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SEÑALES ELECTRICAS: POTENCIAL DE ACCION 1 ¿Cómo transmitir velozmente una señal uniforme a largas distancias? Axon gigante de calamar Circuito reflejo de la rodilla 2 1 POTENCIAL DE ACCION 3 Siglo XVIII - Luis Galvani - Alessandro Volta Siglo XIX - Carlo Matteucci - Emil de Bois-Reymond - Hermann von Helmholtz Siglo XX: 1902-1912: Julius Berstein. 4 Potencial de Injuria 5 Teoría de Bernstein Na+ Na+ K+ Ke V Vi Ve 60 mV log Ki Cl- K+ V = 0 Cl- 6 Pese a que se habla de despolarización, lo que realmente ocurre es una reversión del potencial de membrana. 7 ¿Cómo puede medirse un potencial de acción? 8 Electrodos extracelulares + +- - - - - - + + + --+++++-- + + +- - - - - - - + + + + + ---+++++------- 9 Electrodos intracelulares y Patch Clamp muscle cell micropipete 10 Los PA de diferentes células responden a un patrón general común. Sin embargo las duraciones y formas pueden ser muy diferentes. 11 FASES DEL POTENCIAL DE ACCION ENa Ek 12 ¿De que procesos depende la generación de un potencial de acción? Axón gigante del Calamar 13 POTENCIAL DE ACCION La amplitud del potencial de acción es una función de [Na+]o. 14 Potencial Modificando gradualmente las concentraciones de Na+ y K+: Varía con [Na+]e Varía con [K+]e tiempo 15 15 Se pensó que la subida del potencial dependía de una corriente de Na+ y que la bajada de una corriente de K+. ¿Como se podían medir dichas corrientes? Problemas a considerar: -El voltaje durante el potencial de acción varía en el tiempo. -Las corrientes necesariamente deben ser afectadas por los cambios de potencial de manera no omhica (cambios no lineales). -Las corrientes deben variar con el tiempo. Solución: medir las corrientes a voltaje constante y entonces separar las dos variables. 16 Tecnica: fijación de voltaje (voltage clamp) Medición de las corrientes generadas por cambios en el potencial de membrana, dejando la variable potencial fija. Kenneth Cole 17 Tecnica: fijación de voltaje (voltage clamp) Convención: + corriente positiva 18 Voltage Clamp análisis de las corrientes fijando el voltaje 0 mV Voltaje comando -60 mV Corriente saliente (tardía) I (nA) Corriente entrante (temprana) 0 Tiempo (ms) 4 19 Las corrientes dependen del Vm Voltage Clamp cambios en la corriente en función del potencial al que se fija el potencial de membrana. cambios en la corriente en función del potencial al que se fija el potencial de membrana, en ausencia de Na+. 20 80 mV -60 mV I (nA) La corriente tardía se crece en todo el rango La corriente temprana se revierte entre +40 y +80 mV +40 mV -60 mV I (nA) 0 mV -60 mV I (nA) 21 POTENCIAL DE ACCION (medida en 0 [Na]o) Restando las corriente tardía a la total se puede despejar la dinámica de la corriente temprana. 22 Se pueden utilizar bloqueantes para aislar las corrientes de Na y K 23 Midiendo las corrientes de Na+ y K+ y teniendo en cuenta que el voltaje aplicado es constante… se puede calcular la curva de conductancia a cada potencial. Ii = (Vm-Vi) . gi => gi = I / (Vm-Vi) Vi: potencial de equilibrio del ión “i” gi: conductancia para “i” 24 Pico del PA gNa posee rápida activación y lenta inactivación gk posee solamente una lenta activación Vemos como las dos conductancias aumentan con el voltaje 25 entonces podría estar ocurriendo algo así ………. Aumento en Conductancia al Na (gNa) retroalimentación Despolarización positiva Corriente Entrante de Na ¿Pero como frenamos este proceso? INACTIVACION 26 Aumento en Conductancia al K (gK) Corriente Saliente de K Despolarización (-) Repolarización 27 El potencial de acción resulta de un aumento en la conductancia a Na+ dependiente de voltaje, seguida de un aumento en la conductancia a K+ dependiente de voltaje. 28 ¿Cómo imaginaron Hodgkin y Huxley que ocurría todo esto? Poros voltaje dependientes Para K g una compuerta varias compuertas Para Na tiempo Inacti Inacti29 29 Luego de aproximadamente 2 décadas …. CANALES IONICOS ICa2+ (nA) Tiempo (ms) 30 CANALES IONICOS registros de canal único QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. Sakmann & Neher’s Premio Nobel 1991 31 Patch Clamp Soluciones simétricas cell attached inside out 32 RECORDEMOS - Los iones se mueven pasivamente a traves de un poro acuoso a favor de su gradiente electroquímico. - Los canales poseen un filtro que selecciona el tipo de catión. - Tienen una “compuerta” que se abre y se cierra y un sensor de voltaje que la “activa”. 33 Activación Closed (C) 20 pA Open (O) time C O 34 O - 50 mV C O -20 mV C 35 Si medimos el tiempo en que el canal permanece abierto durante un período y lo dividimos por el período de tiempo total tomado, podemos calcular la Probabilidad de Apertura del Canal. O C a b c d Tiempo total Tiempo abierto (en el período medido) = a + b + c + d Por lo tanto… Po = tiempo abierto / tiempo total Por lo tanto el comportamiento de un canal se puede estudiar en términos probabilísticos. 36 ¿Cómo podemos relacionar las corrientes macroscópicas de la membrana plasmática con la actividad de los canales? I = G . (Vm-Veq) G = conductancia macroscópica n = número de canales = conductancia del poro Po = probabilidad de apertura G = . n . Po . nact Pero... ¿cuál es la variable que se modifica con los cambios de votaje? i i = . (Vm-Veq) Vi 37 Inactivación O C C O MODELO DE LA BOLA Y LA CADENA Armstrong CM, Bezanilla F (April 1973). I 38 CANALES IONICOS Canales dependientes del voltaje y del tiempo corriente macroscópica 200 pA inactivación corriente microscópica 39 Propiedades del Potencial de Acción Todo o nada Umbral Período refractario Es regenerativo (no se atenúa) 40 Cambios en el potencial de membrana debido a pulsos de corriente entrante o saliente. Umbral Todo o Nada 41 Período refractario relativo (RRP) y absoluto (ARP) 42 Umbral y supraumbral 43 (I2 / I1) Visualización de los períodos refractarios 44 44 ¿Que significado tienen los períodos refractarios? ? La respuesta surge de todo lo que discutimos previamente (Discutir) 45 PROPAGACION DE POTENCIALES El P.A. es regenerativo (no se atenúa) 46 Propagación electrotónica: un potencial graduado se atenúa en el espacio y no puede recorrer grandes distancias. 47 En cambio un potencial de acción es regenerativo, no se atenúa y puede llegar a largas distancias dentro del organismo. 48 Todo lo que vimos acerca de la generación de un potencial de acción ocurre en un pedacito de membrana. ¿Cómo sería el mecanismo de propagación del potencial de acción de un punto de la membrana a otro? Canales de Na+ dependientes de voltage se abren y el Na + entra Un potencial graduado supra umbral llega a la zona de disparo 49 + + Cargas positivas se propagan a regiones adyacentes del axón, y se despolariza la membrana río abajo lo que abrirá nuenos canales 50 Circuitos locales de corriente +++++++ --------+++++ --------- +++++++ -------- La zona río arriba está en período refractario. Se abrieron los canales de K y se inactivaron los de Na. La corriente saliente de K repolariza la membrana + + Flujos locales de corriente de la región activa despolarizan regiones río abajo. Se alcanza umbral, se activa INa y se regenera pot. acción 51 52 La velocidad de propagación de un potencial de acción va a depender de cuan eficiente sea la propagación pasiva. 53 Dado que la propagación pasiva es muy veloz, La velocidad de propagación de un potencial de acción: • Aumentará con el incremento de la constante espacial - disminuirá con la resistencia específica del axoplasma (por lo tanto aumentará con el radio del axón) - aumentará con la resistencia de membrana rm: resistencia de la membrana rm (por unidad de longitud) ri ri: resistencia del axoplasma (por unidad de longitud) 54 Si necesitamos una conducción rápida… ¿cómo hacer para lograr una menor atenuación espacial? 55 Estrategias de los invertebrados y de los vertebrados Axon Gigante de Calamar 0.8 mm Nervio con Axones Mielinizados de Mamífero 56 rm: resistencia de la membrana rm (por unidad de longitud) ri: resistencia del axoplasma ri (por unidad de longitud) λ varía con (rm/ri)1/2 ri: inversamente prop. a diam. axón Para el caso del axón gigante de calamar: > radio → < ri → > λ Para un axón de vertebrado: vainas de mielina → > rm → > λ (en internodos) 57 58 59 COMUNICACION ENTRE NEURONAS 60 ¿como se tramiten las señales en neuronas? Señal eléctrica Señal Química 61 A lo largo de la cadena de neuronas las señales eléctricas alternan entre: potenciales de acción potenciales graduados (propagacion pasiva) 62 ¿Cómo se originan los potenciales graduados en las neuronas? artificialmente por medio de un estímulo fisiológico 63 Inducido por inyección de corriente por microelectrodo 64 Efectos de un agente químico (neurotransmisor acetilcolina) sobre una neurona parasimpática. Cuerpo neuronal Potencial graduado 65 En una neurona mecanorreceptora (de estiramiento) (Membrana receptiva) 66 Potencial de Membrana (mV) Los potenciales de acción se originan cerca del inicio del axón, donde se integran los potenciales graduados. Sólo se disparan si se alcanza el umbral. 67 Características y propagación de los potenciales graduados: Atenuación Sumación temporal Sumación espacial 68 Atenuación No hay disparo del PA 69 Atenuación Hay disparo del PA 70 Una neurona o célula efectora puede ser inervada por muchas terminales 71 Sumación espacial 1 - se disparan tres neuronas excitatorias simultáneamente. Sus potenciales graduados individuales están por debajo del umbral. 2 - Estos potenciales graduados alcanzan la zona de disparo juntos y se suman creando un potencial supra-umbral. 3 - Un potencial de acción es disparado. 72 Sumación temporal 73 Si los estímulos están muy distanciados no hay sumación temporal 74 SINAPSIS 75 CONFIGURACIONES SINAPTICAS Sinapsis axosomática Sinapsis axodendrítica Sinapsis axoaxónica 76 Las neuronas se comunican entre si por dos vías: Sinapsis química Sinapsis eléctrica 77 78 formados 6 conexinas 79 SINAPSIS ELECTRICA Rio abajo -Simétrica -Latencia casi Nula (0.1 ms) -Atenuación (fuerza de acople) Rio arriba 80 Las sinápsis eléctricas respecto de las químicas son: - Mas confiables: las fallas son menos probables. - Más rápidas: muy importante para un comportamiento de escape. - Permiten sincronizar grupo de neuronas. - Permiten intercambio de moleculas como Ca2+, ATP, cAMP, etc. - Las dos últimas se podrían resumir en un acople eléctrico y metabólico. - Ventajas de las químicas: mayor plasticidad, posibilidad de transmitir tanto señales excitatorias como inhibitorias, variedad de procesos modulatorios . 81 SINAPSIS QUIMICA La sinapsis química implica una especialización entre una región presináptica y otra postsináptica: (IMPORTANTE ASIMETRIA) -síntesis y almacenamiento del neurotransmisor en vesículas -liberación del neurotransmisor 20 nm -Difusión -receptores específicos del neurotransmisor 82 PA + Liberación NT + difusión en cleft + activación de receptores posináticos + respuesta: latencia > 1 ms SINAPSIS QUIMICA Sinapsis neuromuscular, paradigma de sinapsis química Bernard Katz John Eccles Stephen Kuffler Las velocidad de transmisión en la sinapsis química requiere de un arreglo espacial compacto de todas las moléculas intervinientes. 83 SINAPSIS QUIMICA Sinapsis neuromuscular, paradigma de sinapsis química 50 mV presinapsis 5 mV postsinapsis EPP Latencia (PPT) 2-5 ms 84 Potencial postsináptico en: Neurona Motora – Célula Muscular: EPP “End Plate Potential” Potencial Postsináptico Excitatorio en: Neurona – Neurona : EPSP “Excitatory Postsynaptic Potential” Potencial postsináptico Inhibitorio en: Neurona – Neurona : IPSP “Inhibitory Postsynaptic Potential” 85 PLACA NEUROMUSCULAR ¿Cuál es el NT? :La aplicación iontoforética de ACh sobre la placa neuromuscular imita al efecto de estimular el nervio motor. ¿Dónde se localizan los receptores? : cuando la micropipeta con Ach se alejaba unos micrones de la región de la placa motora se reducían y se enlentecían las respuestas. Del Castillo y Katz 86 PLACA NEUROMUSCULAR Liberación espontánea minis Liberación evocada EPPs Katz & Miledi 87 PLACA NEUROMUSCULAR Liberación cuántica QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. m = np cuantos liberados = nro de cuantos liberables x probabilidad de liberación 88 Placa Neuromuscular Vesiculas presinapticas El Nro de cuantos liberados correlaciona con el numero de vesiculas fusionadas . De Robertis and Bennett, 1954 Eduardo De Robertis 4-AP: 4-aminopiridina Heuser y col, 1979. 89 SINAPSIS QUIMICA La transmición sináptica química se produce en una secuencia de pasos: Despolarización del terminal por propagación del potencial de acción, apertura de canales Aumento citólico de Ca++, fusión vesicular, liberación del NT al cleft sináptico Unión del neurotransmisor al R, activación de conductancia postsináptica 90 Postsinapsis Presinapsis Respuesta excitatoria: acerca al Vm al umbral de disparo del potencial de acción. Respuesta inhibitoria: aleja al Vm del umbral de disparo del potencial de acción (no es una regla). Lo importante es que tipo de canal está asociado al receptor. 91 SINAPSIS QUIMICA Los receptores postsinápticos se ubican en la membrana postináptica, enfrentados a la zona activa presináptica. -Los receptores poseen dominios que se extienden en el cleft y se unen a NTs que son liberados desde la presinapsis. - La unión del NT al receptor abre canales iónicos (directa o indirectamente). El flujo de iones generado modificará el potencial de la células 92 postsináptica. Que las sinapsis sean excitatorias o inhibitorias depende del tipo de canal iónico afectado. Que pasa si por ejemplo: - Se activa un receptor que aumenta fundamentalmente la INa - Se activa un receptor que aumenta la IK Es importante conocer la selectividad de los canales activados por un receptor 93 PLACA NEUROMUSCULAR Respuesta postsináptica ¿Qué tipo de corrientes participan de la corriente de placa? Potencial de reversión = 0 94 Llevamos el Vm a valores próximos al EK y alejados del ENa. Llevamos Vm a 0. Intermedio a EK y ENa. Llevamos el Vm a valores próximos al ENa y alejados del EK. Podemos concluir que en reposo estos canales conducirán principalmente Na+ 95 Que una sinapsis sea excitatoria o inhibitoria depende de: - que canales se encuentren asociados al receptor - cual es el potencial de reversión de dicho canal respecto al potencial al cual se encuentra la neurona (potencial de reposo) - pero finalmente, lo determinante es si dicho potencial de reversión es mayor o menor que el umbral de disparo. ENa Umbral Vreposo EK 96 RECEPTORES Receptores ionotrópicos (canales iónicos activados por ligando) Receptores metabotrópicos (receptores acoplados a proteína G) 97 SINAPSIS QUIMICA Neurotransmisores (Otto Loewi, 1926 ) Moleculas Pequeñas Acetilcolina Aminoácidos Glutamato Aspartato GABA Glicina Purinas ATP Aminas Dopamina Norepinefrina (noradrenalina) Epinefrina (adrenalina) Serotonina Histamina Péptidos Encefalina Endorfina Substancia P Vasopresina Neuropeptido Y Oxitocina Empaquetados en vesículas densas grandes Empaquetados en vesículas claras pequeñas o densas grandes 98 NEUROTRANSMISORES Transmición sináptica eficaz requiere: - síntesis de NT - empaquetamiento de NT - Liberación de NT - degradación o eliminación de NT 99 NEUROTRANSMISORES Síntesis y empaquetamiento de neurotransmisores pequeños 0.5-5 mm/ día Síntesis y empaquetamiento de neurotransmisores peptídicos 400 mm/ día 100 NEUROTRANSMISORES Acetilcolina CAT: choline acetyl transferase AChE: acetylcholinesterase R purinérgico 101 NEUROTRANSMISORES Glutamato EAAT: excitatory aa transporter (glutaminasa) 102