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TRANSFERENCIA DE MATERIAL
GENETICO: ENSAYOS DE
RESTRICCION DE PLASMIDO
Espinosa Muñiz José Carlos
2011-2
Endonucleasas de restricción

Es una enzima que se caracteriza por
reconocer una secuencia de 4 a 6 pb y
cortarlas específicamente en ambas
cadenas de la molécula del ADN.
Tipos de endonucleasas
Tipo I
 Tipo II. Son las
usados en biología
molecular
 Tipo III

Tipo II
Es la mas utilizada en biología molecular.
 Cortan sobre la secuencia que reconocen.
Han perdido su capacidad de ser
metilasas del DNA
 Cofactor Mg
 No ATP

¿porqué enzimas de restricción?
Las endonucleasas son también llamadas
enzimas de restricción debido a que es la
forma de defensa de las bacterias contra
la invasión por bacteriófagos.
RESTRINGEN EL PASO DEL
BACTERIÓFAGO.
 Son utilizadas para la eliminación de
secuencias genómicas o para su
introducción a un genoma (proteínas
recombinantes)


Generalmente reconocen secuencias
palindromicas, es decir, segmentos de
DNA que se leen igual de derecha a
izquierda y viceversa.
Extremos cohesivos

Es cuando la enzima de restricción rompe
la cadena del ADN en posiciones no
simétricas y producen fragmentos con
secuencias complementarias de una
cadena.
Extremos romos

Es cuando la enzima de restricción corta
exactamente sobre los dos ejes de
simetría.
Nomenclatura
El nombre de estas enzimas esta asignado
dependiendo su origen bacteriano.
 La primera letra representa el género de
la bacteria, las próximas dos indican la
especie, una cuarta letra indica la cepa, y
un número al final indica la cantidad de
enzimas que se han aislado de esa cepa.


Eco RI  E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa
identificada de esta cepa
Factores que afectan la reacción de
restricción

Se inhiben con los contaminantes que
podemos encontrar en preparaciones de
ADN (proteínas, fenol, cloroformo, etanol,
EDTA, SDS, sales)
Soluciones
Si se aumenta la cantidad de enzima (10 a
20 U/µg DNA) incrementa el volumen de
reacción, lo que diluye los inhibidores.
 Se puede aumentar la duración de la
incubación.
 Adición de policationes (espermidina)
uniéndose a contaminantes cargados 
¿Para que utilizamos enzimas de
restricción en el DNA?

Permite producir fragmentos definidos
que se pueden separar mediante una
electroforesis horizontal.
Un segmento de DNA contiene
secuencias blanco para varias enzimas de
restricción.
 Si el fragmento a analizar es extenso, se
pueden utilizar una o mas enzimas de
restricción (individual o mezcla)

Mapa de restricción
Es un diagrama de la molécula de DNA
en donde se muestra los sitios de corte
de las enzimas de restricción.
 Se puede localizar secuencias de bases
especificas en un cromosoma para
estimar el grado de diferencia entre los
cromosomas


En la práctica se utilizaran una mezcla de
dos enzimas de restricción ya que el vector
utilizado en la transformación no presenta
dos sitios de restricción para la misma
enzima.
SESIÓN EXPERIMENTAL
Objetivos
Conocer el principio de separación y
detección de ácidos nucleicos en geles de
agarosa.
 Emplear la electroforesis en geles de agarosa
para visualizar ácidos nucleicos.
 Determinar el tamaño de fragmentos de
ácidos nucleicos en geles de agarosa
 Conocer la utilidad de enzimas de restricción
en la transformación genética y
biotecnológica.

Materiales y reactivos
DNA plasmidico purificado.
 Kit para electoforesis
 Ndel enzima de restricción que genera
extremos cohesivos (ALMACENAR -20°C)

◦ Neisseria denitrificans
◦ 37°C

BamHI enzima de restricción que genera
extremos cohesivos (ALMACENAR -20°C)
◦ Curtobacterium albidum
◦ 37°C
Materiales y reactivos
Amortiguador TANGO de restricción
 TAE 1X
 Agarosa
 Buffer de muestra
 Estándar de peso molecular
 Bromuro de etidio

Desarrollo experimental
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Colocar en un tubo de microfuga los siguientes
reactivos: 10 µL de plasmido y 1 µL de amortiguador
Tango 10x. Realizarlo por duplicado.
Incubar 100°C por 5 min.
Incubar en hielo por 5 min.
Al tubo 1 agregar 1 µL de una de las enzimas de
restricción (la indicada por el profesor). Mezclar.
Al tubo 2 añadir 1 µL de BamHI y 1 µL de Ndel.
Mezclar.
Centrifugar por 5 segundos.
Incubar a 37°C por 90 minutos.
Al terminar la incubación, colocarlos en hielo.
Tomar alícuota de 10 µL para correr el gel de agarosa.
Preparación del gel de agarosa
Preparar el gel de agarosa al 1.2% (0.42 g
agarosa + 35 mL de TAE 1X).
 Calentar hasta que se disuelva bien.
 Esperar a que la temperatura disminuya y
agregar 2 µL de Bromuro de etidio
(AGENTE MUTAGENICO)


Verter el gel sin formar burbujas. Dejar
enfriar.

Añadir amortiguador TAE a la cámara hasta que
se cubran los pozos hechos por los peines.
Preparación de muestras
REACTIVOS
E
P
R1
R2
MUESTRA
1 µL DNA
10 µL
10 µL
10 µL
H2O
9 µL
-----
-----
-----
BUFFER
2 µL Stop Mix 3 µL
3 µL
3 µL
E: estándar
P: plásmido sin digerir
R1: plásmido digerido con una enzima
R2: plásmido digerido con dos enzimas
DNA, Moléculas cargadas negativamente

Tomar 13 µL y colocarlos en los pozos.
Conectar a la fuente de poder a 80 V por 40
minutos.
 Observar el gel en una cámara de luz UV para
visualizar las bandas de DNA
