Download Gestión del gluten en la Industria Alimentaria Técnicas necesarias

Técnicas necesarias para garantizar el gluten en
alimentos
Enrique Méndez
Centro Nacional de Biotecnología
Gestión del gluten en la Industria Alimentaria
grupobonmacor
20 0ctubre 2006 Barcelona
La enfermedad Celiaca es una intolerancia a las
prolaminas de trigo de la cebada y del centeno
ATROFIA TOTAL-SUBTOTAL
GLUTEN
¿Componentes
Tóxicos ?
α β γ ω
Gliadinas (trigo)
Hordeinas (cebada)
Prevalencia
de 1-200
Secalinnas (centeno)
El único tratamiento para las personas con enfermedad
celiaca es una dieta de por vida sin-gluten
Los alimentos sin-gluten para los celiacos tienen que estar
exentos de los cereales tóxicos:
trigo, cebada centeno (avena)
Codex
Sin-gluten por naturaleza (20 ppm)
Sin-gluten elaborados (200 ppm)
(100 ppm) PWG
Para medir el gluten en alimentos sin-gluten
se necesitan métodos fiables
Medicamento
Para ver esta película, debe
disponer de QuickTime™ y de
un descompresor TIFF (LZW).
celiacos
No hay total garantía
del control del gluten
en alimentos para celiacos
¿Donde está el gluten?
trigo
centeno
avena
maiz
cebada
arroz
1. Los ingredientes de los alimento son muy complejos
gluten
hidrolizados
- Falsos negativos
calentados
modificados
Extracción / Detección
Falsos positivos
+
Gluten
Gluten
Gluten
sin calor
con calor
harinas arroz
almidones
papillas
soja
galletas
panes
chocolates
almidones
con calor
hidrolizado
Gluten
hidrolizado
papillas
almidón
alimentos ????
cereales desayuno
Extracción de gluten de alimentos tratados
y no tratados con calor
siropes
cervezas
almidones
TECNICAS COMPLEMENTARIAS NECESÁRIAS PARA CUANTIFICAR Y CONFIRMAR
LOS NIVELES DE GLUTEN EN ALIMENTOS
ALIMENTOS
No tratados calor
Tratados con calor
Hidrolizados
extracción
Etanol 60%
Gluten
nativo
Cocktail
Etanol 60%
Sandwich
R5-ELISA
ELISA-R5
Competitivo
Gluten
hidrolizado
Técnicas Confirmatorias
Gel agarosa 4x PCR cuantitativa
Espectrometria de Masas
DNA de trigo
DNA de cebada
DNA de centeno
DNA trigo+cebada+centeno
Western Blot-R5
Elección del tipo de extracción y del método de análisis
para alimentos sin-gluten
Gluten
sin calor
harinas arroz
almidones
soja
alforfón
60% etanol
cocktail
Gluten
Gluten
con calor
con calor
hidrolizado
papillas
soja
galletas
panes
chocolates
papillas
alimentos/almidón
alimentos ????
cereales desayuno
cocktail
60% etanol
cocktail
Gluten
hidrolizado
siropes
cervezas
almidones
60% etanol
ELISA-R5
Competitivo
ELISA-R5
Sandwich
Técnicas confirmatorias
MALDI-TOF
Western blot
PCR
2001-2006
ELISA-ω
ELISA-R5
Es insensible
a la CEBADA
Anticuerpo
ω
1,5
1,0
Centeno
x
2,0
0
0,001 0,01
Cebada
0,1
1
10
Centeno
x
x
1,0
x
0,001 0,01
20 ppm
Cebada
x
x
Trigo
0,5
Trigo
Anticuerpo R5
0,1
1
10
3 ppm Detecta péptidos tóxicos
QQPFP y el 33 mer
2.0
3.0
ω antibody
2.5
R5 antibody
1.5
1.0
Transia-Gliadin
PWG-Gliadin
Sigma-Gliadin
Gluten RM 8418
0.5
0.0
1
10
100
1000
Mean A450
2.0
1.5
1.0
Sigma-Gliadin
PWG-Gliadin
0.5
0.0
0
1
10
100
1000
1991-2006
ELISA-ω- Skerrit: Método oficial
ω Noruega
R5 Finlandia
R5 Suiza
R5 Suecia
No hay método oficial
2006
ELISA- R5
Alemania R5
R5 Austria
Irlanda R5
R5
Holanda
R5
U.K
Italia R5
España
R5
Países del mundo que utilizan y distribuyen los kits ELISA-R5 de las
casas comerciales Biopharm, Ingenasa and Diffchamb
America del
Europa
Sur
12. Ireland
1. U. K
23. Portugal
32. Chile
33. Brasil
2. Belgium
13. Poland
24. Greece
3. Sweden
14. Croatia
25. Luxemburg
34. Mexico
15. Bulgaria
4. Netherlands
26. Norway
35. Argentina
5. Germany
16. Slovakia
6. France
17. Slovenia
7. Italy
18. Hungary
8. Spain
19. Romania
28.USA
29. Canada
9. Finland
20. Czech Republic
Australia
10. Austria
11. Switzerland
27. Russia
America del Norte
30. Australia
21. Serbia
31. New Zealand
22. Malta
R5 -ELISA kits
Asia
36. Hong Kong
37. Israel
38. Korea
39. Japan
Africa
40. South Africa
Kits comerciales de ELISA y tiras basados en el
anticuerpo R5
R5
R5
R5
4
GLIADIN KIT
(R-7001)
1
5
INGEZIM GLUTEN
TRANSIA PROLAMIN
Ingenasa
Diffchamb
FAST GLIADIN
2
(R-7002)
Quit GLIADIN
(R-7003)
3
Operon
R-Biopharm
STICKS GLUTEN 6
Nuevo sistema eficaz de extracción de Gluten en
alimentos tratados y no tratados con calor
95-98 %
Gluten
Valores reales de gluten
% recuperados con 60% etanol
Cocktail
% recuperados con Cocktail
ppm
95
98
200
98
94
94
Heat
0
1
3
2
4
Alimentos tratados con calor
5
Sistema de ELISA competitivo para medir gluten hidrolizado
Basado en el anticuerpo R5
Límite de detección : 3 ppm gliadinas
Reproducibilidad :
7.7 %
Repetitividad :
4.7 %
Recuperación:
90-96 %
Cervezas
Siropes
Extractos de malta
Papillas infantiles
ppm
giuten
50
ELISA Competitivo -R5
Cervezas
ELISA Sandwich-R5
20
ppm Czech Republic
Spain
Finland
gluten
50
25
10
Belgium
Engl
France
Germ
Ireland
Denmark
Italy
Mexico
Austr Holl
USA
Laitila primera cerveza de malta de cebada sin gluten del mundo
cervera
Lote
ELISA R5
Sándwich
ELISA R5
Competitivo
12342
TGX-629
<3
< 6
12343
EKX-752
<3
< 6
12344
YAN-898
<3
<6
12345
EKX-752
<3
<6
12346
TGX-629
<3
<6
12347
UIK-448
<3
<6
12348
YAN-898 / A
<3
7
12349
YAN-898 / B
<3
8
12350
TGX-629
<3
< 6
12351
YAN-898
<3
9
12352
EKX-752
<3
10
12353
YAN-898
<3
< 6
12354
TGX-629
<3
< 6
12355
TGX-629
<3
< 6
12356
EKX-752
<3
9
12357
TGX-629
<3
<6
ppm
gluten
17
19 gliadinas
20
Nativas
Papillas
infantiles
Hidrolizadas
R5 competitivo
R5 Sandwich
10
Parcialmente
hidrolizados
Tratados con calor
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Detección de gliadinss en alimentos por Espectrometría de
Masas MALDI-TOF M S
Basado on observación directa del típico pérfil de gliadinas
permitiendo la identificación de gliadinas en alimentos
Espectrómetro
de Masas
α
γ
gliadinss
Alimento
Alimento
Identificación directa de gliadinas en alimentos por
Espectrometría de masas MALDI-TOF MS
ω
α, β, γ
31541
100
35191
164 ppm gliadins (R5ELISA)
38637
41852
54852
18000
60000
Mass (m/z)
100
(6683)
31310
35101
50 ppm gliadins (R5-ELISA)
(7700)
18000
60000
Mass (m/z)
100
56 ppm gliadins(R5-ELISA)
31394
33981
38638
(6208)
Sistema de PCR cuantitativo en tiempo real para la
detección de DNA de trigo, de cebada y de centeno
(método no inmunológico)
DNA
systemas de PCR
1. Trigo
2. Cebada
3. Centeno
Sensibilidad
0.5 ppm
4. Trigo +Cebada+Centeno
Geles de agarosa
PCR
Limitaciones de la PCR como “única” técnica para la cuantificación de
gluten en alimentos en los que el ADN está hidrolizado
Muestra
ELISA-R5
PCR
Cerveza 1
51
< 0,5
Cerveza 2
48
< 0,5
Cerveza 3
32
< 0,5
Sirope 1
105
< 0,5
Sirope 2
Sirope 3
102
57
< 0,5
< 0,5
Extracto de malta 1
4755
< 0,5
Extracto de malta 2
697
< 0,5
Extracto de malta 3
600
< 0,5
Extracto de malta 4
487
< 0,5
Cereales desayuno 1
55
< 0,5
Cereales desayuno 2
25
< 0,5
Cereales desayuno 3
23
< 0,5
Valores en ppm de gluten y en ng DNA/mg
Gluten intacto
ELISA-R5
ADN hidrolizado
PCR
Cornflakes
maíz
Aceptados para su consumo
en países nórdicos
Preparación de la muestras
Alimento
molienda
Extracción
Sin-gluten
Especiales
calor
hidrolizados
Cereales de desayuno
Papillas infantiles
Embutidos
complejos
Lácticos
Efecto de la preparación de la muestra en la cuantificación de gluten
Gluten (ppm)
13000
11000
9000
CNB
Suecia
7000
CNB ELISA-R5
Suecia ELISA-R5
5000
3000
1000
1
2 3 4 5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
12000
10000
8000
6000
Suecia
CNB ELISA-R5
Suecia ELISA-R5
4000
2000
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
Los laboratorios existentes en España tienen capacidad tecnólogica
y conocimiento suficiente para garantizar con fiabilidad el gluten
en alimentos
Lab1 Lab2 Lab3 Lab4
Lab5
Lab6 Lab7
Sin-gluten
hidrolizados
Cereales de desayuno
Papillas infantiles
Embutidos
complejos
Lácticos
Las empresas que elaboran alimentos sin-gluten o aptos para celiacos
tienen información real de los problemas analíticos del gluten?
Lab1 Lab2 Lab3 Lab4
Lab5
Lab6 Lab7
Sin-gluten
hidrolizados
Cereales de desayuno
Papillas infantiles
Embutidos
complejos
Lácticos
ELISA R5 la técnica más común de análisis de gluten en España
Asociaciones
Celiacos
Empresas
Administración
- Consumo
Laboratorios análisis
Lab
Lab
Lab
Lab
Lab
Lab
Información ?
Laboratorios análisis
propios
-Ayuntamientos
- Consejerías
¿Todos los laboratorios analíticos trabajan con la misma fiabilidad?
¿ Son comparables los resultados?
Especiales
(chocolates)
Alimento
Sin gluten
Pesada
Extracción
ELISA
Balanza
Pipetas
Pipetas
Aptos-celiacos?
(Ingredientes
complejos)
Placa de
ELISA
Nº muestras por
Placa
2 diluciones x 2
1 diluciones x 2
1 dilución
Estándar
Estándar
Factor
S1
S1
S2
S2
S3
S3
S4
S4
S5
S5
S6
S6
S7
S7
S8
S8
S1
S1
1/25
S2
S2
1/25
S3
S3
S4
S4
S5
S5
S6
S6
S7
S7
S8
S8
S1
S1
S2
S2
S3
S3
S4
S4
S5
S5
S6
S6
S7
S7
C+
S8
S8
Bl
1/25 1/50
1/25 1/50
Precio/muestra
2 x 1/25
2 x 1/50
X4
Control +
Blanco
2 diluciones x 2
2 x 1/25
38 muestras
X2
Control +
Blanco
Estándar
18 muestras
1 dilución x 2
1/25
1 x 1/25
78 muestras
1 dilución
X1
2 Diluciones
A
B
C
1/25
13
48
50
1/50
14
49
43
Media
14
49
47
D
E
F
1/100
104
80
107
1/200
120
82
99
Media
112
81
103
1/25
1/50
1/100
1/200
2 Diluciones
1/50
1/100
A
B
C
1/50
873
775
705
1/100
600
514
526
736
644
615
D
E
F
1/400
308
313
291
1/800
314
295
301
Media
311
Media
1/400
1/800
304
296
2 Diluciones
G
H
I
1/25
112
189
204
1/50
63
119
168
1/50
1/25
1/50
1/50
67
1/100
1/100
65
Media
66
1/100
106
110
1/200
119
92
Media
113
101
1/100
1/200
1 Dilución
1/25
2 Diluciones
G
H
I
112
189
204
1/50
(1 Dilución)
112
189
204
G
H
I
1/25
112
189
204
1/50
63
119
168
1/50
1/25
1/50
1/50
67
1/100
Media
(2 Diluciones)
66
113
101
1/100
65
Media
66
1/100
106
110
1/200
119
92
Media
113
101
1/100
1/200
Importante
Hacer 2 diluciones por duplicado por muestras
y en informe indicar los 4 valores y la media
(aunque el coste sea mayor)
Dilución 1/25
38 ppm
Dilución 1/25
37 ppm
media 38 ppm de gluten
Dilución 1/50
Dilución 1/50
40 ppm
39 ppm
Ayuda del CSIC y la C.A.M a la Unidad de Gluten del CNB
para la implantación del Sistema de Calidad
2000
ISO/17025/2000-12-05
ELISA-R5
Western Blot
Espectrometría de Masas MALDI-TOF
Auditoría por AENOR en 2004-5
Responsable Técnico y de Calidad
Normas ISO
Técnicas analíticas
ELISA R5 Sandwich
ELISA R5 Competitivo
PCR T/Cb/ Cn
E. Masas
(Comercial)
(No Comercial)
(No Comercial)
(No Comercial)
Servicio
Productos que salen con el etiquetado de sin-gluten
aptos para celiacos
Al Campo
Mercadona
Campofrio
Danone
C.Tarradellas
Nestle
H. inversores
(Joss SRL)
etc.
Embutidos
Jamones
Potitos
Pizzas
Zumos
Lacticos
Papillas
Alimentos de alta complejidad
aptos para celiacos
¿Se puede analizar con “garantía” el contenido de gluten de estos alimentos
que sale al mercado con la etiqueta de aptos para celiacos?
¿ Actualmente tienen “total” garantía los productos de las lista de las
Asociaciones de Celiacos para ser consumidos por los celiacos ?
Lista de
FACE
Lista de
SMAP
Sin-gluten
hidrolizados
Cereales de desayuno
Papillas infantiles
Embutidos
complejos
Lácticos
El símbolo
No da garantía el control
si no hay responsabilidad
De quien depende la garantía y la
responsabilidad
Medicamento
Para ver esta película, debe
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un descompresor TIFF (LZW).
Recomendar
Control
Empresas
Responsabilidad
Administración
Control
Responsabilidad
Empresas
Recomendar
Administración
Medicamento
celiacos
Asociación
Celiacos
Consultoras
Empresas
Celiacos
Laboratorios
sin-gluten
análisis
Control del gluten en alimentos
Administración
Asociaciones
de. Celiacos
FACE
SMAP
Científicos
Médicos
¿ Con o sin gluten la cuestión
está en el análisis
Gracias