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Digestión de ADN usando Enzimas de
Restricción
Dr. Jesús Lee-Borges
Dra. Liza Jiménez
Dr. José M. Planas
Dr. Jose A. Carde-Serrano
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
Objetivos
Repasar conceptos básicos de enzimología
 Conocer sobre enzimas de restricción
 Usar enzimas de restricción para cortar el ADN.
Electroforesis.
 Separar los fragmentos usando electroforésis.
 Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes
enzimas de restricción.

Enzimologia

Enzimas:

E + S [ES]  [EP] P + E

Energía de Activación

Restricción
Enzimologia

Enzimas:

E + S [ES]  [EP] P +

Energía de Activación

Restriccion
Enzimologia

Enzimas:

E + S [ES]  [EP] P +

Energía de Activación

Restricción
Historia




1968 – Descubiertas por
Werner Arber
1969 – Enzimas de
restricción tipo II
identificadas por Hamilton
O. Smith.
Daniel Nathans, ayudo
avanzar la técnica de
recombinación del ADN
(primer mapa genético
usando enzimas de
restricción).
Premio Nobel en
Fisiología/Medicina 1978.
Enzimas de Restricción


Diferentes tipos
– Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA
en sitios no específicos > de 1,000 pb
– Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan
dentro de la secuencia
– Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y
cortan de 24-27 pb “down stream” del sitio
Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la
biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las
secuencias especificas
Enzimas de restricción




También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces
fosfodiester a partir de una secuencia que
reconocen.(exonucleasas?)
La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica
(secuencia que se lee igual en ambas hebras (5’3’).
Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de
defensa para degradar material genético extraño que entre en la
célula.
Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII, EcoRI, y
Kpn I toman el nombre de las bacterias que la producen:
–
EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzimas de Restriccion
•Llamadas enzimas de restricción porque restringen la
actividad de bacteriófagos en bacterias
•“Sistema inmunológico” de las bacterias
•Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la
bacteria y lo metila
•enzimas de restricción atacan sólo secuencias no metiladas
(“restriction/modification systems”)
Enzimas de Restricción
•
•
•
Se han identificado cientos
de enzimas de restricción.
Mayoría reconocen
secuencias palindrómicas
Pueden producir cortes
abruptos o pegajosos.
Enzimas de Restriccion
Las enzimas de restricción al cortar DNA
pueden producir dos tipos de cortes:

Cohesivos o pegajosos: cortan a manera
escalonada en dos puntos diferentes.
–
–


5’ hangfree
3’ hangfree
Abruptos o truncados: cortan en un sólo punto.
Bioinformática
–
Molecular Toolkit
Corte cohesivo con EcoRI:
Algunas enzimas de restricción
Eco RI 5'-G | AATTC
Eco RV 5'-GAT | ATC
Hin D III 5'-A | AGCTT
Sac I 5'-GAGCT | C
Sma I 5'-CCC | GGG
Xma I 5'-C | CCGGG
Bam HI I 5'-G | GATCC
Pst I I 5'-CTGCA | G
Bases Teóricas de enzimas de
restricción
La actividad de las enzimas de restricción depende
de unas condiciones precisas :





pH
Temperatura
Concentración de sal
Iones
Una unidad enzimática (u) se define como la
cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug
de DNA bajo condiciones óptimas:



3-5 u/ug de ADN genómico
1 u/ug de ADN plasmico
Reacción enzimática




Buffer (10X)
DNA (1 μg)
Enzimas
H2O
2 μL
1 μL
2 unidades
_________
20 μL Volumen total
Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I
ELECTROFORESIS DE GELATINA
¿Qué es la electroforesis de
gelatina?

Es un proceso para separar una mezcla de
moléculas a través de un material estacionario
(“gel”) en un campo eléctrico.
Historia



1933 - la técnica fue introducida por Tiselius
1959 - el “gel” policridamida fue introducido
por Raymond y Weintraub
1975 - la electroforesis de dos dimensiones
fue anunciada por P. H. O’Farrell
Geles comúnmente usados:

Agarosa: polisacárido extraído de algas.
–
–
–

No tóxico.
Poco poder de resolución pero alto grado de separación.
Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.
Poliacrilamida: polímero de acrilamida.
–
–
–
–
Tóxico.
Menor grado de separación pero alto poder de resolución.
Usado para fragmentos de DNA de 500 pb.
Usado para separar mezclas de proteínas.
Marcadores de Peso Molecular


Son usualmente una mezcla de ADN con
pesos moleculares conocidos.
Son usados para estimar los tamaños de los
fragmentos de ADN en una muestra de ADN.
Sistema de Amortiguadores

TBE vs TAE
–
TBE: DNA < 1kb


–
TAE: DNA > 12 kb




Mejor resolucion
Alta capacidad de amortiguador
Menor capacidad amortiguador
Para DNA q se va a recobrar
Continúa.
Discontinúa.
Preparación del “gel” Agarosa
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)

Tiene que pesarse y
ser mezclada con el
disolvente
–
Gel agarosa 1%


1.0 g agarosa
99.0 ml 1X TAE
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)

Como la agarosa no
es soluble con el
amortiguador a
temperatura
ambiente tiene que
ser hervida.
Preparación de gel:

La mezcla de agarosa y
buffer tiene que
ponerse a calentar,
agitando
frecuentemente hasta
que llegue al punto
donde comience a
hervir.
Preparación de gel:


Una vez que el frasco
con la agarosa ya
pueda tocarse sin
quemarse, servir con
cuidado la mezcla en la
bandeja.
Dejar que se torne
opaco y sólido.
Aparato del “gel”
Consiste de:
 bandeja
 soporte
 peineta
Aparato de “gel” (Cont.)

Colocación del “gel”
a la bandeja.
Aparato de “gel” (Cont.)

El tanque es llenado
con amortiguador.
–
1X TAE
Aparato de “gel” (Cont.)




Cuando el gel
solidifique y se torne
opaco, sacar la peinilla
y poner gel en cámara
de electroforésis con
fosas del lado del polo
negativo.
Proceder a pipetear las
muestras en las fosas.
Correr gel.
Teñir.
Práctica de uso de micropipetas:




Apoye brazo que esté
agarrando micropipeta en
superficie firme.
Utilice la mano contraria
para apoyar la micropipeta
Introduzca punta de
micropipeta dentro de fosa,
sin tocar el gel
Vierta el contenido en fosa,
presionando botón de la
pipeta hasta primer punto de
resistencia
Aparato de “gel” (Cont.)

El “gel” agarosa es
cargado con
muestras de ADN.
E
F
λ DNA/KPN I
λ DNA/ECO RI
λ DNA/BAM HI
λ DNA uncut
A B C D
Marcador
Marcador λ DNA/Eco RI
λ DNA/HIN DIII
Organización del gel cargado con
λ ADN/Enzimas de restricción
Aparato de “gel” (Cont.)

Campo eléctrico.
–
–
100 V
30-45 minutos
Aparato de “gel” (Cont.)

Distancia
migratoria.
Aparato de “gel” (Cont.)

El “gel”es colocado
en un
transluminador con
luz UV.
Aparato de “gel” (Cont.)


Partículas de ADN.
Cortar las bandas
–
Guardar en
microtubos

rotular
¿Preguntas?
Preguntas


¿Cual es la función de las sales en la
eficiencia de las enzimas de restricción?
¿Por que las enzimas de restricción no
atacan el ADN de las bacterias que lo
poseen?
Qz 4 - Enzimas






1________Cantidad de enzima requerida para procesar 1ug
de DNA en condiciones óptimas.
2________ 5'-C | CCGGG 3’; está es la secuencia para la
enzima Xma1; como lee la otra parte del palíndrome visto de
5’3’?
3________ la característica que hace que las enzimas tipo II
sean las mas utiles en biología molecular.
4________ la función específica de las enzimas en la célula
es?
5________ donde se descubre el fenomeno de “restricción”?
Enzima Xba1 viene a concentración de 22000U/ml. Necesito
6 U para una reacción. Cuanto volumen necesito? Lo puedo
medir en una pipeta del lab? Como hago para medirlo?