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ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA “IDENTIFICACIÓN DE REARREGLOS CROMOSÓMICOS ASOCIADOS CON TUMORES SÓLIDOS A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA (FFPE) Y DE TEJIDOS EN CONGELACIÓN (TOC), MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA (FISH)”. Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA ELABORADO POR: SULLY ESTEFANÍA MÁRQUEZ AGUILAR INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y METODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS INTRODUCCIÓN Control fisiológico en la proliferación celular Caretakers MLH1 (Lynch syndrome) Gatekeepers PTEN Landscapers Activación oncogénica Mecanismos de inactivación: • Metilación del ADN y sellado genómico • Inestabilidad cromosómica (CIN). Fuente. http://www.kmle.co.kr/search.php?Search=Oncogene.&Page=4 Fuente: http://www.scq.ubc.ca/how-to-catch-a-cancer/ INTRODUCCIÓN Cuatro tipos principales: 1. Carcinomas (mama) 2. Sarcomas (tejido conectivo ) 3. Leucemias 4. Linfomas Crecimiento anormal (alteraciones ADN ) INICIACIÓN PROMOCIÓN Alteración de procesos celulares fuertemente regulados: D, P, MCP PROGRESIÓN Fuente: http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/aboutcancer/what-is-cancer/cells/the-cancer-cell Dividirse rápidamente Benigno Maligno PROPIEDADES • • • • • Indiferenciación Habilidades proliferativas Checkpoints Reparación del ADN Inmortalidad, angiogénesis, metabolismo alterado, inestabilidad genómica • Señalización anormal • Movimiento INVASIÓN Y METÁSTASIS Fuente: http://www.tree.com/health/breastcancer-stages.aspx INTRODUCCIÓN TIPO DE TUMOR SÓLIDO Sarcoma de Ewing CARACT. Familia (ESFT) REARREGLO CROMOS. t(11;22) EWS/FL1 Células redondas pequeño tamaño con mínima diferenciación. Cáncer de Mama Familia (EGFR) Linfoma de Burkitt Células B t(8;14) se infiltran tejidos C-MYC/IgH nodales (patrón difuso). OTROS ERG t(21;22) ETV1 t(7; 22) EIA t(17;22) Amplificación Her2/neu t(8;22), t(2;8) INTRODUCCIÓN TIPO DE TUMOR CARACT. REARREGLO CROMOS. OTROS Neuroblastoma 2do más frecuente Amplificación en niños < a 1 año N-MYC (20%) de edad. Células pequeñas redondas y azules. Delec. en el brazo p cromos. 1 Ganancia en el brazo q cromos. 17 Linfoma Anaplásico ALK (quinasa de t(2;5) ALK/NPM linfoma anaplásico) y proteínas citotóxicas. inv(2)(p23;q15) t(1;2)(q25;p23) INTRODUCCIÓN • • • Etapas Híbrido (la citogenética y la biología molecular). Detección de secuencias concretas de ácidos nucleicos (ADN o ARN)→ el empleo de sondas específicas marcadas con un fluorocromo. 4.Contratinción y visualización del ADN Los 2 componentes principales : Sonda de ADN marcada con fluorescencia • 1.Pretratamiento 2.Hibridación Secuencia diana Determinación de anormalidades recurrentes y rearreglos (diagnóstico y pronóstico). 2.Denaturación 3.Lavados posthibridación Fuente: http://filebox.vt.edu/users/chagedor/biol_4684/Methods/FISH.html INTRODUCCIÓN Sondas Centroméricas Sondas Pintado Cromosómico Sondas de Fusión Sondas Teloméricas Sondas Dual Color Dual Fusión Sondas de Locus Específico Sondas de Separación o Split INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y METODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS OBJETIVOS • Identificar rearreglos cromosómicos asociados con tumores sólidos en tejidos embebidos en parafina y en tejidos en congelación mediante la aplicación de la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). • Analizar muestras de tumores sólidos, recolectadas desde marzo del 2011 hasta marzo del 2012, aplicando la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en tejidos en congelación y en tejidos embebidos en parafina. • Identificar los rearreglos cromosómicos asociados a tumores específicos en cada neoplasia en estudio mediante la valoración de sus núcleos. • Cuantificar la correlación entre los tumores en estudio con las variables sexo, edad, localización del tumor. • Comparar el diagnóstico por FISH con el histológico. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 200 núcleos Núcleos no sobrelapado s HER2/neu se evaluaron 20 núcleos MATERIALES Y MÉTODOS TUMOR SÓLIDO SONDA REARREGLO CROMOS Sarcoma de Ewing Sonda Vysis LSI EWSR1 Dual Color Break Apart t(11;22) Neuroblastoma Sonda Vysis LSI N-MYC (2p24) spectrum green /CEP 2 spectrum orange. Amplificación N-MYC Linfoma de Burkitt Sonda Vysis LSI IGH/MYC dual-Color Dual Fusion t(8;14) POSITIVO NEGATIVO MATERIALES Y MÉTODOS TUMOR SÓLIDO SONDA REARREGLO CROMOS Cáncer de Mama Sonda HER2 /neu CEP17 PathVysion Amplificación HER2/neu Linfoma Anaplásico Sonda Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Rearrangement. t(2;5) POSITIVO NEGATIVO INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 3.1. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de fémur con translocación 22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.2. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con translocación 22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). • Diagnóstico definitivo , EWSR1/FL1(mejor pronóstico ) • RT-PCR y FISH 5 (Berková et al. (2008))18 Qian et al. 16 Yamaguchi et al. (2005), nuevas sondas 90%. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 3.3. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio inguinal con translocación 8q14 negativa en Linfoma de Burkitt (FFPE)Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.4. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio con translocación 8q14 positiva en Linfoma de Burkitt (TOC)Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Gen C-MYC (iniciación de un proceso tumoral), t(8;14) pacientes adultos, revaloración (resultado desfavorable) Belaud-Rotureau et al. (2002), 4 t(11;14)(q13;q32)LCM 3 t(8;14)(q24;q32)LB, Moon et al. (2008) translocación doble del cromosoma 14 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 3.5. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de mama con amplificación positiva para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.6. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de mama con amplificación negativa para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE). Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Tumor agresivo, con mayor resistencia a los tratamientos t< supervivencia Prevenir efectos cardiotóxicos . FISH vs Inmuno 50 Sui et al, 2009). 41 Su et al, (2011) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 3.7. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con amplificación negativa del gen N-MYC en Neuroblastoma (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.8. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con amplificación negativa del gen N-MYC en Neuroblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Gen N-MYC (altamente agresivo) Presencia de metástasis y un pronóstico pobre. Sartelet et al. (2002)97 FISH vs SB/PCR amplificación heterogénea , Abdalla et al. (2009) 30, diagnosticado en todos los casos de tumores neuroblasticos periféricos ≠s RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 3.9. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio retroperitoneal con translocación 2p23 ALK negativa en Linfoma No Hodking de células pequeñas (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.10. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra retroocular con translocación 2p23 ALK negativa en Retinoblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Gen ALK se asocia con el linfoma anaplásico de células grandes. ALK+(quimioterapia) y ALK− no muy favorable. Li et al 22 FISH vs Imnumo 100% concordancia, Shin et al. (2003), 9 FISH (aspirados) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3.1 Información y resultados del análisis de las diferentes muestras de tumores sólidos empleados en el estudio (N° de muestra, edad y sexo del paciente, diagnóstico médico, técnica histopatológica, técnica de FISH, tipo de tejido, tiempo de almacenamiento, localización topográfica y los resultados) obtenidos desde Marzo 2011 hasta Enero 2012. N° de muestra Sexo Edad Localización topográfica Diagnóstico Resultado histopatológico Tipo de Tejido (TOC y FFPE) Tiempo de almacenamiento Translocación o amplificación esperada Result. FISH 1 M 21 Fémur + TOC 0 22q12 + 2 M 65 Ganglio Inguinal Sarcoma Ewing PEANUT Linfoma Burkitt + FFPE 15 días 3 F 12 Tibia + TOC 4 F 56 Mama Sarcoma Ewing PEANUT Carcinoma Ductal + FFPE 8q14 - 22q12 + 301 días Her2-neu/CEP17 + 5 F 1 Suprarrenal Neuroblastoma + FFPE 19 días N-MYC - 6 M 17 Retroperitoneal Neuroblastoma + FFPE 7 días N-MYC - 7 F 57 Mama carcinoma Mutifocal + FFPE 20 días Her2-neu/CEP17 + 8 M 2 Suprarrenal Neuroblastoma + TOC 0 N-MYC - 9 F 2 Retroperitoneal + FFPE 30 días 22q12 + 10 F 73 Paratoroides Sarcoma Ewing PEANUT Linfoma No Hodgkin - TOC 2p23 ALK - 0 11 F 2 Retroocular Linfoma No Hodking - TOC 0 2p23 ALK - 12 M 14 Ganglio Linfoma No Hodking - TOC 0 2p23 ALK - 13 M 14 Ganglio Linfoma Burkitt + TOC 0 8q14 + 14 F 34 Ganglio Retroperitoneal Linfoma No Hodking - TOC 0 2p23 ALK - 15 M 7 Retroperitoneal Neuroblastoma + TOC 0 N-MYC - 16 F 68 Mama + FFPE 30 días Her2-neu/CEP17 - 17 F 47 Mama Carcinoma ductal infiltrante mod. Diferenciado Carcinoma ductal in situ extenso de alto grado + FFPE 180 días Her2-neu/CEP17 - 18 F 58 Mama + FFPE 120 días Her2-neu/CEP17 + 19 F 40 Mama + FFPE 30 días Her2-neu/CEP17 - 20 F 37 Mama Carcinoma ductal infiltrante mod. Diferenciado Carcinoma ductal infiltrante mod. Diferenciado Carcinoma ductal infiltrante mod. Diferenciado + FFPE 66 días Her2-neu/CEP17 + RESULTADOS Y DISCUSIÓN • Heterogeneidad celular. González et al. (2010). Tumor Sólido • Escasa disponibilidad . González et al. (2010). • La evolución de la enfermedad. • La valoración de la respuesta al tratamiento. Rearreglos cromosómicos • FISH →mejorar el diagnóstico y monitoreo. Ventaja • Tejidos (congelación,parafinados). • La digestión PASO CLAVE. Tojo (2009). • Tejido en congelación (100% )y parafinado (80%). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3.7 Características operativas de la técnica de FISH comparada con la de Histopatología (gold standard) para los tumores sólidos mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012). CARACTERÍSTICA OPERATIVA VALOR IC (95%) Sensibilidad (%) 100,00 93,75 100,00 Especificidad (%) 33,33 2,49 64,17 Valor predictivo positivo (%) 50,00 22,38 77,62 Valor predictivo negativo (%) 100,00 87,50 100,00 Índice de Youden 0,33 0,07 0,60 Figura 3.16. Curva de ROC de FISH vs. Histopatología (gold standard), obtenido mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012). RESULTADOS Y DISCUSIÓN SENSIBILIDAD (100%) • FISH (capacidad muy alta de detección, hibridación). • Identifica VPN(100%) • No tiene el rearreglo específico. ESPECIFICIDAD (33,33%) • Técnica histopatológica (análisis morfología). • Técnica de FISH (locus específico). • Variante VPP(50%) • Técnica tendría poco poder definir la probabilidad. ÍNDICE DE YOUDEN(0,33) • Baja especificidad. CURVA DE ROC (0,667) • Capacidad discriminatoria menor. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3.8 Resultados obtenidos mediante la Histopatología y la técnica de FISH. McNemar • P=0,0075 • Sí hubo diferencias en los resultados Chi Cuadrado de independencia Índice de Kappa • P=0.068 • Independiente de la técnica histopatológica. • κ=0,286 • Concordancia baja RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudio de células en interfase y tiene alta sensibilidad. No cultivo de tumores y Confirmación Disponibilidad de sondas comerciales Perspectiva médica Diagnóstico pronóstico de una enfermedad genética Investigación Mapeo genético Identificación de nuevos oncogenes FISH multiplex Decisión del tipo de tratamiento para combatir el cáncer Fotografía de una muestra de médula ósea en metafase con inv 16 negativa en leucemia mieloide aguda Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Su uso depende de la disponibilidad de sondas. Aporta información dependiendo del tipo utilizada (screening). concreta de sonda Alto coste económico. No en tejidos necróticos. No se pueden detectar alteraciones simultáneamente varias Fotografía de una muestra de neuroblastoma en interfase con amplificación N-MYC negativa. Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS CONCLUSIONES • Se realizó análisis de 20 tumores sólidos aplicando FISH sondas de locus específico (rearreglos cromosómicos específicos). • FISH permitió una adecuada identificación rearreglos cromosómicos esperados en TOC. Se evidenció en 3 SE, en 2 LB, en 4 NB, en 7 CM y 4 otros tumores sólidos (LNH). • La comparación entre las técnicas, sesgo → histopatología (screening) mientras que FISH (locus específico) influyendo →cálculo de las caract. Oper. FISH sensibilidad del 100%, de especificidad 33,33%, VPP del 50%, VPN del 100% y un IJ de 0,33. • Con la prueba Chi cuadrado de independencia (P=0,068), FISH independiente histopatológica pero al obtenerse una curva de ROC con un área 0,667 capacidad discriminatoria menor, (complemento) →un mejor diagnóstico de los rearreglos cromosómicos en tumores. CONCLUSIONES • Se obtuvo un valor de κ=0,286, (baja concordancia) FISH con respecto al estándar de oro, y prueba de McNemar P=0,0075, ≠s resultados. Sin embargo en aquellas muestras en las que se obtuvo un resultado (-) para el rearreglo cromosómico mediante la técnica en estudio, no significa que el diagnóstico histopatológico esté equivocado (otro tipo de alteración genética). • La técnica FISH es la más utilizada para el estudio de tumores sólidos sobre todo cuando existe un diagnóstico indeterminado. Además la identificación de los rearreglos cromosómicos específicos en las neoplasias en estudio (pronóstico, tratamiento y monitoreo)→ gran importancia a nivel clínico. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS RECOMENDACIONES • Para la comparación de técnicas se recomienda comparar a la técnica de FISH con sonda de locus específico con PCR o inmunohistoquímica (precisa). • Se recomienda para futuras investigaciones aplicar la técnica RT-PCR en las muestras de tumores sólidos en estudio para complementar el diagnóstico (resultado negativo). • Se recomienda utilizar la técnica FISH en aquellos casos en los que el cultivo de tumores presente dificultades (metafases, cariotipo y contaminación de las muestras). • Se recomienda utilizar FISH para la detección de rearreglos asociados a tumores que pueden ser muy difíciles de diagnosticar únicamente por su morfología. • Se recomienda utilizar FISH cuando el diagnóstico inmunohistoquímico indeterminado o equívoco (gen HER2/neu) en el cáncer de mama (paciente es positiva o negativa). RECOMENDACIONES • Utilizar FISH, para tomar la decisión (tratamiento) predecir la respuesta de los tumores a drogas usadas actualmente en la quimioterapia. • Citogénetica convencional →cariotipo post tratamiento MO, (monitorear al paciente durante y después de la terapia) • Protocolo (corte de tejido adecuado, respetar las temperaturas y una buena digestión con proteasa) • Para mejorar la aplicación de la técnica FISH (desarrollar nuevas sondas) que detecten genes candidatos →desarrollo y progresión del tumor (otros tipos de tumores sólidos). INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS BIBLIOGRAFÍA • • • • • • • • • • ACS. (2012). American Cancer Society. Extraído el 3 de Marzo de 2012, desde http://www.cancer.org. Bown, N. (2001). Neuroblastoma Tumour Genetics: Clinical and Biological aspects. JClin Pathol, 54,897-910. González N., Leonel A., Aristizábal B., y Beatriz H. (2010). Evaluación de tres métodos moleculares para el rastreo e identificación de HER2/neu. Medicina UPB, 29,17-40. Haschek, W. (2009). Fundamentals of Toxicologic Pathology. Londres: Academic Press. Hurria, A. (2010). Practical Geriatric Oncology. USA: Cambridge University Press Iwamoto, Y. (2007). Diagnosis and Treatment of Ewing’s Sarcoma. Jpn J Clin Oncol, 37, 79–89. Khosravi, P., Pérez, G. (2006). Linfoma B difuso de células grandes. Med Clin , 127, 17-21. Manzitti,J., Mansilla, M. (2010). Cuál es su diagnóstico? Descripción del caso presentado en número anterior: Retinoblastoma. Arch.Argent.Pediatr.,108 , 255-257. NCI. (2010). Instituto Nacional del Cáncer. Extraído el 25 de Enero de 2012, desde http://www.cancer.gov. Papaioannou, G., McHugh, K. (2005). Neuroblastoma in childhood:Review and Radiological findings. Cancer Imaging, 5, 116-127. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS “La confianza en uno mismo es el primer paso para el éxito" Anónimo