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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller 8 de mayo de 2014 Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 1 Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002. Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3 2 Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS 3 Espectrometría de masa 1- Generalidades 4 Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos 5 Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante) 6 Espectrometría de masa Espectrometría de masa de Biomoléculas Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material 7 Espectrometría de masa Espectrometría de masa de Proteínas Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional 8 Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/ 9 Masa (definiciones) • Se determina • q = ±ze , m/z e = 1.6022 x 10-19 coulomb • z siempre es un integral positivo 10 Masa • Todas las moléculas tienen una composición química única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones) 6 12 13 14 12.011 6 6 6 C C C C 11 Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 12.0000 98.90 13C 13.0034 1.10 14N 14.0031 99.634 15N 15.0001 0.366 16O 15.9949 99.762 17O 16.9991 0.038 18O 17.9992 0.200 31P 30.9738 100.00 32S 31.9721 95.02 33S 32.9715 0.75 34S 33.9679 4.21 36S 35.9671 0.02 79Br 78.9183 50.69 81Br 80.9163 49.31 12 Carlos Cerveñansky Masa • La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1% • Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes 13 Masa • Ejemplo: 12C (98.9%) y 13C (1.1%) En Buckminsterfullereno (C60) La probabilidad que todos los átomos sean 12C: P = (0.989)60 = 0.515 14 Masa 15 Masa 16 Masa: definiciones • Masa molecular se mide en unidades de masa atómica unificadas (u) • u = m(12C) /12 = 1.6605402 × 10-27 kg (u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora -2009- arcaico) • Peso atómico: promedio por composición isotópica → Peso molecular • Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero • Masa más abundante 17 • Masa promedio Masa: definiciones 18 Carlos Cerveñansky Masa: definiciones 19 Determinación del número de cargas (z) 100 95 90 524.3 85 80 75 Una sola carga: Delta = 1.0 amu 70 Relative Abundance 65 60 55 50 45 Delta = 1.0 amu 40 35 30 525.3 25 Delta = 1.0 amu 20 15 10 526.2 5 0 520 521 522 523 524 m/z 525 526 527 528 529 20 Determinación del número de cargas (z) 100 95 262.6 90 85 80 75 70 Relative Abundance 65 60 Dos cargas: Delta = 0.5 amu 55 50 45 Delta = 0.5 amu 40 35 30 25 263.1 20 Delta = 0.5 amu 15 10 263.6 5 0 258 259 260 261 262 263 m/z 264 265 266 267 21 Espectrometría de masa de proteínas 37 kDa 37136 amu 22 Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z: [M+H]+ o [M-H]De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*(oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común) 23 Espectrometría de masa M(péptido) = 1162 Da Modo positivo m= +1 +23 +39 Modo negativo -1 24 Espectrometría de masa Espectrómetro de masa Muestra Entrada: Volatilización/ Ionización MALDI ESI Analizador de masas TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Orbitrap Sector Magnético Detector Alto Vacío 25 Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes) 26 Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS: ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance Orbitrap: ESI-orbitrap 27 Espectrometría de masa 2- MALDI-TOF 28 Espectrometría de masa Ionización por MALDI: (Matrix assisted Laser desorption/ionization) (Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: 29 Espectrometría de masa Ionización por MALDI: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico 30 Espectrometría de masa MALDI-TOF Matriz: acidos aromaticos 31 Espectrometría de masa 4HCCA DHBA SA 32 Espectrometría de masa MALDI-TOF Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa) 33 Espectrometría de masa MALDI-TOF Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. E + - + + s Fuente D 34 Detector Espectrometría de masa MALDI-TOF Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Ek = zeEs = ½mv2 v = (2zeEs/m)½ E + - Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + s Fuente + + D Detector 35 Espectrometría de masa MALDI-TOF Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma Ek, v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2 36 Espectrometría de masa MALDI-TOF E + - Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + s Fuente + + D Detector ½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2 37 Espectrometría de masa Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Carlos Cerveñansky 38 Espectrometría de masa Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t Carlos Cerveñansky 39 Espectrometría de masa MALDI-TOF Generalmente se observa la especie monocargada (M+H)+ 40 Espectrometría de masa MALDI-TOF Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM 41 Espectrometría de masa MALDI-TOF Se pueden estudiar masas en un amplio rango 42 Resolución en MALDI-TOF Voyager Spec #1= > BC= > RSM10000= > MC= > MC= > MC[BP = 1672.8, 3222] 1672.917 1672.92 100 3222.3 90 80 % Intensity 70 60 50 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) 40 30 20 10 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 0 1691.0 Mass (m/z ) Voyager Spec #1= > BC= > NR(2.00)= > MC= > MC[BP = 1672.9, 16255] 1672.918 100 1.6E+ 4 90 80 % Intensity 70 60 50 Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) 40 30 20 10 0 1655.0 Carlos Cerveñansky 1662.2 1669.4 1676.6 Mass (m/z ) 1683.8 0 1691.0 43 Espectrometría de masa 3- ESI-MS 44 Espectrometría de masa ESI ElectroSpray Ionization Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). N2 El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray) 45 Espectrometría de masa ESI ElectroSpray Ionization Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador N2 46 Espectrometría de masa ESI-Q Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas 47 Espectrometría de masa ESI-Q Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000 48 Espectrometría de masa Trampa de iones Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”. 49 Espectrometría de masa ESI-MS La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones m/z = (M+n)/n Donde n es el número de protones (masa = 1.0078 u, ~ 1) 50 ESI y carga [M+2H]2 + 674.7 100 Substance P % [M+H] + 685.7 462.8 600.4 666.1 693.6 1347.7 0 300 Da/e 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro 14+ 13+ 12+ 11+ 10+ 9+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 52 Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro 14+ 13+ 12+ 11+ 10+ 9+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 53 Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro (n+1)+ n+ x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x2-1)/(x1-x2) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328 54 Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo 55 Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro Bajo PM Alto PM 56 Espectrometría de masa ESI-MS Resolución de varias especies 57 Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C 58 Espectrometría de masa Comparación MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Pocas, en general 1 Muchas 50000 3000 Rango de masas 200.000 70.000 Interacciones no covalentes No Si limitado, PSD Si, CID Acoplar LC No Si Tolerancia a contaminantes Si No Cargas/ion Rango de m/z MS/MS 59 Espectrometría de masa Conclusión Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas 60 Continuará… 61 Seroalbúmina humana +49 +54 +52 +53 +51+50 +55 +56 +48 +44 +47 +46 +45 62 Lucía Turell Seroalbúmina humana 66437 6 Intensidad relativa 8x10 6 6x10 66453 6 4x10 66469 6 2x10 0 66300 66400 66500 66600 Masa (Da) 63 Lucía Turell