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Uso del pez cebra como animal modelo
para estudios de nanotoxicidad
Sandra Rainieri
[email protected]
JORNADA “NANOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN”
1 Junio 2015
©AZTI
6/2/2015
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Toxicidad NP metálicas
In vitro
Estrés oxidativo
Inflamación
Apoptosis
…
Mecanismo de acción no siempre claro
Faltan protocolos estandarizados y resultados uniformes
Pocos estudios in vivo y a largo plazo
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Modelos animales para estudios de toxicidad
• Los ensayos de toxicidad son obligatorios para cada aditivo / nuevo ingrediente
• Los procedimiento estándar incluyen ensayo in vitro e in vivo
• Los estudios con animales son caro, complicados, low-throughput y éticamente
problemáticos
Solución: utilizar sistemas alternativos para llevar a cabo ensayos
iniciales.
Invertebrados
Embriones
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Pez cebra (Danio rerio)
•
•
•
•
•
Fácil y económico de mantener
Reproducción externa
Embriones transparente
Herramientas genética
Test alternativos
MODELO RECONOCIDO
•
•
•
•
•
•
Biología del desarrollo
Enfermedades humanas
Desarrollo de medicamentos
Eco-toxicología
Investigación alimentaria
Acuicultura
Zebrafish
5 hpf
48 hpf
5 hpf
120 hpf
Alimentación espontanea
(ANIMAL)
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© AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.© AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.
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Estudios in vivo alternativos al uso de animales
Inflamación- cepa transgénica
expresa mieloperoxidasa (mpx).
que
Estrés oxidativo – tinción con fluoróforo
que detecta producción de ROS.
Además, estimación daño oxidativo
(peroxidación lipidica, daño proteinas,
ADN….).
Apoptosis – tinción con fluoróforo que
detecta muerte celular programada.
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5
Estudios in vivo alternativos al uso de animales
Absorción / Bioacumulación
Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014
López-Serrano et al., Nanotoxicology., 2014
Espresión genica – genes individuales o
mediante array.
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Fases de un estudio de nanotoxicidad
• Caracterización físico – química de las NPs con diferentes
técnicas (a T0 y durante el experimento).
• Definición de un protocolo de exposición adecuado.
• Evaluación del absorción y distribución en el sistema biológico
utilizado (durante el experimento).
• Evaluación de end-points de toxicidad específicos.
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Estudio sobre la toxicidad de AgNPs
comerciales
Objetivos del trabajo:
1) Definir un protocolo adecuado para la evaluación de la
toxicidad de NPs metálicas con embriones de pez cebra.
2) Clarificar si la toxicidad se debe a NPs o a liberación de Ag+.
3) Verificar si existen biomarcadores de toxicidad comunes
entre diferentes tipos de AgNPs.
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Fase 1: definición protocolo exposición
96h
OECD 236 (FET test)
Protocolo 1
4hpf-48hpf
Protocolo 2
72hpf-120hpf
48h
48h
Protocolo 3
96hpf-120hpf
nAg coloidal
24h
Absorción y distribución
Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014
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Fase 2: NPs vs Ag+
Embryo water
nAg coloidal Polytech & Net
y AgNO3
Agua desionizada
• Toxicidad aguda
• Expresión génica
Ag+ (complejos con aniones) = NO efecto
Ag+ (NO complejos) = efecto
100
% Mortality
80
60
nAg deionized water
40
nAg embryo water
20
0
0.01 ppm
1 ppm
5 ppm
nAg concentration
Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014
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NP vs Ag+
AgNPs vs AgNO3 (agua desionizada)
Análisis
transcriptómico
Genes
inducidos/
reprimidos
!! NO genes
comunes!!
Mecanismo
diferente
Procesos
biológicos
1 proceso común:
“cellular macromolecule
metabolic process”
Mecanismo
diferente
Rutas
metabólicas
1 en común
Metabolismo
lipídico
Mecanismo
diferente
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NP vs Ag+
• Toxicidad de las AgNPs debida al tamaño nano y a la
liberación de iones.
• El mecanismo de acción de las AgNPs depende del
medio y de la concentración.
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Fase 3: Comparación efectos diferentes AgNPs
Nanoplata coloidal Polytech & Net
100
LC50
6.24 ppm
80
% Mortality
19.05nm
60
40
20
0
0.01 ppm
AgNPs SIGMA + citrato
1 ppm
5 ppm
7 ppm
11 ppm
15 ppm
120
% Mortality
100
80
60
40
LC50
1.07 ppm
20
10.82 nm
0
0,093 ppm 0,1875 ppm 0,375 ppm 0,75 ppm
Suplemento alimentario
1,5 ppm
3 ppm
100
Mortality %
80
5.9 nm
LC50
0.076 ppm
60
40
20
0
Más toxico!
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0,05625 ppm 0,1125 ppm 0,225 ppm
0,45 ppm
13
0,9 ppm
Comparación efectos diferentes AgNPs
Expresión diferencial de genes seleccionados
Products NPs Ag
mt
il1β
slc16a9a opn1mw2
ucp3
nAg colloidal Polytech & Net
NPs Ag Sigma
Supplement nAg
up-regulated
(p<0.01)
down-regulated
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Comparación efectos diferentes AgNPs
• El nivel de toxicidad y las rutas metabólicas afectadas
dependen del tipo de AgNPs
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Conclusiones
• En estudios de nanotoxicidad es fundamental definir un
protocolo de exposición adecuado.
• El medio de disolución influye en la toxicidad de las AgNPs.
• La toxicidad de las AgNPs es debida en parte al tamaño nano y
en parte a la liberación de Ag+.
• No se han detectado biomarcadores específicos para la
detección de toxicidad de los tres tipos de las AgNPs estudiadas.
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Equipo toxicidad y pez cebra AZTI
Alex Barranco
Nagore Egurrola
Nadia Conlledo
M. Jose Sierra
Monica Martinez Santos
Amaia Mendizabal
Maider Olasagasti
Sandra Rainieri
Miguel Ángel Pardo
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Gracias!!
Colaboradores
Financiación
Departamento de química analítica
Universidad Complutense de Madrid
2011-2014
Analítica, transcriptómica y proteómica para la
evaluación de la toxicidad mecanismos y
bioacumilacion de contaminantes alimentarios y
ambientales (ATP-ToxBio). CTQ2011-28328-C02-02
2015-2017
Evaluación de los efectos tóxicos de la presencia de
nanopartículas, medicamentos y compuestos
orgánicos persistentes en alimentos (SAFEFOOD)
2009-2011- DaReTest-El pez cebra como modelo animal en investigación alimentaria:
evaluación de la seguridad y de la efectividad de ingredientes y modelo de acuicultura.
2012-2015- SEGURFISH: Nuevas metodologías para garantizar la seguridad alimentaria
de productos pesqueros
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www.azti.es | www.alimentatec.com | www.itsasnet.com
T. +34 94 657 40 00 | [email protected]
Txatxarramendi ugartea z/g
Herrera Kaia, Portualdea z/g
Astondo Bidea, Edificio 609
48395 Sukarrieta, Bizkaia (SPAIN)
20110 Pasaia, Gipuzkoa (SPAIN)
Parque Tecnológico de Bizkaia
48160 Derio, Bizkaia (SPAIN)
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