimas
de restricción y Southern
Blotting
– PCR + enzima de restricción
– Baja variabilidad (2 alelos).
– Localización:
• Como los RFLP (si
producen/eliminan un
sitio de corte)
• Secuenciación
• Minisecuenciación
• Sondas específicas
• SSCPs
• PCR en tiempo real…
• Exones
• Genes de copia única
– Baja variabilidad (2
alelos)
– Localización:
• Exones
• DNA de copia única
RFLPs
Diagnóstico genético por RFLPs
RFLP
Polimorfismo
debido
mutaciones puntuales
(Restriction fragment lenght polymorfism)
Determinación
mediante Southern
Ms t I I
RE
RE
RE
RE
A
RE
a
A
a
AA Aa
Aa
aa
Determinación de PCR-RFLPs
Aa
AA
aa
aa
Aa
aa
Aa
AA
aa
a
En el gen de la globina normal la
secuencia correspondiente al 5th7th aminoácido del péptido betaglobina es CCTGAGGAG que es
reconocida por la enzima de
restricción MstII. En la variable
patológica de la anemia falciforme,
eritrocitos en hoz-sickle, se produce
una mutación puntual de A a T,
lo que invalida el reconocimiento
por MstII. En la correspondiente
digestión enzimática se genera un
único fragmento de 1,3 kb en lugar
de los dos fragmentos de 0,2 kb y
1,1 kb propios del gen normal. Los
diferentes fragmentos se detectan
por técnica de Southern blotting
Genética Médica
Según metodología de detección
Mutación:
Alelo 1
Alelo 2
Aat II
• RFLPs:
TGGACGTCT
TGGATGTCT
PCR:
TGGACGTCT
TGGAGGTCT
Fragmento PCR
– Mutaciones puntuales que se
localizan en una secuencia
reconocida por una enzima de
restricción.
– Detección mediante enzimas
de restricción y Southern
Blotting
– PCR + enzima de restricción
– Baja variabilidad (2 alelos).
– Localización:
• Exones
• Genes de copia única
• SNP:
– Mutaciones puntuales
detectable por un variado
número de técnicas:
• Como los RFLP (si
producen/eliminan un
sitio de corte)
• Secuenciación
• Minisecuenciación
• Sondas específicas
• SSCPs
• PCR en tiempo real…
– Baja variabilidad (2
alelos)
– Localización:
Electroforesis
PCR
• Exones
• DNA de copia única
Alelo 1 Alelo 2
7
SNPs
• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:
– Presentación muy frecuente (1/300 pb)
– 10 a 30 millones de SNP en el genoma
humano
– Dos posibles alternativas en cada individuo
– Herencia es muy estable (baja tasa de
mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)
– Fácil estandarización
– Aplicaciones en la determinación de
enfermedades y en farmacogenética
Mutaciones puntuales
• Implicaciones de las mutaciones puntuales en
medicina:
– Pueden originar diferencias muy sutiles o
provocar la muerte
– Mutaciones en líneas germinales:
• Neurofibromatosis (dominante)
• Acondroplasia (dominante)
• Hemofilia (Factor VII, ligado al X)
– Mutaciones somáticas:
• Cáncer: mutaciones de protooncogenes
– Origen: fallo en la reparación del DNA o
agentes mutágenos
Secuenciación:
Determinación de SNPs
MCL1
PCR en tiempo real con sondas
alelo específicas:
Minisecuenciación:
Genética Médica
• Aplicaciones de los polimorfismos del
DNA:
– Identificación individual (Medicina
forense)
– Construcción de los mapas génicos
– Ligamiento con fenotipos
Ejemplo: Determinación de
portadores de Fibrosis Quística
Nora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de
portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante
análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen
CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: 648-654
8