Download Métodos microbiológicos para la enumeración e identificación de

Microbiología de Alimentos
Aldo Dueñes Acosta 199419
Asesor: Ivan Salmeron Ochoa
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Tinción de Gram
 Separar a las bacterias en dos grandes grupos.
 –Cristal violeta también conocido como violeta de
genciana.
–Safranina.
–Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.
Bacilos Gram +
Bacilos Gram 3
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Agar Macconkey
 Identificación de enterobacterias que hidrolizan
lactosa.
 Positivo: color rojo.
 Negativo: amarillo por utilización de peptonas ( pH)
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Agar Sal Manitol
 Agar selectivo para aislamiento de estafilococos.
 Alta concentración salina.
 Indicador sal manitol.
 Estafilococos coagulasa + acidifican medio (zona
amarilla).
 Estafilococos coagulasa –
(zona roja o purpura).
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Agar Salmonella-Shigella
 Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de
Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp.
 Inhibición Gram + por sales billiares.
 Colonias con centro negro, indicativo de producción
H2S.
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Agar SalmonellaShigella
Microorgani
smo
Colonia
Salmonella
Typhimuriu
m
Transparente
, centro
negro
Shigella
Flexneri
Incolora
Shigella
Sonnei
Incolora
Proteus
Mirabilis
Transparente
, centro
negro
E. Coli
Rosadas a
rojas
Klebsiella
pneumoniae
Rosadas
cremosas y
mucosas
Enterococcus
Faecalis
Incoloras,
escaso
crecimiento
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Prueba de Oxidasa
 Identificación de la enzima CitocromoC Oxidasa.
 Se usa un aceptor de electrones (Tetrametil-p-
fenilendiamina o Reactivo de Kovacs).
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html
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Prueba de Indol
 Determinar la capacidad de separar indol a partir de
triptófano.
 Formación de un complejo rojo, indol reacciona
con el grupo aldehído del pdimetilaminobenzaldehído.
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Prueba Rojo Metilo.
 Identificación de bacterias capaces de producir ácidos
fuertes de la glucosa.
 Uso de un indicador rojo de metilo.
 MO + producen ácidos manteniendo un medio de
acidez.
 MO – producen acetilmetil carbinol neutro aumentando
el nivel de pH.
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Prueba de Catalasa
 Degradación de Peróxido de Hidrógeno por medio de
la enzima Catalasa.
H2O2
Catalasa
H2O + O2
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Prueba OF
 Prueba de Oxidación Fermentación.
 Utilizando Dos tubos con indicador azul de brotimol.
 Al inocularse ambos tubos, uno con tapa semi cerrada
y otro se agrega aceite y se cierra completamente.
 El vire de color por pH indica presencia de acido.
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Prueba Fermentación de Hidratos
de Carbono
 Determinar la capacidad de un Mo para fermentar
CHOs para producir ácido c/s gas.
 Indicador Azul de Bromitinol
 Indicación de producción de gas se utiliza campana
Durham.
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Prueba MIO
 Identificación Enterobacteriaceae en base a
Movilidad, Actividad de Ornitina Carboxilasa y
Producción de indol.
 Movilidad.- Entubecimiento del medio.
 Ortonina.- Indicador purpura de bromo cresol.
 Positivo: color purpura.
 Negativo: color amarillo.
 Indol.- Adición reactivo de kovacs.
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Prueba TSI
 Diferenciación de enterobacterias en base a
fermentación , con producción de gas y determinar la
producción de ác. Sulfhídrico.
 Agar Triple a Azucar. Lactosa, Glucosa y Sacarosa.
 Rojo de Fenol indicador.
 Producción de Tiosulfato de Sodio produce un
oscurecimiento.
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Prueba TSI
Pico alcalino, fondo ácido (R/A): MO fermenta
G
Pico Acido, Fondo ácido: (A/A): MO fermenta
G-L
Pico alcalino, fondo alcalino (R/R): MO no
fermenta azúcares.
Presencia de burbujas o ruptura del medio,
producción de gas.
Ennegrecimiento del medio, producción de
ácido sulfhídrico.
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Prueba LIA
 Diferenciar MO, especialmente, Salmonella por
descarboxilación/desaminación de Lisina, y producción ác.
Sulfhídrico.
 Indicador Purpura de Bromocresol.
 Amarillo cond. Ácidas.
 Violeta condiciones Básicas.
 Descaboxilación de lisina produce amina cadaverina, produce viraje
purpura. Descaboxilación en medio ácido inducido por fermentación.
 Desaminación de lisina produce ácido alfa-ceto-carbonico, dormando color
rojizo por sal de hierro y presencia de oxideno.
 Ac. Surfhídrico reacciona para producir sulfuro de hierro oscureciendo el
medio.
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Prueba LIA
Descaboxilación
Positiva : Pico Violeta / Fondo Violeta
Negativa: Pico Violeta / Fondo Amarillo
Desaminación:
Pico Rojizo / Fondo Amarillo
Ennegrecimiento del medio, producción de
ácido sulfhídrico.
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Prueba Agar citrato
 Identificación de bacterias mediante la utilización de
citrato.
 Indicador Azul de bromotinol.
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Prueba Urea
 Identificación de Mo por actividad de la enzima
eureasa.
 Indicador rojo de fenol.
 Medio ácido: color amarillo
 Medio alcali: color rojo.
 Conversión de la urea a amoniaco
e hidrógeno, produciendo
un medio alcali.
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Interpretación de Resultados.
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Métodos de numeración de MO.
 Realiza el conteo total de microorganismos presentes
en el alimento.
 Se considerara un indicador de las características
higiénicas generales del alimento.
 Los microorganismos por analizar serán miembros de
poblaciones diferentes.
 Características del medio utilizado.
 Condiciones de incubación.
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Cuenta Placa
 Una muestra es pipetiado en una caja petri esteril




mezclándose con un agar.
Agar a temperatura de 40°, evitar shock termico.
Es aceptado una cuenta de 25-250 colonias.
Recomienda realizar disoluciones antes de la
numeración, para obtener cuanta deseada.
Para obtener mayor confianza, duplicar los resultados.
X= media de colonias
V= volumen
d= disolución
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Número más Probable
 Inoculación de tubos con diferentes tamaños de
muestra.
 Se realiza con replicas (3,4,5).
 Por medio de tablas se determina el número máximo
en un lote.
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Food microbiology
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Método de Tinción.
 Usado en la industria láctica.
 Teñido por redox. Toma e de los sistemas bioquimicos
activos, cambiando de color.
 Las sustancias más usadas son:
 Azul de metilo.
 Resazurina.
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Filtro por membranas
 Membranas porosas que retienen a las bacterias.
 Una vez retenidas son inoculadas en un agar para su
posterior conteo.
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Filtro de epifluorecencia directa
 Variacion del método de filtro.
 Usando teñidores y microscopio fluorecentes.
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Microcolonias en DEFT
 Una variación del Filtrado de epifluorecencia, son
filtradas , inoculadas e incubadas.
 Determina células viables únicamente.
 Observación por microscopio.
 Dependiendo del periodo de incubación seran
detectados lo microorganismos.
 Gram – 3 hrs.
 Gram + 6 hrs.
 Coliformas, pseudomonas, staphyllococos 8 hrs.
Direct Epifluorescent Filter Techniques
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Cuenta colonias por Microscopio.
 Recuento de colonias de un agar sobre un
portaobjetos, previamente inoculado y encubado.
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Goteo de agar
 Gotear una muestra mezclada con cultivo en caja petri
vacía.
 Realizar disoluciones y proceder con el goteo en otra
caja petri.
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Películas secas
 Dos películas plásticas juntas, una de ellas contiene el
medio de cultivo y un agente gelificante soluble en
agua fría.
 Muestra diluida se coloca entre las películas, se realiza
la incubación.
 Las microcolonias se colorearan por la acción de
tetrazolium durante la fase de teñido.
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Tubos rodantes
 Efectivo para conteo de bacterias anaerobias.
 Tubos con agar fundido e inoculado a in tubo con
rosca,
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Bibliografía
 Adams M., Moss M. (2000) Food Microbiology, 2nd
Edition, UK., Real Society of Chemistry.
 Jay J. (2000) Modern Food Microbiology, 6th Edition,
USA, Aspen Publishers.
 Miramontes S. Manual de Laboratorio de
Microbiologia General, UACH, Facultad de Ciencias
Químicas.
 Virtual Interactive Bacterology Laboratory Michigan
State University
http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html
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