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Tema 12: Genómica
Griffiths AJ et al., (2000)
Klug WS y Cummings MR (2006)
Links to Animal Genomic Research web site
and Database Resources
http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html
Inma Martín-Burriel: [email protected]
Contenidos
• Introducción
• Genómica estructural
– Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de
estudio
– Aplicaciones de los polimorfismos
• Genómica funcional
Definiciones
• Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al
estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y
el origen de los genomas. Es una de las áreas más
vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos
derivados de distintas ciencias como son: biología molecular,
bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc.
• Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the
genomes of organisms. The field includes intensive efforts to
determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale
genetic mapping efforts. The field also includes studies of
intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis,
pleiotropy and other interactions between loci and alleles within
the genome.
Historia de la Genómica
• 1977: Secuenciación completa del
genoma de 5.400 nt del virus ØX174
(Sanger et al.)
• Desarrollo de métodos de
secuenciación: secuencia de
genomas eucarióticos.
1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert
Métodos de terminación de la cadena o
método de Sanger
Pirosecuenciación
Secuenciación a gran
escala (NGS)
GENÓMICA
Estructural
Funcional
Secuencia
descubrimiento
genes, localización
Función de los
genes
Regulación
Comparativa
Compara genomas de diversas especies para elucidar las
relaciones funcionales y evolutivas.
Desarrollo de organismos modelo de enfermedades
Genómica
Caracterización molecular de genomas completos
• ESTRUCTURAL:
– Caracterización de la
naturaleza física de
genomas completos
• FUNCIONAL:
– Caracterización del
proteoma y de los
patrones globales de
expresión génica
Genómica estructural
Caracterización de la naturaleza física de genomas:
- Polimorfismos del DNA
- Cartografía
Clasificación del DNA eucariota
DNA eucariótico
Genes funcionales
de copia única
DNA de secuencia
repetida
DNA separador
Secuencias sin función
conocida
Secuencias funcionales
Secuencias funcionales
No codificantes
Repeticiones heterocromatina
Del centrómero
Familias de genes codificantes
(y pseudogenes asociados)
VNTR
Familias de genes dispersos
Secuencias derivadas
De transposiciones
Familias de genes en tándem
Transposones
Retrotransposones
Polimorfismo genético
Polimorfismo: Variante genética que aparece en la
población con una frecuencia > 1%
• Polimorfismo bioquímico:
– Detección de variación al nivel del
producto del gen: proteínas, enzimas
• Polimorfismos del DNA:
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Poly
morphisms.html
– Variaciones presentes en la secuencia de
bases
• Polimorfismos producidos por
mutaciones puntuales
• Polimorfismos del número de
http://www.chinaphar.com/1671-4083/25/986.htm
repeticiones en tándem
http://www.systemsbiology.org/technology/data_generation/Microsatellite
Polimorfismos debidos a variaciones en el
número de repeticiones de DNA en tándem
VNTR
Tamaño
(Kb)
Unidad
repetición
Método detección
Satélites
100-500
20 kb
Centrifugación ClCs
Elec. campos
pulsados
Minisatélites
0,1-20
20-40 pb
Elec. Agarosa
Southern
1-4pb
Elec. Acrilamida
Secuenciación
Microsatélites pb
Polimorfismos debidos a variaciones en el
número de repeticiones de DNA en tándem
• DNA microsatélite (STR):
– Short Tandem Repeat
– Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de
repeticiones en tándem de secuencias muy simples
(de 1 a 4 nucleótidos)
– Repartidas por todo el genoma, normalmente en
intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número
medio de alelos 10)
– Herencia mendeliana codominante
Alelo 1
Alelo 2
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
• Visualización de los microsatélites
Genotipado:
Secuenciación:
ACGT
• Implicaciones de las secuencias microsatélites en
patologías:
– Expansión de microsatélites de trinucleótidos:
• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n
• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n
• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n
• Ataxia de Friedreich (FA)
• Nueve formas de ataxia espinocerebelar
(SCA)
– Expansión de tetranucleótidos: DM2
– Expansión de pentanucleótidos: SCA10
Enfermedades humanas se han creado animales modelo
Secuencias de DNA dispersas
¿DNA basura? ¿DNA egoista?
- ¿Regulación de la expresión?
- ¿Puntos de recombinación?
- Control de la segregación de
cromosomas (centrómeros)
- Estabilización de los cromosomas
en la replicación (telómeros)
ENCODE: Encyclopedia of
DNA Elements:
- Protein or non-coding RNA
- Protein binding
- Specific chromosome
structure
Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales
• Variación de un nucleótido en una posición determinada.
• Frecuencia:1/1000pb
• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
1.
Cambios de bases:
a.
Transiciones:
i.
ii.
b.
Purina Purina:
Pirimidina Pirimidina:
Transversiones
i.
ii.
PurinaPirimidina:
Pirimidina Purina
TACGAGCTA
TACGGGCTA
Alelo 1
Alelo 2
A
G
Purinas
T
C
Pirimidinas
• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:
– Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)
– 10 a 30 millones de SNP en el genoma
humano
– Dos posibles alternativas en cada individuo
– Herencia es muy estable (baja tasa de
mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)
– Fácil estandarización
– Aplicaciones en la determinación de
enfermedades y en farmacogenética
RFLPs-SNP
• Origen: mutaciones puntuales
• Variabilidad: 2 alelos
• Localización: exones, intrones, regiones reguladoras,
DNA espaciador
• RFLPs
– Detección mediante
enzimas de
restricción:
• Southern Blot
• PCR+RFLP
– Normalmente
determinados en
exones
• Detección de los SNP:
– RFLP:
• Southern Blot
• PCR + RFLP
–
–
–
–
–
Secuenciación
Minisecuenciación
Sondas específicas
SSCPs
PCR en tiempo real…
Detección de mutaciones puntuales
RFLP:
Alelo 1
Alelo 2
Aat II
TGGACGTCT
TGGATGTCT
Sonda
Alelo 1
MCL1
Alelo 2
Detección de mutaciones puntuales
Minisequencing
Marcador del DNA (genético)
• Gen o secuencia de DNA cuya
localización en el genoma se conoce.
• Características:
– Tienen que ser polimórficos (en la población).
– Si es un gen no interesa la función sino las
variaciones en el DNA (que pueden reflejarse
en diferencias funcionales) (ej. Grupo
sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES.
– Las variaciones en un segmento de DNA se
transmiten según las reglas Mendelianas de
codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS
MARCADORES.
Tipos de marcadores
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
SNP (or Single nucleotide polymorphism)
RFLP (or Restriction fragment length polymorphism)
RAD markers (or Restriction site associated DNA markers)
AFLP (or Amplified fragment length polymorphism)
VNTR (or Variable number tandem repeat)
Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat)
STR (or Short tandem repeat)
SSLP (or Simple sequence length polymorphism)
RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA)
SFP (or Single feature polymorphism)
DArT (or Diversity Arrays Technology)
• Aplicaciones de los polimorfismos
del DNA:
– Diagnóstico genético
– Identificación individual
– Construcción de los mapas génicos
– Ligamiento con fenotipos
Diagnóstico genético indirecto:
Análisis de marcadores genéticos
X
Gen alterado
Marcador polimórfico
Mutación puntual
Microsatélite
RFLP
Deleción
Inserción
Genotipo del marcador  Genotipo del gen dañado
Identificación individual:
•Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos)
•Análisis de marcadores microsatélites
•PCR, secuenciación
• Fingerprinting (minisat.)
Microsatélites
Minisatélites
Control de filiación
Control de libros genalógicos
Detección mediante RFLP + Southern
• Mapas del genoma:
– Mapa genético
• Posiciones relativas de los genes entre si,
sin anclaje físico
• Distancia entre marcadores determinada por
la frecuencia de recombinación en la meiosis
– Mapa físico
• Posición exacta de un gen
• Distancia entre marcadores determinada por
nº de pb
Secuenciación de genomas
Construcción de librerías
Secuenciación por síntesis
PCR en puente
Análisis bioinformático (NGS)
-
Preprocesado de las secuencias
Control de calidad
Alineamiento de secuencias: formación de contigs
Alineamiento con las referencias
Búsqueda de variantes
• Asociación:
Ligamiento con fenotipos
• Ligamiento:
– Identificación de regiones
del genoma con un nº de
alelos compartidos en
individuos afectados > al
esperado (en familias)
– Análisis de 500 pols
– Regiones candidatas y
acotamiento de la región
– Alelos raros de alto riesgo
– Análisis de individuos
afectados no
emparentados e
identificación de alelos
compartidos
– Facilidad para la
obtención de muestras
– Necesidad de analizar
miles de marcadores
– Alelos de acción
modesta en
enfermedades
comunes
Secuenciación del Exoma
-
-
Alineamiento con secuencias de referencia
Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8)
- Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante
- Riesgo de falsos negativos
Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los
fragmentos cromosómicos heredados de los padres)
Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales
Genómica funcional
• Los datos de la secuenciación a
gran escala son el punto de partida
de la genómica funcional
• Búsqueda de ORF en secuencias de
DNA desconocidas
• Identificación de su función
• Empleo de chips (microarrays) de
DNA para estudio de regulación
génica
Chips de DNA
• Muestras de DNA ordenadas, unidas a
un chip de cristal del tamaño de un
cubreobjetos
• En un chip puede haber miles de
muestras (cDNA de genes conocidos)
• Los chips se exponen a muestras de
mRNA marcados procedentes de
distintos tejidos (distinta fase de
desarrollo, tumoral vs normal, etc.)
• Se miden variaciones en la expresión de
los tejidos
RNAseq
Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq.
Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015
© The Author(s) 2010. Published by Oxford University Press.
Aplicaciones de la Genómica
• Conocimiento y comprensión de procesos
patológicos
• Precisión de diagnóstico:
– Clasificación más fina (cáncer de colon, piel)
– “Farmacogenómica”  respuesta individual a
tratamientos, elección de quimioterapia
• Evaluación correcta del riesgo genético:
– Predicción de la agresividad tumoral
• Prevención conocido el riesgo genético
– Comenzar planes de vigilancia en riesgo de
cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..
Implicaciones del conocimiento del genoma
• Análisis de recién nacidos
• Detección de portadores
• Desarrollo de terapias:
– Terapia génica: reemplazar un gen alterado
por el gen funcional
– Terapia basada en la genética:
• Diseño de nuevas drogas
• Tratamientos basados en las bases moleculares
• Elección del tratamiento
• Identificación de genes con interés
en producción.
Videos de genómica
Microarray:
http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&
feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6Jgcg&feature=related
Exon Sequencing
http://www.youtube.com/watch?v=ZY_vPbpPnrc&s
ns=em