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UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA DE AGRONOMIA
EVALUACION DEL BIOCONTROLADOR 3Tac® FORMULADO A BASE DE
TRES CEPAS DE Trichoderma , EN EL CONTROL DE Fusarium EN UNA
LINEA DE MAIZ DULCE (Zea mays var. Rugosa)
MEMORIA DE TITULO
HUGO IVAN ARROS POZO
Talca – Chile
2011
1
UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA DE AGRONOMIA
EVALUACION DEL BIOCONTROLADOR 3Tac® FORMULADO A BASE DE
TRES CEPAS DE Trichoderma , EN EL CONTROL DE Fusarium EN UNA
LINEA DE MAIZ DULCE (Zea mays var. Rugosa)
MEMORIA DE TITULO
Por
HUGO IVAN ARROS POZO
MEMORIA DE TITULO
Presentada a la
Universidad de Talca
como parte de los requisitos para optar al título de
INGENIERO AGRÓNOMO
Talca – Chile
2011
APROBACION
Profesor guía
Ing. M. Sc. D. Claudio Sandoval Briones
Profesor Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad de Talca
Profesor Informante
Ing. M. Sc. D. Mauricio Lolas Caneo
Profesor Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad de Talca
Fecha Presentación de Defensa de Memoria Marzo 2007
RESUMEN
Se evaluó el control de Fusarium por medio del biocontrolador comercial 3Tac®
formulado en base a tres cepas de Trichoderma, ( T. harzianum, T. viride, T.
longibrachiatum) en plantas de maíz dulce (línea parental), el producto se aplicó
en 7 tratamientos en distintos periodos, desde siembra hasta aporca, versus un
testigo sin aplicación. Las dosis de las aplicaciones para todos los tratamientos
fueron de 100 grs. / 15 ltrs. de agua (por aplicación). La investigación se realizó
en el sector de Bajo Los Rocos, San Clemente, Séptima región. Del lugar de
establecimiento del ensayo se tomaron muestras de suelo previo a la siembra
para determinar la presencia del patógeno Fusarium , las cuales fueron
analizadas en el laboratorio de fitopatología de la Universidad de Talca, donde
fue confirmada su existencia y su patogenidad mediante un test de inoculación
de plantas sanas y su posterior aislación desde las mismas. Se evaluó, altura
de plantas, peso seco, peso de mazorcas. Además de la incidencia y severidad
de la enfermedad en dos periodos, 7 días después de emergidas las plantas
(7dde) y madurez fisiológica.
Los mejores resultados en altura de plantas
se obtuvieron en los tratamientos número siete y seis con medias de 93,40 cm.
Y 89,92 cm., en peso seco el tratamiento siete fue el que obtuvo el mayor valor
en masa final del periodo de evaluación y fue de 137,08 gramos, en lo que
concierne al peso de mazorcas el único tratamiento que se diferencio del resto
fue el testigo que presento el valor mas bajo,
de solo 21,84 gramos, el
tratamiento cuatro fue el que presento los valores mas bajos en incidencia para
la primera evaluación con un valor de 70,67% , para la segunda fecha de
evaluación el tratamiento siete presento una media de 53,46% de plantas
enfermas siendo el mejor evaluado. Para severidad 7dde solo se evaluaron
cuatro tratamientos, para medir incidencia se utilizo la escala según Ogawa
(1986), el tratamiento cuatro fue el mejor evaluado en los cuatro niveles de
severidad (0,1,2,3 dependiendo del grado de severidad del ataque del
patógeno), en madurez fisiológica el tratamiento siete fue el de mayor grado de
marchitez.
Los tratamientos con mas de una aplicación durante la temporada
presentaron en todas las evaluaciones los mejores valores. El biocontrolador
fue capaz de disminuir la severidad e incidencia de la enfermedad en
condiciones de campo.
SUMMARY
The control of Fusarium was evaluated by commercial biocontrol 3Tac®
formulated on the basis of three stumps of Trichoderma, (T. harzianum, T.
viride, T. longibrachiatum) in sweet maize plants (lineal parentage). The product
was applied during seven treatments during different time periods, from the time
of sowing to the covering of the plants in fresh soil, which were tested against
control plants that were not applied with the product.
The dose of the
applications for all the plants were 100 grams/15 liters of water (per application).
The investigation took place in the sector of Bajo los Rocos, San Clemente, in
the seventh region. From the place where the study took place, samples from
the sowed ground were taken in order to determine the presence of the
pathogen Fusarium, which were then analyzed in a phytopathological laboratory
in the University of Talca. The existence and pathogenicity of Fusarim was
confirmed by testing the inoculation of the healthy plants and their subsequent
insulation from the same plants. The height of the plants, the dry weight and the
weight of the maize were evaluated. In addition, the effect and severity of the
disease during the two periods were measured seven days after the emergence
of the plants (7 dde) and also their physical maturity. The best results regarding
the height of the plants were obtained during the seventh and sixth treatments
with averages of 93,40 cm and 89.92 cm. In dry weight, the seventh treatment
obtained the biggest results in final mass during the period of evaluation and
was 137,08 grams. During tests of the weight of the maize, the only plant that
showed any change was the control plant, which presented the lowest result at
only 21,84 grams. The fourth treatment was the treatment that presented the
lowest results in impact during the first evaluation with the value of 70.67%. For
the second date of evaluations, the seventh treatment presented an average of
53,46% of diseased plants which was the best evaluation. For the severity 7dde
only 4 treatments were evaluated. In order to measure the effect, the Ogawa
scale (1986) was used. The fourth treatment was the best evaluated according
to the four levels of severity (0,1,2,3 depending on the degree of the severity of
the attack of the pathogen). As for the physical maturity, the seventh treatment
had the highest degree of wilting.
The treatments with more than one
application during the period of the experiment all presented better results. The
biocontrol was able to decrease the severity and effect of the disease on the
conditions of the field.
ÍNDICE
I.
INTRODUCCION
1
1.1
Objetivos generales
1
1.2
Objetivos específicos
1
II.
REVISION BIBLIOGRAFICA
2
2.1
Maíz dulce (Zea mays var. Rugosa)
2
2.1.1 Variedades
3
Requerimientos
3
2.2.1 Clima
3
2.2.2 Suelo
3
2.2.3 Siembra
3
2.2.4 Fertilización
4
2.2.5 Espaciamiento
5
2.2.6 Polinización
5
2.2.7 Producción
5
Labores Culturales
6
2.3.1 Cuidados durante la temporada del cultivo
6
2.3.2 Cosecha y almacenamiento
7
Problemas potenciales
8
2.4.1 Clima
8
2.4.2 Plagas
8
2.4.3 Animales
8
2.2
2.3
2.4
2.4.4 Enfermedades
2.5
Antecedentes de Fusarium
8
9
2.5.1 Sintomatología
11
2.5.2 Ciclo Biológico
11
2.5.3 Alternativas de control
12
2.5.4 Control biológico
12
Trichoderma
14
2.6.1 Morfología y taxonómia
15
2.6.2 Mecanismos de acción
16
2.6.3 Relación de Trichoderma con la planta
18
III.
MATERIAL Y METODOS
19
3.1
Ubicación del ensayo
19
3.2
Material vegetal
19
3.3
Controlador biológico 3Tac
3.4
Obtención e identificación de Fusarium
20
3.5
Prueba de patogenicidad
21
3.6
Descripción del ensayo
22
3.7
Análisis de semillas en laboratorio
23
3.8
Evaluaciones
3.9
Diseño experimental
25
IV.
RESULTADOS Y DISCUSION
26
4.1
Identificación del hongo Fusarium
26
4.2
Prueba de patogenicidad
26
4.3
Evaluaciones de 3Tac en el control de Fusarium en una línea
2.6
parental de maíz dulce
19
24
28
4.3.1 Altura final de planta
28
4.3.2 Peso Seco
29
4.3.3 Peso Mazorca
31
4.3.4 Severidad de la enfermedad siete días después de
emergidas Las plantas de maíz
32
4.3.5 Severidad de la enfermedad en madurez fisiológica
33
4.4
Incidencia de Fusarium
34
V.
CONCLUSIONES
37
VI.
BIBLIOGRAFIA
38
INDICE DE CUADROS
Cuadro 3.1 Tratamientos del Ensayo
23
Cuadro 4.1 Resultados de la prueba de patogenicidad
efectuado en plantas de maíz , inoculadas con Fusarium
26
Cuadro 4.2 Nivel de severidad de fusariosis en plantas de maíz dulce
(parental) tratadas con Trichoderma (3Tac) evaluadas a los
7 días después de emergidas.
32
Cuadro 4.3 Nivel de severidad de fusariosis en plantas de maíz dulce
(parental) tratadas con Trichoderma (3Tac) evaluadas en madurez
fisiológica.
34
INDICE DE GRAFICOS
Figura 4.1 Altura de plantas de maíz dulce parental tratadas con 3Tac.
29
San Clemente temporada 2005/2006
Figura 4.2 Peso de plantas de maíz dulce parental tratadas con 3Tac.
30
San Clemente temporada 2005/2006
Figura 4.3 Peso de mazorcas de maíz dulce parental tratadas con 3Tac.
31
San Clemente temporada 2005/2006
Figura 4.4 Incidencia de Fusarium sp. En plantas parentales de
maíz dulce, tratadas con Trichoderma (3Tac), en dos
épocas de evaluación (7 días después de emergidas
y madurez fisiológica) temporada 2005/2006, San Clemente
36
1. INTRODUCCIÓN
Las empresas que producen semillas de maíz tanto en Chile como en el
extranjero se ven afectadas por hongos. Lo que implica un problema de nivel global y
año tras año estos problemás de infección se están acentuando en los campos donde
no se realizan labores de control.
En la actualidad existen muchas enfermedades que se relacionan al cultivo del
maíz, ya sea grano, semillero o sus líneas paréntales, entre ellas están las generadas
por hongos del género Fusarium sp. que ha sido identificado en numerosas
oportunidades causando daños directos sobre la planta y por ende sobre la producción
final, si bien el patógeno es un habitante natural del suelo, éste se ve favorecido para
infectar la planta por la gran cantidad de labores que se realizan en los maíces para
obtener un cultivo ya sea libre de malezas o mejorar el potencial productivo del maíz.
En el presente estudio se presenta una alternativa de control para Fusarium sp.
en Maiz Dulce, Utilizando un controlador biológico ampliamente estudiado en el control
de patógenos como lo es Trichoderma, en una formulación que
se encuentra
disponible en el mercado como lo es 3Tac perteneciente a la empresa Avance
Biotechnologies.
De acuerdo a lo anterior los objetivos generales de esta investigación fue
evaluar el efecto del bicontrolador comercial 3Tac (a base de tres cepas de
Trichoderma), en el control preventivo de Fusarium sp. en plantas parentales de maiz
dulce en condiciones de campo.
Como objetivos especificos se plantearon, determinar la incidencia y severidad
de Fusarium sp. en plantas parentales de maiz dulce tratadas con el biocontrolador
3Tac en aplicaciones de pre y postinfeccion.
Además como segundo objetivo especifico se establecio evaluar la mejor epoca
de aplicación del biocontrolador y sus posibles combinaciones durante la temporada de
crecimiento del cultivo de maiz dulce.
2. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
2.1 Maiz dulce (Zea mays var. Rugosa)
Corresponde a un maiz
de semilla arrugada, que
en general produce
mazorcas de tamaño mediano, de grano muy dulce que se consume como “maíces de
mesa”. Además se enlatan, se cortan en rodajas o se congelan.
Difiere del maíz de grano por un solo gen, llamado gen azucarero o su. Las
tres principales variedades son la tradicional (su), extradulce (se), y shrunken-2 (sh2).
Estas variedades varían en dulzura, manteniendo la calidad, aún después de la
cosecha y vigor en suelos fríos. Debido a la demanda del consumidor, las empresas
semilleras han mejorado de manera significativa la calidad del maíz dulce durante la
última década, es por ello la importancia de los maíces paréntales, los cuales darán
forma a variedades con características deseadas y mejoradas.
Las variedades del maíz dulce tradicional (su) han sido sembradas durante
muchos años y tienen el sabor y textura propias de este tipo de maíz.
Desafortunadamente, la mazorca de éstos conserva su calidad por solo uno o dos
días. Además, las variedades tradicionales no se almacenan bien después de
cosecharse.
Las variedades extradulces (se) producen mazorcas con granos tiernos que
tienen un contenido de azúcar mayor que las variedades su. Los pericarpios suaves de
los granos hacen que el maíz sea tierno y fácil de másticar. El período de cosecha y
almacenamiento de las variedades se es ligeramente más largo que el maíz dulce
tradicional. El nombre común de las variedades shrunken-2 (sh2) se deriva de la
apariencia en forma encogida o arrugada de los granos secos. Comúnmente
denominados “súper dulce,” estas
variedades tienen un período de cosecha y
almacenamiento más largo y tienen el mayor contenido de azúcar. Sin embargo, las
variedades sh2 tienen algunas desventajas. Los tejidos o membranas son
relativamente gruesos, dando una textura dura o crujiente. Los rendimientos
generalmente son más bajos que en el maíz dulce tradicional. También su germinación
es más lenta y tienen un vigor reducido en los retoños. ( Haynes,2003)
2.1.1 Variedades
Al comprar el maíz dulce, los agricultores pueden seleccionar variedades que
producen mazorcas de color amarillo, blanco o bicolor. Algunas variedades novedosas
producen granos multicolores („Indian Summer‟) o rojizos („Ruby Queen‟).
2.2 Requerimientos
2.2.1 Clima
El maíz dulce es una planta de verano, sensible a las heladas pero con gran
poder
de
recuperación.
Le
favorece
un
verano
largo,
con
temperaturas
estables.(Giaconi, 2004).
2.2.2 Suelo
Se da en suelos preferentemente livianos a francos siempre que sean lo
suficientemente profundos, con buen drenaje y buen contenido de materia orgánica. La
fertilidad debe ser buena, el drenaje óptimo y buena retención de humedad; además de
ser planos y en lo posible libre de malezas pues presenta bajo vigor en los primeros
estadios por lo que es un mal competidor hasta el momento de cubrir el suelo.
2.2.3 Siembra
No germina bien en suelos con temperaturas bajo 20 °C. La semilla es
afectada por hongos fácilmente en suelos fríos y húmedos. Un pH del suelo de 6.0 a
6.5 es deseable para un rendimiento óptimo.(Giaconi, 2004).
Las variedades tradicionales de maíz dulce se pueden sembrar a finales de
octubre en la parte central de Chile. Por lo general, variedades extradulces deben
sembrarse una semana después del maíz dulce tradicional. Variedades shrunken-2 no
deben sembrarse hasta mediados de Noviembre en la parte central de Chile porque
esta variedad no germina bien en suelos con temperaturas bajo 28 °C.
Para una producción continua de maíz dulce, se debe sembrar alternando
variedades precoces, normales y tardías, cada 2 ó 3 semanas, se debe utilizar siempre
semilla fresca, el sembrar semilla vieja o caduca dará como resultado una baja
germinación de plantas. El utilizar semilla tratada con fungicidas e insecticidas evitara
problemás de pudrición y ataque de insectos.
La semilla debe sembrarse entre 5 a 8 cm. de profundidad en suelos francos.
En suelos ligeros y arenosos, la profundidad puede ser 8 a 10 cm. (Giaconi, 2004).
2.2.4 Fertilización
El maíz requiere relativamente un alto nivel de nitrógeno además de niveles
moderados de potasio y fósforo. La aplicación de fertilizantes se debe realizar en base
a resultados de análisis de suelo. En el mercado existen mezclas especificas todas
con macro y micro elementos. Los porcentajes de nitrógeno fósforo y potasio a aplicar
son los que determina el análisis de suelo.(Haynes,2003).
El nitrógeno se aplica en dosis no inferiores a las 150 unidades por hectárea
desde la siembra hasta la floración, en forma parcializada mientras el desarrollo del
cultivo permita las aplicaciones.
Al aplicar un fertilizante con formulación potasica se suple la necesidad de este
elemento, es decir la aplicación de salitre potásico en mezcla con súper fosfato triple
deben ser suficientes para cubrir las necesidades del cultivo.
La utilización de maquinaria con dispensadores de fertilizante son de gran
ayuda en la distribución de éste al momento de la siembra, ubicandolo a una distancia
prudente para evitar una toxicidad por contacto directo con las raíces.
2.2.5 Espaciamiento
El espaciamiento debe ser al igual que en el maíz dentado de 70 a 75 cm. entre
hileras. Entre semillas sobre la hilera la distancia varia entre
10 a 15 cm., esta
densidad asegura un rápido cubrimiento de las plantas sobre el suelo evitando así una
mayor presión de las malezas y disminuyendo el uso de controles químicos y manuales
sobre éstas.
En variedades con alta producción de hijuelos (característica muy típica de los
maíces dulces) se debe utilizar el rango más alto de separación entre semillas.
2.2.6 Polinización
El maíz dulce al igual que el maíz dentado, se poliniza por el viento. Una pobre
polinización da como resultado una baja producción de grano en las mazorcas.
Diversas variedades de maíz se pueden cruzar dando como resultado un
cambio en los niveles de azúcar, color, sabor, textura y otras características de la
plantas, esto es lo que realizan los hibridadores con las líneas puras. Para realizar la
polinización cruzada, se pueden sembrar todas las variedades de maíz dulce por grupo
único, y realizar polinizaciones manuales para dirigir los cruzamiento y mezclas de
genes.
2.2.7 Producción
La producción en maíz dulce es muy variable, por lo que un buen trabajo de
labores culturales en el inicio del cultivo son determinantes en el rendimiento final. En
los sectores de mayor rendimiento se pueden alcanzar hasta 10 toneladas de grano
por hectárea.
2.3 Labores culturales
2.3.1 Cuidados durante la temporada de cultivo
El control de las malezas y disponibilidad de humedad suficiente en forma
oportuna son esenciales para la producción de máxima calidad. Un control químico en
presiembra y post emergencia son fundamentales en el combate de las malezas. Solo
en sectores con alta presión de malezas es necesario la escalda manual o azadoneo,
siempre tomando en cuenta que esta labor es de alto costo para el agricultor. Se debe
tener en cuenta que las labores de control de malezas, tanto mecánicas como
manuales, siempre producen daños a las raíces
por lo que
aumentan las
posibilidades de entrada de patógenos a las plantas. Éste debe ser monitoreado para
suplir las necesidades del cultivo en forma oportuna y así evitar estrés innecesario para
las plantas, el riego debe ser lo suficientemente profundo para mojar en cantidad y
calidad suficiente las raíces. Los períodos más críticos del agua son durante la
polinización y desarrollo de la mazorca, sin desmedro del resto de los periodos
vegetativos del cultivo.
No hay que remover los pistilos del ápice de la planta, pues estos son la parte
másculina de la planta que produce el polen, que cae sobre la seda de la mazorca, la
cual es la parte femenina de la planta. Cada hilo de seda se sujeta a un grano
haciendo que éste se polinice o se fecunde. Si esto no sucede, no se producirá
fecundación y en la mazorca se observarán lugares sin desarrollo de granos y por ende
disminución de la calidad para fresco y de rendimiento en el caso de semilla.
El agitar las plantas ayuda a que el polen cubra la seda para aumentar la
polinización.
Una vez fecundados los granos, éstos deben de llenarse para lo cual necesitan
de un suministro constante de agua para poder completar su ciclo, por ende el déficit
en esta etapa es crítico y determinante para el rendimiento final del cultivo.
2.3.2 Cosecha y almacenamiento
El maíz dulce está listo para cosecharse para fresco aproximadamente 15 a 23
días después de la fecha que emerge la seda. El maíz madura de una manera más
rápida en climás cálidos y por consecuencia en climás fríos este desarrollo se vuelve
más lento.
El maíz dulce se debe cosechar cuando las sedas están de color café y secas
en el ápice de la mazorca. Ésto es el estado lechoso del maíz, o punto de maduración,
momento en que al presionar con la uña del dedo pulgar sobre los granos, éstos
producen un líquido lechoso. En los climás cálidos, el maíz dulce puede permanecer en
óptimás condiciones solo por uno o dos días. Una sobre maduración hace que éste se
vuelva duro y pastoso.
Muchas variedades son culteras. Esto significa que producen dos mazorcas por
planta. La mazorca del punto alto tiende a madurar más rápido que la mazorca de
abajo. Para cosecharlas , éstas deben arrancarse cuidadosamente del tallo mediante
una torsión hacia el suelo.
Las variedades de maíz dulce tradicionales pueden perder hasta el 50 por
ciento de su azúcar dentro de 12 horas después de la cosecha si no se refrigeran. El
maíz sin deshojar se puede almacenar en el refrigerador a 0°C durante 4 a 8 días. Las
nuevas variedades extradulces tardan más en convertir el azúcar a almidón y se
pueden cosechar durante un período de tiempo más largo. Las variedades extradulces
también tienen un periodo de almacenamiento más prolongado. El maíz dulce puede
enlatarse o congelarse para poder consumirlo durante todo el año.
Cuando la cosecha es para venta directa, se recomienda cosechar la cantidad
que se vende en un día, manteniéndola en un lugar fresco y ventilado. Una opción es
enfriar el maíz a 0° C dentro de una hora después de recolectarlo. Para refrescar las
mazorcas hay que bañarlas con agua a una temperatura de 4° C, para luego
empacarlas en cajas, cubriendo éstas con hielo y almacenarlas a una temperatura de
0°C y una humedad relativa de 90%. Si no se refrigeran inmediatamente, las mazorcas
se deben de almacenar en la sombra o en un lugar fresco y oscuro, para reducir el
calentamiento del sol. No hay que amontonarlas para almacenarlas, ya que el calor de
la respiración aumentará la temperatura del maíz ( Haynes,2003).
2.4 Problemás potenciales
2.4.1 Clima
Temperaturas altas y estrés por falta de agua durante la polinización dará como
resultado una mala fecundación y baja producción de granos, además de una
deficiente acumulación de azúcares.
2.4.2 Plagas
Los gusanos Agrotis spp. (cortador) y Elasmopalpus lignosellus (Barrenador) son
el principal problema que afecta al maíz. Las poblaciones de gusano cortador se
encuentran a principios de primavera y usualmente son más altas a principios de
noviembre a mediados de enero.(Paratobi, 1995)
Los áfidos y pulgones también pueden ocasionar grandes daños, ya que en
cosechas para fresco dan un mal aspecto y disminullen la calidad visual del producto.
2.4.3
Animales
Pájaros y otros animales pequeños pueden ocasionar daños severos a las
plántulas del maíz.
2.4.4 Enfermedades
El maíz dulce tiende a tener pocos o esporádicos problemás de enfermedades.
El carbón común (Ustilago maydis) es una enfermedad fungosa caracterizada por
agallas blanquecinas que en su interior contienen en esporas del patogeno. El carbón
suele ser más severo en plantas excesivamente fertilizadas con nitrógeno. Este daño
puede ser incrementado por el uso de maquinaria o por el granizo. Para un buen
control se debe evitar el uso de maquinaria en variedades susceptibles.
Fusariosis es la enfermedad causada por el agente patogeno,
Fusarium
moliniforme, se distribuye en todos los órganos de la planta. Esta enfermedad
comúnmente afecta a las raíces, la base de la planta y entrenudos bajos. La pudrición
comienza normalmente poco después de la polinización y se vuelve más severa al
madurar la planta. Este patógeno produce una toxina llamada zearalenona que puede
producir trastornos en los animales tanto en vacunos como en equinos (Paratobi, 1995)
Polvillo es una enfermedad producida por Puccinia sorghi o como tambien se le
conoce “roya”, se manifiesta por la presencia de pústulas aisladas, sobre hojas y
vainas, de color castaño o café rojizo que aparecen a fines de primavera o comienzos
de verano; los ataques
de esta enfermedad por lo general no producen mayores
disminuciones en los rendimientos por sus ataques tardios en los campos de nuestro
pais. (Paratobi, 1995)
A su vez, el agricultor puede minimizar los problemás de enfermedades
utilizando la rotación de cultivos, destruyendo residuos de los cultivos, sembrando
variedades resistentes, y siguiendo las fechas de siembra recomendadas.
2.5 Antecedentes de Fusarium.
Hongos del género Fusarium son causantes de muchos problemás de
marchitamiento vascular en un gran numero de especies vegetales, siendo el maíz
una de las cuales se ha visto más afectada. (Agrios,1996) , el maíz dulce , no escapa a
la susceptibilidad de la infección.
Fusarium constituye un problema serio, el cual afecta el rendimiento de los
cultivos provocando la obstrucción del flujo normal de agua y nutrientes, a través de los
haces
vasculares.
Éstos
se
necrosan
por
acción
del
patógeno.
Existen
aproximadamente 40 especies de este género, de las cuales el 50 por ciento son
patogénicas. Su éxito se atribuye a su amplio espectro de acción (Price,1982).Bot.
1971, citado por Price (1982), enumeró 43 especies de Fusarium, las cuales pueden
dividirse en cuatro grupos principales:

Patógenos de las plantas

Patógenos de insectos

Saprofitos

Habitantes del suelo
Existen algunos de estos patógenos que son capaces de atacar tanto a insectos
como a plantas, o vivir activamente lejos de su hospedero. De estos 43, unos 27 son
patogénicos para las plantas e incluso algunos están entre los patógenos más serios
de la agricultura, debido a que su efecto en los rendimientos de las cosechas es
enorme (Price, 1982).
Fusarium produce tres tipos de esporas sexuales; microconidias, macroconidias
y clamidosporas. Las primeras están compuestas por una o dos células, siendo éstas
las que el hongo produce con mayor frecuencia y abundancia en todas las condiciones.
Además, son las únicas que produce el patógeno al interior de los vasos xilematicos
de plantas hospederas que ha infectado y que actuarían como inóculo secundario, las
macro conidias son las esporas típicas de Fusarium sp. y están constituidas por tres a
cinco células, las que se elongan gradualmente curvándose hacia ambos extremos.
Con frecuencia aparecen sobre la superficie de plantas que han sido destruidas por el
patógeno. El tercer tipo de espora que desarrolla este patógeno son las clamidosporas,
que corresponden a estructuras de resistencia constituidas por una a dos células. Los
tres tipos de esporas pueden ser encontrados, tanto en el suelo, como en el cultivo in
vitro del hongo (Agrios, 1996).
Fusarium sp. es un patógeno habitual del suelo que infecta a las plantas a
través de las
raíces, penetrando en forma directa o por heridas. El micelio y las
esporas ascienden a través de los vasos xilematicos por la corriente transpiratoria
(Agrios, 1996). Es un organismo saprófito que puede permanecer en el suelo por
tiempo indefinido; se propaga principalmente como micelio, esporas o clamidosporas a
través del agua de riego, el equipo agrícola, estructuras vegetativas y semillas de
algunas plantas (Agrios, 1996).
La mayoría de las enfermedades causadas por Fusarium sp. son difíciles de
controlar ya que solo una infección provocada por una espora es suficiente para
introducir al patógeno en la planta, donde se desarrolla y propaga (Agrios.1996).
2.5.1 Sintomatología
Algunos de los síntomás de esta enfermedad son, pudrición seca de la base
del tallo con desintegración de la médula comenzando desde los nudos; aparición de
micelio rojizo en la superficie del tallo. Bajo condiciones de alta temperatura ambiental
y humedad a la vez, se obseva quiebre de tallos y madurez anticipada. En el follaje se
aprecian las vainas con manchas rojizas , aparecen también manchas acuosas,
principalmente en las hojas no desplegadas, las cuales cambian a un color blanco con
textura similar al papel, de bordes café. El daño más importante es una pudrición
desintegradora de la corona de la planta, pudiendose presentar tambien el síntoma de
mazorca colgante. (Latorre,1992)
Cuando las hojas son infectadas no se desarrollan, doblándose las puntas hacia
abajo. Ocasionalmente se desarrollan manchas necroticas en la parte alta del tallo, y
las mazorcas forman granos agrietados; generalmente la enfermedad ataca como
manchones en el potrero o varias plantas sobre la hilera. (Latorre,1992)
.
2.5.2 Ciclo Biológico.
El hongo se desarrolla en residuos de cosecha en o sobre la superficie del
suelo. Bajo condiciones adecuadas, infecta los tallos del maíz directamente o a través
de heridas causadas por insectos. Fusarium moliniforme puede penetrar el tallo en la
vaina de la hoja (ligula) y avanza
hacia los entrenudos inferiores. El hongo se
encuentra comúnmente en la semilla en la cual se disemina. Pero la diseminación es
más eficiente tanto por el viento como por el suelo contaminado, aunque también
ocurre un arrastre de esporas con el agua de riego a plantas vecinas. (Latorre,1992)
Al sembrar semillas en suelo contaminado, los tubos germinales de las esporas
o el micelio penetran directamente en las puntas de las raíces o ingresan a través de
lesiones producidas por insectos o vectores. El micelio del patógeno se propaga
intercelularmente a través de la corteza de la raíz y cuando invade
los vasos
xilematicos, entra a través de las punteaduras. Se mantiene solo en los haces
vasculares y viaja a través de ellos, principalmente en sentido ascendente, hacia el
tallo y corona de la planta. Cuando llega a los vasos, el micelio se ramifica y produce
microconidias que se desprenden y son llevadas hacia la parte superior de la planta.
Éstas germinan donde finaliza su movimiento ascendente. Posteriormente, penetra la
pared superior del vaso y el patógeno produce más microconidias en el vaso siguiente
(Agrios,1996)
El patógeno causa marchites y bloquea el tejido vascular de la planta,
impidiendo el paso del agua y nutrientes hacia la parte aérea. La infección de las raíces
es favorecida por temperaturas calidas del suelo , y por condiciones de humedad.
2.5.3
Alternativas de Control.
No existe un control efectivo para detener la muerte de la planta después que la
infección ha tenido lugar, así, el control se basa en la prevención.
La desinfección de los suelos con productos químicos antes de la siembra y
posteriormente un control regular, suprimirá los hongos en el suelo y protegerá a las
plantas contra una infección (Lubbe,2001). El mejor método de prevención puede ser el
uso de material vegetal tolerante o resistente (Agrios, 1996).
Tradicionalmente se ha fumigado el suelo previo a la siembra, no obteniéndose
buenos resultados y encareciendo los costos del cultivo.
El uso de biocontroladores es una alternativa interesante que ha sido
investigada. Numerosos microorganismos han demostrado ser efectivos en el control
de varios hongos del suelo incluyendo Fusarium sp. Entre los controladores biológicos
que comienzan a ser utilizados con mayor frecuencia en nuestro país esta Trichoderma
spp.
2.5.4 Control Biológico
El control biológico de los patógenos, es decir, la destrucción total o parcial de
sus poblaciones por medio de otros microorganismos, frecuentemente ocurre en la
naturaleza. Por ejemplo existen varias enfermedades en las cuales el patógeno no
puede desarrollarse en ciertas areas, debido a que el suelo contiene microorganismos
antagónicos a él, o bien porque las plantas atacadas por éste, han sido inoculadas
naturalmente con antagonistas (Agrios, 1997).
Las medidas de control biológico tratan de mejorar la resistencia o tolerancia de
las plantas ante los patógenos, y a la vez intentan favorecer microorganismos que son
antagónicos a ellos (Latorre,1992).
Control biológico se entiende como la reducción de la cantidad de inóculo,
desarrollo, actividad o daño del patógeno efectuado por uno o más organismos
distintos al hombre (Cook y Baker, 1974). Este tipo de control raramente elimina el
patógeno del lugar, pero si reduce su población o su habilidad para producir
enfermedad (Cook y Baker, 1989).
El objetivo del control biológico es estimular la colonización de las plantas o del
suelo, por antagonistas saprofitos capaces de multiplicarse y disminuir el inóculo de los
patógenos (Blakeman y Fokkema, 1982).
El control biológico de patógenos del suelo a través de adición de
microorganismos antagonistas, es un medio no contaminante potencial para el control
de enfermedades de plantas (Elad et al., 1983).
Para introducir antagonistas al medio , las condiciones de importancia a
considerar son las siguientes:

Viabilidad

Formulación

Concentración del antagonista

Clases de coadyuvantes

Eficacia y tiempo de aplicación

Microclima durante y después de la aplicación

Y por último, costo del producto
Un controlador biológico debe ser activado bajo las mismás condiciones
ambientales que el patógeno, ser compatible con otros biocontroladores y además
tener la capacidad de colonizar el sector de la planta o el suelo donde se esta
aplicando. Un ejemplo de microorganismos que reunen estas características son
hongos del género Trichoderma , el cual se instala desplazando hongos patógenos
que habitan el suelo (Agrios, 1997). Este género contituye un buen microorganismo
antagónista reduciendo la cantidad de inóculo del patógeno. El micelio y las esporas
de resistencia (oosporas , esclerocios) de varios hongos fitopatógenos del suelo como
Pythium, Rhizoctonia, son invadidos y parasitados o bien lisados por otros hongos,
que por regla general no son fitopatogenos. Entre los microparasitos más comunes
destaca Trichoderma harzianum, que se ha demostrado
parasita el micelio de
Rhizoctonia, y Sclerotium, inhibe el crecimiento de otros como Pythium y Fusarium, y
reduce la magnitud de las enfermedades causadas por la mayoría de estos
patógenos (Agrios, 1997).
Los mecanismos por los cuales los microorganismos antagónicos afectan a
las poblaciones de patógenos, generalmente se resumen en cuatro:
1. Parasitismo directo y muerte del patógeno.
2. Competencia con el patógeno por el alimento (nutrientes)
3. Efectos tóxicos directos sobre el patógeno por medio de sustancias
antibióticas liberadas por el antagonista
4. Efectos tóxicos indirectos sobre el patógeno por medio de sustancias
volátiles liberadas por el antagonista.
Muchos de los microorganismos antagónicos mencionados anteriormente
existen de forma natural en los suelos, independiente de la actividad humana. Sin
embargo, el hombre hace intentos por introducirlos con poblaciones nuevas y más
prolíficas de antagonistas (Agrios, 1997).
2.6
Trichoderma spp.
Trichoderma es un género ampliamente estudiado en todo el mundo desde
hace 70 años. Sus
propiedades de controlador biológico, son reconocidas sobre
múltiples patógenos de las plantas (Cook y Baker, 1989; Campbell, 1989; Boland y
Kuykendall, 1998). Por consiguiente se ha producido un desarrollo tecnológico en
torno ha este género, proliferando un gran numero de formulaciones comerciales en el
mercado de insumos agrícolas, siendo 3Tac una de estas formulaciones.
Trichoderma tiene la característica de poder controlar tanto patógenos del suelo
como foliares lo que lo hace una buena alternativa en el control de enfermedades en
las plantas y una alternativa al control químico. Tiene requerimientos nutricionales
mínimos y crecen rápidamente con abundante esporulación (Evaleigh, 1985). Suelos
con humedad , pH más bien ácidos y una fuerte disponibilidad de sustratos (materia
orgánica con actividad microbiológica) son una fuente ideal de establecimiento (Cook y
Baker,1989). En cuanto a las temperaturas óptimás de crecimiento saprofito sobre los
sustratos están dentro del rango de los 15 y 21 °C. Este hongo presenta un rápido
crecimiento, ya sea en la superficie de las hojas, tallos e inclusive en las raíces. Su
aplicación dependiendo de la formulación puede ser aplicada de manera convencional
ya sea en la siembra en la aporca o en inoculaciones en la semilla.
2.6.1 Morfología y taxonomía
Thichoderma es un hongo perteneciente a los Deuteromycetes, familia
Moniliales. Es un hongo cosmopolita (Harman,2003)
Pertenece al orden Hyphomycetes, cuyo estado sexual o teleomorfo
correspondería a un hongo ascomytina productor de peritecios (Alexopolus , 1996). Es
un hongo imperfecto, sin embargo Baltsville, Chavarri y Samuels lograron identificar el
estado sexual o teleomorfo del hongo T. harzianum como Hyprocrea peronoidea
confirmado por un análisis de la secuencia de ADN (USDA,1996). Su estructura de
esporulación son conidios, y su estructura de resistencia, clamidosporas; siendo estas
similares a las de otros hongos formadores de las mismás estructuras y de tamaño 5 a
10 veces más grandes que los conidios, por sus grandes reservas de lípidos (Cohen ,
1983). Son intercalares o terminales, de forma cilíndrica a globosa (Wildham, 1986), y
representan la forma de propagación más efectiva (Bautista y Acevedo, 1993). Por otra
parte, posee conidias suaves, verdes, subglobosas a cortas ovoides de 2,4 a 3,2 x 2,2
a 2,8 m. Sus colonias son de rápido crecimiento, con micelio compacto y de
coloración blanco a verde (Cook y Baker, 1989). Los cultivos en placas toman un color
verde brillante debido a los conglomerados de conidios que se forman en las hifas
(Velásquez y Pineda, 1995).
Fig. 1: Colonias de Trichoderma harzianum strain T-22 (KRL-AG2) creciendo en
PDA. Las areas blancas no contienen esporas, las areas verdes están cubiertas con
densas areas de esporas (conidias). (E. Harman, Cornell University, 2000)
2.6.2 Mecanismos de Acción
Los mecanismos de acción de Trichoderma son: micoparasitismo, competencia
por los nutrientes en el exudado de semillas y/o antibiosis (Cornell University, 1998;
Lifshits, 1986; Harman, 1981). Estos últimos autores sugieren que el micro parasitismo
es el principal mecanismo de acción de Trichoderma. Este agente biocontrolador
envuelve el hongo a atacar y penetra sus células causándole un daño extensivo (Elad,
1983) al producir:

Alteración de la pared celular, incluyendo la degradación de ésta.

Retracción de la membrana plasmática de la pared.

Desorganización del citoplasma .
También actúa sobre la replicación celular al inhibir la germinación de esporas y
la elongación del tubo germinativo (Lorito et al., 1993). Además se sabe que algunas
razas de Trichoderma son capaces de producir antibióticos, especialmente a pH bajo.
La producción de las enzimás quitinasa y -(1-3)-gluconasa, se ha observado al actuar
sobre R. solani y S. rolfsii, degradando sus hifas (Cook y Baker, 1989).
Este biocontrolador es un habitante común del suelo, y ha sido reportado como
un
eficiente
micoparasito
de,
Phytium
,
Phytophtora,
Rhizoctonia
solani,
Chondrostereum purpureum, Sclerotium rolfsii y Heterobasidion annossum (Cook y
Baker, 1989)
A modo de ejemplo se puede explicar la relación de Trichoderma spp. con
Rhizoctonia solani. Benhamou y Chet (1993), afirman que los daños comienzan a
observarse cuando ambos hongos entran en contacto, reiterando que el mecanismo de
acción es el micoparasitismo y no la antibiosis, como había sido señalado por otros
autores. Sin embargo, Lo, (1998), señalan que en la relación Trichoderma Rhizoctonia se generan 2 tipos de interacción. Una reacción Tipo I, en donde las hifas
del patógeno se aprecian dañadas, necroticas y aparentemente vacías, indicando que
la producción de toxinas representa un papel importante en el control del patógeno.
Estos daños podrían deberse a enzimás extracelulares y a antibióticos solubles y
volátiles liberados por Trichoderma spp. en la reacción Tipo II, se observa el
enrollamiento de Trichoderma sobre Rhizoctonia, típico en microparasitismo. Este seria
menos frecuente que la reacción Tipo I (Lo, 1998).
Fig. 2 : Micoparasitismo de Trichoderma sobre el patógeno (Pythium). Trichoderma fue
teñido con un compuesto anaranjado y el patógeno con un compuesto verde.
(Hubbard et al., 1983)
2.6.3 Relación de Trichoderma con la planta.
Trichoderma es un hongo que se puede encontrar tanto fuera como dentro de la
rizosfera (Beagle-Ristaino, 1985 y Papavizas, 1981). Es en esta última donde puede
colonizar y proteger las raices de las plantas (Lorito et al., 1993). Varios autores han
señalado el incremento en peso de las plantulas que se desarrollan en presencia de
este hongo.
La estimulación del crecimiento de raices por efecto de la presencia de
Trichoderma, fue reportada por Björkman en 1995. En experimentos de invernadero,
21 días después de plantación, el peso de raices era 50% mayor en las plantas
tratadas con el biocontrolador y la exploración del suelo fue 40% mayor. El mecanismo
de acción no ha sido identificado, pero el hongo es capáz de acidificar la rizosfera en
aproximadamente 0.1 unidades de pH, lo que podría causar un crecimiento mayor
debido a una mejor absorción, de iones (Björkman et al., 1995). Aparentemente
Trichoderma secuestra Fósforo soluble en el micelio, y además, es capáz de crecer a
lo largo de las raices durante su elongación, colonizando axial todo el sistema radical
(Sivan y Chet, 1989). A medida que el micelio se va degradando con la edad, el fósforo
queda disponible para las plantas. De forma interesante, los patógenos Pythium y
Rhizoctonia son incapaces de solubilizar fosfato, dándole una alta eficiencia a
Trichoderma en el control de enfermedades. Altomare et al., (1996) sugieren que la
promoción del desarrollo se deba a que Trichoderma tiene la capacidad de solubilizar
el manganeso sin importar el pH del medio ni la disponibilidad del nutriente. Este
microelemento es requerido para varias funciones fisiológicas de las plantas, jugando
un papel importante en el crecimiento y la resistencia a enfermedades.
Los beneficios que recibe Trichoderma por estar asociado a las raices de las
plantas no han sido estudiados, pero al remitirnos a las necesidades del hongo en el
suelo, como son, una buena aireación, humedad, pH (Cook y Baker, 1989), carbono
orgánico (Eastburn y Butler, 1988), estos son usualmente favorecidos por la presencia
de raices (Cook, 1983).
3. MATERIALES Y METODOS
3.1 Ubicación del ensayo
El ensayo se llevó a cabo en el campo de investigación de la empresa Acre
Seed Ltd. ubicado en el sector llamado
Bajo Los Rocos , Cruce Sanatorio a 10
minutos de San Clemente. El periodo de evaluaciones se desarrolló desde diciembre
de 2005 a marzo de 2006. La temperatura mínima se registró en el mes de marzo y
fue de 2 °C y la máxima se registró en el mes de enero de 32.5 °C.
Del campo se tomaron muestras de suelo en forma previa para confirmar la
presencia de Fusarium.
3.2 Material vegetal
Se utilizó semilla parental de maíz dulce la cual ha presentado alta
susceptibilidad a la infección del hongo Fusarium spp. en temporadas anteriores, La
semilla fue proporcionada por la empresa Acre Seed ltd., y se encontraba tratada con
los productos Crusier (Thiametoxam, insecticida) y Force (Teflutrina, insecticida)
(AFIPA, 2003)
3.3 Controlador Biológico 3Tac ( según descripción de la empresa)
Biofungicida, compuesto por tres especies de Trichodermas que cohabitan
activamente.(T. harzianum, T. viride, T. longibrachiatum)
Las necesidades y características del producto son :
• Biomása activa al momento de ser usada.
• Acción certera sobre hongos fitopatógenos radiculares, medulares y foliares.
• Efectiva respuesta frente a “pudrición ácida”.
• Establece una relación simbiótica con la planta, liberando en forma controlada
citoquininas
• No mancha, no deja olor ni sabor.
• Exento de tolerancia EPA – USA
• Por su formulación orgánica no tiene carencias ni restricciones de ingreso a los
huertos tratados. No afecta a los artrópodos útiles como abejas y chinitas.
• Fungicida de acción sistemica.
Está comprobado que además de controlar los hongos fitopatógenos, libera al
suelo cantidades importantes de Ácido Giberélico, con lo que permite obtener una
mayor mása radicular para enfrentar indirectamente a los ataques de nematodos.
Además 3Tac puede ser usado tanto en campo como en invernadero
3.4 Obtención e identificación de Fusarium sp
Las muestras de suelo y de cultivo se tomaron el 4 de noviembre del año 2005
del campo de investigación cruce a Sanatorio, el cual el año anterior fue sembrado con
maíz. Los rastrojos presentaban síntomás característicos de Fusarium sp. Y a partir
de estas muestras se aisló el hongo en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA).
De acuerdo a Agrios (1996), con el fin de comprobar la identidad del patógeno,
se realizó una observación al microscopio de la morfología del micelio y de las esporas
desarrolladas (macro y microconidias) en las colonias obtenidas. Con este propósito se
colocó sobre un portaobjeto, parte del micelio, el que fue suspendido en agua
destilada, situando un cubre objeto sobre la muestra preparada, observándose en el
microscopio las estructuras antes mencionadas.
Una vez comprobado que la morfología observada correspondía a Fusarium
sp., se procedió a la obtención de cultivos puros. Para tal fin el patógeno fue replicado
y multiplicado en placas petri en medio de cultivo PDA.
3.5 Pruebas de patogenicidad
Con el propósito de comprobar si el hongo aislado presenta patogenicidad y las
plantas susceptibilidad, se sembraron 40 plantas de maíz dulce , en una bandeja de
germinación.
El inóculo se obtuvo desde una placa petri, sacando con un asa trozos de
micelio, los que se diluyeron en un matraz con agua destilada estéril, agitándose por un
periodo de una hora para lograr el desprendimiento de las esporas del hongo. Además,
se agregó Tween 20 (0.1%), a la suspensión , para separar las conidias y poder
efectuar el conteo de éstas. Luego se colocó una gota de suspensión sobre un
portaobjetos y se observó al microscopio la presencia de conidias.
La concentración de conidias a inocular se estimó usando una cámara
Neubahuer, para lo cual se empleó la siguiente fórmula:
Partículas / μl =
Partículas contadas
Profundidad cámara de dilución * Dilución* Superficie contada
Donde :
Profundidad de cámara = 0,100 mm
Dilución
=1
Superficie contada
= 0,0025 mm2
Partículas / μl
= conidias por microlitros (c/ μl)
Luego de ésto se aplicaron, con una jeringa estéril, 10ml por planta del inóculo,
ajustado a una concentración de 106 conidias por ml1, sobre una herida hecha con
bisturí, a 1 centímetro por encima del cuello de la planta. Luego éstas se expusieron a
la temperatura ambiente y luminosidad para permitir la fotosíntesis y la posterior
absorción de agua y el transporte de las conidias.
A los 10 días se observaron los síntomás
de Fusarium en las plantas
inoculadas y un crecimiento normal en las utilizadas como testigo (40 plantas) en las
que al igual que las inoculadas se realizó un corte por encima del cuello.
3.6 Descripción del ensayo
La semilla fue separada en sobres individuales (35 semillas por sobre, 72
sobres
en
total),
siendo
tratadas
solo
en
los
tratamientos
y
repeticiones
correspondientes, el resto de las aplicaciones fueron relizadas en terreno posterior a la
siembra.
Las aplicaciones al suelo fueron realizadas en el momento previo de la siembra
incorporadolo al suelo mediante motocultivador.
Las aplicaciones al momento de la aporca se realizaron mediante bomba de
espalda manual direccionada al cuello de la planta.
El tratamiento de inoculación fue de 100 gramos de 3Tac por 15 litros de agua
para los tres casos. Esta es la dosis utilizada por la empresa en forma comercial. La
diferencia de aplicación solo ocurrió en el caso de inocular los sobres, la cual fue
realizada mediante jeringa.
La inoculación del patógeno en el suelo no fue necesaria debido a su presencia
natural determinada en el punto 3.4.
El ensayo consideró 8 tratamientos
Cuadro 3.1 Tratamientos del ensayo. Detalle de las inoculaciones y concentraciones de
3Tac.
Inoculación a la
Aplicación al
Aplicación a la
Dosis por aplicación
semilla
suelo
aporca
De 3Tac
(se)
(su)
(ap)
grs./15ltrs agua
T1
SI
NO
NO
100
T2
NO
SI
NO
100
T3
NO
NO
SI
100
T4
SI
SI
NO
100
T5
SI
NO
SI
100
T6
NO
SI
SI
100
T7
SI
SI
SI
100
T8
NO
NO
NO
0
Tratamiento
3.7 Análisis de semillas en laboratorio
Después de haber sido sembrado el ensayo se enviaron al laboratorio de la
empresa Avance Biotechnologies para ser analizados dos sobres con la tabulación de
73 y 79 (Fig. 3 y 4) los cuales se encontraban sin inoculación y con inoculación de
Trichoderma (3Tac) respectivamente. En laboratorio se realizaron los siguientes
análisis según informe emitido por la empresa:
Figura. 3 y 4. Vista general de dos sobres con semillas inoculadas (73) y sin inocular
(79) muestras analisadas en laboratorio.
Preparaciones para microscopía, (sin tinción).
Se escogieron al azar tres semillas de ambas muestras y se sembraron en medios de
cultivos polivalentes para el desarrollo de hongos y levaduras (PDA). Las placas fueron
incubadas por 4 días a temperatura ambiente.
Se escogieron al azar semillas de ambas muestras y fueron incubadas sobre
algodón húmedo al interior de una placa petri para visualizar viabilidad (germinación).
Los análisis se realizaron siguiendo los criterios establecidos por protocolo de muestras
laboratorio Avance Biotechnologies.
3.8 Evaluaciones
Durante el transcurso del ensayo se realizaron evaluaciones de incidencia y
severidad de la enfermedad sobre las plantas de maíz, para lo que se realizaron dos
mediciones: siete dias después de la emergencia , y
fisiológica. La incidencia de la enfermedad se midió
al momento de madurez
en (%) utilizando la formula
empleada por Ogawa (1986).
Incidencia (I) = Nº de individuos afectados * 100
Total de individuos por hilera
Para determinar la severidad de la enfermedad sobre las plantas, se utilizo la
escala que a continuación se detalla
0 = Sin marchitez
(
0%
)
1 = Marchites leve
( 1 - 25%)
2 = Marchites moderada
(26 – 50%)
3 = Marchites severa
(> a 50%)
3.9 Diseño experimental
El ensayo se planteó utilizando un diseño estadístico completamente al azar
(DCA), con 8 tratamientos y tres repeticiones por tratamiento. Cada
unidad
experimental estaba constituida por 35 plantas de maíz.
Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza, y en el caso en
que existieran diferencias significativas se utilizó la prueba de separación de medias
Duncan, con un nivel de significancia de un 95%, en el programa estadistico
statgraphics Plus 5.1.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Identificación del hongo Fusarium
Para identificar el patógeno se consideraron tanto características de coloración
del micelio como morfológicas de las conidias. Así el color de las colonias en PDA fue
cambiando a medida que el cultivo envejecía. De esta forma, cultivos jóvenes
presentaron una tonalidad rosada pálida, mientras aquellos más envejecidos mostraron
una coloración púrpura. En relación a la forma de las conidias encontradas en el medio
de cultivo PDA, se observaron algunos con forma de medialuna constituidas por tres a
cinco células y otras redondas formadas por una o dos células. Estos corresponden a
las macroconidias y microconidias del hongo, respectivamente, según lo descrito por
Agrios (1996).
4.2 Pruebas de patogenicidad
Luego de haber transcurrido 7 días desde la inoculación de las plantas de maíz
con el hongo aislado de las muestras de suelo, se observaron los primeros síntomás
asociados a Fusarium en 10 de las 40 plantas incluidas en la prueba de inoculación.
El resto de las plantas manifestaron los síntomás posteriormente, según se
presenta en el siguiente cuadro.
Cuadro 4.1 Resultados de la prueba de patogenicidad efectuado en plantas de maíz,
inoculada con Fusarium. Aislado de muestras de suelo del sector bajo los rocos ,
camino Sanatorio. San Clemente.
Días después
Nº de plantas
de inoculación
enfermás
7
10
25
14
15
37,5
21
25
62,5
28
40
100
Incidencia (%)
La sintomatología presentada se evidenció inicialmente como una marchitez de
las hojas jóvenes, la cual se hizo más severa a medida que pasaban los días. No se
presentó clorosis en las hojas, sino que éstas se necrosaron y se mantuvieron sujetas
al tallo. El marchitamiento y necrosis finalmente comprometió la totalidad de las hojas.
Adicional a esto se produjo una muerte de la planta.
Las plantas inoculadas presentaron en su totalidad los síntomás descritos
anteriormente observandose, al cabo de 4 semanas de la inoculación 100 % de
incidencia.
Una vez terminado el test de patogenicidad se procedió al aislamiento del
patógeno que produjo los síntomás en las plantas, el cual fue el mismo patógeno
inoculado inicialmente, Fusarium sp. la inoculación se realizo en PDA al igual que en
las veces anteriores cumpliendo con los postulados de Koch. Al observar las colonias
desarrollandose bajo microscopio se comprobó de acuerdo a las caracteristicas de las
esporas que estos correspondian al patogeno inoculado.
Las plantas que no se inocularon y en los que se realizaron cortes en los tallos
no presentaron síntomás, es decir no fueron afectadas por ningún patógeno y el hecho
de realizar un corte no fue causal de marchitez.
4.3 Evaluaciones de 3Tac en el control de Fusarium en una línea parental de maíz
dulce.
4.3.1 Altura final de plantas
Se detectaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre
las medias de los
distintos tratamientos. Las alturas más altas las presentaron los tratamientos 7 (con
inoculaciones en la semilla, al suelo, y en la aporca) y 6 (con inoculaciones al suelo y la
aporca) con valores de 93,4 cm. y 89,92 cm., respectivamente. El tratamiento 8
(testigo) presentó la media más baja 39,41cm (Fig 12). Y diferencias significativas con
los tratamientos, 1, 4, 5, 6 y 7. En el caso del tratamiento 7 este presentaba una
cantidad de inóculo de 3Tac suficiente para cubrir toda la temporada de crecimiento del
maiz, especialmente las etapas donde se realizan labores culturales que dañan las
raices y facilitan el ingreso de los patogenos a la planta como lo es Fusarium.
Los tratamientos 1, 4 y 5 también presentaron diferencias con el testigo, lo que
implica que las aplicaciones de 3Tac en ellos tambien tuvo efectos estadísticamente
significativos sobre la altura de las plantas de maiz dulce. Esto confirma lo señalado
por Wildman et al.,(1986) el cual señala que Trichoderma harzianum (una de las tre
cepas que contiene el biocontrolador) podria incrementar el crecimiento de las plantas
1
por medio de un factor regulador del crecimiento, el cual aumentaria la tasa de
germinación de semillas y el peso seco de plantas.
Altura en Centimetros
Altura de Plantas
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
a
ba
b
b
cb
cb
c
1
2
3
4
5
6
7
Altura de Plantas
8
Tratamientos
Figura.4.1 Altura de plantas de maìz dulce parental tratadas con 3Tac. San Clemente
temporada 2005/2006
1
Tratamientos con la misma letra no difieren estadísticamente entre si según analisis utilizado (Duncan) (p ≤ 0.05)
T1: inoculación de semilla antes de la siembra con , T2: aplicación al suelo previo a la siembra (incorporado al suelo)
T3: aplicación al momento de la aporca, T4 inoculacion de semilla + aplicación al suelo, T5: inoculación de semilla +
aplicación al momento de la aporca, T6: aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T7: inoculación de
semilla + aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T8: testigo (sin aplicaciones)
4.3.2 Peso Seco
El analisis de andeva del peso
seco de las plantas arrojo diferencias
significativas (p ≤ 0.05) entre el tratamiento 7 (con inoculación de semillas, aplicación al
suelo y en la aporca) y los restantes tratamientos. Las mayores diferencias se
observaron con el tratamiento 8 (testigo).
Las diferencias de peso pueden ser explicadas por el efecto; de mejoramiento
en la capacidad exploratoria de las raices en presencia de Trichoderma estudiado por
Björkman en 1995. Asi estos son capaces de obtener nutrientes desde una mayor
porcion de suelo que las plantas no inoculadas. En el caso de las diferencias
estadisticas entre el tratamiento numero 3 y 7 estos se pueden explicar ya que al
momento de la aplicación de 3Tac en la aporca, existia una infeccion temprana por
parte de Fusarium sp. Y por ende plantas en las que se realizo solo aplicación del
antagonista en el momento de esta labor
presentaban una
baja capacidad de
recuperacion.
Los valores observados en el tratamiento 7 , según
Agudelo et al.,(2001),
señala que existen algunos estudios preliminares en estimulacion de crecimiento sobre
plantas de frejol, en donde aislamientos seleccionados de Trichoderma spp.
incrementaron la germinación y llevaron a un aumento en la altura de las plantas
cercano a un 80 % y a ganancias en peso de aproximadamente de 60%.
Peso de Plantas en Gramos
160
a
1
140
Peso en Gramos
120
b
100
cb
2
cb
cb
cb
80
c
60
d
40
20
0
1
2
3
4
5
Tratamientos
6
7
8
Peso de Plantas en Gramos
Figura 4.2 Peso de plantas de maìz dulce parental tratadas con 3Tac. San Clemente
temporada 2005/2006
Tratamientos con la misma letra no difieren estadísticamente entre si según analisis utilizado (Duncan) (p ≤ 0.05)
T1: inoculación de semilla antes de la siembra con , T2: aplicación al suelo previo a la siembra (incorporado al suelo)
T3: aplicación al momento de la aporca, T4 inoculacion de semilla + aplicación al suelo, T5: inoculación de semilla +
aplicación al momento de la aporca, T6: aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T7: inoculación de
semilla + aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T8: testigo (sin aplicaciones)
4.3.3 Peso de mazorcas
El peso de mazorcas tambien presento resultados estadísticamente diferentes
entre los distintos tratamientos. El Testigo donde este presento una media de 21,84
gramos. Y los tratamientos numero 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, los cuales no presentaron
diferencias estadísticamente significativas entre si.
Las plantas afectadas con Fusarium, presentan una marchitez bastante
caracteristica y disminución del area foliar. Al encontrarce bajo condiciones de estrés
la acumulación en las mazorcas de fotoasimilados se ve reducida pr efecto del ataque
del hongo en los haces vasculares y por consiguiente esto puede explicar los bajos
valores de peso de mazorcas, particularmente en el tratamiento testigo.
Peso Mazorcas en Gramos
60
a
Peso Mazorcas en Gramos
50
a
a
a
40
a
1
a
ba
30
b
2
20
10
0
1
2
3
4
5
Tratamientos
Figura . 4.3 Peso de mazorcas de maìz
6
7
8
Peso Mazorcas en Gramos
dulce parental tratadas con 3Tac. San
Clemente temporada 2005/2006
Tratamientos con la misma letra no difieren estadísticamente entre si según analisis utilizado (Duncan) (p ≤ 0.05)
T1: inoculación de semilla antes de la siembra con , T2: aplicación al suelo previo a la siembra (incorporado al suelo)
T3: aplicación al momento de la aporca, T4 inoculacion de semilla + aplicación al suelo, T5: inoculación de semilla +
aplicación al momento de la aporca, T6: aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T7: inoculación de
semilla + aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T8: testigo (sin aplicaciones)
4.3.4 Severidad de la enfermedad siete dias después de emergidas las plantas de
maiz.
En la primera evaluacion a los 7 dias después de emergidas las plantas (7dde),
solo 4 de los tratamientos fueron evaluados, debido a que en los restantes aún no se
realizaban las aplicaciones del biocontrolador
en su totalidad o bien aun no se
aplicaba.
Todos los tratamientos evaluados en esta fecha, mostraron plantas afectadas
con Fusarium (Cuadro 4.2). El tratamiento 4 presentó diferencias significativas con los
tratamientos 1, 2, y 8, en cuanto al porcentaje de plantas, evidenciando una mayor
cantidad de individuales con indice de severidad 0.
En el caso del indice de severidad 2 (marchitez moderada) para esta primera
evaluacion no se observan diferencias significativas entre los tratamientos. Por otra
parte para el índice de severidad 3 los tratamientos con aplicación del antagonista
difieren del testigo, lo que indica que Trichoderma permitió reducir el porcentaje de
plantas con un mayor grado de infeccion.
Cuadro 4.2 Nivel de severidad de fusariosis en plantas de maiz dulce (parental)
tratadas con Trichoderma (3Tac) evaluadas a los siete dias después de emergidas
evaluacion temporada 2005/2006 , San Clemente.
Grados de Severidad
Tratamientos
0
1
2
3
1
6,33 b
36,99 a
31,76
24,90 b
2
8,37 b
14,37 c
45,15
32,10 b
4
29,33 a
26,47 b
29,36
14,83 cb
8
1,23 c
0,0 d
47,28
51,48 a
Tratamientos con la misma letra no difieren estadísticamente entre si según analisis utilizado (Duncan) (p ≤ 0.05)
Nomenclatura; se: inoculación de la semilla; su: aplicación al suelo; ap: aplicación al momento de la aporca al cuello de
la planta.
T1: inoculación de semilla antes de la siembra con , T2: aplicación al suelo previo a la siembra (incorporado al suelo)
T3: aplicación al momento de la aporca, T4 inoculacion de semilla + aplicación al suelo, T5: inoculación de semilla +
aplicación al momento de la aporca, T6: aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T7: inoculación de
semilla + aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T8: testigo (sin aplicaciones)
4.3.5
Severidad de la enfermedad en madurez fisiologica.
En la segunda evaluacion en madurez fisiologica
las medias de indice de
severidad 0 arrojaron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos,
siendo el 7 (inoculación de semilla + aplicación al suelo + aplicación en la aporca) el
que presentó los mayores porcentajes de plantas sanas en esta etapa del cultivo. La
madurez fisilogica se alcanza aproximadamente 15 a 23 dias después de emergida la
seda, dependiendo de la variedad.
El tratamiento 6 (aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca), fue
el segundo mejor evaluado con un 38,26 % de las plantas sanas.
El testigo, no presento plantas sanas al momento de la medicion; lo que en
resumen confirma que el biocontrolador 3Tac tuvo efecto sobre el control de Fusarium
en las plantas sembradas en el ensayo.
Los tratamientos 4 (inoculación de la semilla
+ aplicación al suelo) y 5
(inoculación de semilla + aplicación al momento de la aporca), no presentaron
diferencias estadisticas entre si, esto se puede explicar por la presencia del
biocontrolador 3Tac y su posible buen establecimiento en la rizosfera de la planta.
Inicialmente los tratamiento 1, 2, 3 no presentaron diferencias significativas con
el testigo para este nivel de severidad.
En la escala de severidad 1 los tratamientos presentaron muy poca variabilidad,
diferenciandoce estadísticamente los tratamientos 1, 5, 6, 7, del los tratamientos 2 y
3. Todos ellos a su vez fueron estadísticamente distintos del testigo.
Para el nivel de severidad 2 , solo los tratamientos 6 y 7 se diferenciaron
significativamente de los tratamientos 2 y 3, pero no asi del testigo. El tratamiento con
la media más baja fue el numero siete alcanzando solo un 11,6 % de las plantas con
severidad 2 o marchitez moderada.
Para el ultimo valor de la escala, los tratamientos 1, 2, 3, 4, 5, no presentaron
diferencias significativas entre si. Los tratamientos 2 y 3, presentaron diferencias
estadisticas con el 6 y 7 y con el testigo. Los tratamientos 7 y 6 presentaron los más
bajos porcentajes de plantas severamente infectadas por el patogeno Fusarium.
Cuadro 4.3 Nivel de severidad de fusariosis en plantas de maiz dulce (parental)
tratadas con Trichoderma (3Tac) evaluadas en madures fisiologica evaluacion
temporada 2005/2006 , San Clemente.
Grados de Severidad
Tratamientos
0
1
2
3
1
3,02 d
38,78 a
33,28 ba
24,90 cb
2
2,61 d
17,56 b
45,15 a
34,67 b
3
0,0 d
18,51 b
51,12 a
30,36 b
4
22,86 c
29,33 ba
31,08 ba
16,72 cb
5
18,56 c
32,54 a
34,26 ba
14,63 cb
6
38,26 b
36,85 a
19,30 b
5,55 c
7
46,54 a
38,92 a
11,60 b
4,01 c
8
0,0 d
0,0 c
30,43 ba
69,57 a
Tratamientos con la misma letra no difieren estadísticamente entre si según analisis utilizado (Duncan) (p ≤ 0.05)
Nomenclatura; se: inoculación de la semilla; su: aplicación al suelo; ap: aplicación al momento de la aporca al cuello de
la planta.
T1: inoculación de semilla antes de la siembra con , T2: aplicación al suelo previo a la siembra (incorporado al suelo)
T3: aplicación al momento de la aporca, T4 inoculacion de semilla + aplicación al suelo, T5: inoculación de semilla +
aplicación al momento de la aporca, T6: aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T7: inoculación de
semilla + aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca, T8: testigo (sin aplicaciones)
4.4 Incidencia de Fusarium.
La incidencia al igual que la severidad fue medida a los 7 dias después
de emergidas las plantas solo en los tratamientos 1, 2, 4, y 8, debido a que los
tratamientos restantes no se habian inoculado o tratado con el antagonista.
Entre los tratamientos 1 y 2 no existieron diferencias significativas, y
ambos
presentaron una alta incidencia de fusariosis , no presentaron
diferencias con el testigo.
El tratamiento 4 (inoculación de semilla + aplicación al suelo) presento
los valores más bajos en incidencia para esta primera evaluacion con un valor
de 70,67 %.
En la segunda evaluacion, madurez fisiologica, los tratamientos 1,2 y 3
presentaron altos valores de incidencia
no presentando diferencias
estadísticamente entre ellos. Cabe destacar que los tratamientos 1, 2
mantuvieron los valores de incidencia de la primera evaluacion (Fig. 4.4). En el
caso del tratamiento 3, este no fue evaluado a los 7 dias después de emergidas
las plantas.
En el caso especifico del tratamiento numero 4, se observa un leve
incremento en la incidencia con respecto a la primera epoca de evaluacion.
Los tratamientos mejor evaluados estadísticamente fueron el 6 y 7, los
que presentaron diferencias significativas entre si y con el resto de los
tratamientos. El tratamiento 7 presento una media de 53,46 % de plantas
enfermás.
El tratamiento 8 como se ha observado en el resto de las evaluaciones
presento un 100 porciento de incidencia en distintos grados de severidad lo
que confirma la presencia y patogenicidad de Fusarium. aislado del campo.
Cook y Baker (1983) señalaron que el periodo entre establecimiento del
patógeno y su posterior esporulacion, correspondian a la etapa más vulnerable
para que este sea desplazado por el antagonista , en este caso 3tac, además
se indica con los resultados obtenidos que al aplicar el antagonista cuando los
propágulos de Fusarium. Se encuentran en formación o antes de ser
diseminados, se lograria un control más eficiente de estos ultimos , devido a
que el controlador biologico
alcanza una mejor y mayor concentración de
inóculo cuando aun el patogeno no ha alcanzado a desarrollarce o
establecerce.
100
T1
T2
a
a
T8
T1
a
a
T2
a
T3
a
a
T4
80
T4
Incidencia (%)
T8
b
T5
T1
T2
b
T6
b
60
c
T7
d
40
T3
T4
T5
T6
T7
T8
20
T3
T5
T6
T7
0
7 Dias Despues de Emergidas
Madurez Fisiologica
Epocas de Evaluación
Figura 4.4 Incidencia de Fusarium sp. En plantas parentales de maìz dulce, tratadas
con Trichoderma (3Tac), en dos epocas de evaluación (7 dias después de emergidas
y madurez fisiologica) temporada 2005/2006, San Clemente
Tratamientos con la misma letra no difieren estadísticamente entre si según analisis utilizado (Duncan) (p ≤ 0.05)
T1: inoculación de semilla antes de la siembra.
T2: aplicación al suelo previo a la siembra (incorporado al suelo).
T3: aplicación al momento de la aporca.
T4 inoculacion de semilla + aplicación al suelo.
T5: inoculación de semilla + aplicación al momento de la aporca.
T6: aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca.
T7: inoculación de semilla + aplicación al suelo + aplicación al momento de la aporca.
T8: testigo (sin aplicaciones).
5 CONCLUSIONES

El biocontrolador presentó capacidad de disminuir la severidad de Fusariosis
sobre plantas de maiz dulce parental (Zea mays var. Rugosa) presentando los
porcentajes más bajos el tratamiento número siete, el cual presentó
aplicaciones de 3Tac (Trichoderma spp) en todas las etapas del cultivo
evaluadas.

La insidencia fue menor en los tratamientos donde se realizaron al menos dos
aplicaciones durante el periodo de crecimiento, lo que confirma que el
controlador biológico nesecita ser reinoculado para presentar mejor control, en
este caso, sobre Fusariosis.

El testigo presentó los valores de incidencia mas altos en los dos periodos de
evaluación , al igual que la severidad donde alcanzó los valores mas altos en
porcentaje en los dos últimos niveles (2,3) siendo los que presentaban la
marchitez mas alta.

En las evaluaciones de altura y peso seco , se obtuvieron los mejores valores
en el tratamiento numero siete , en contraste con el testigo.

Las combinaciones de aplicaciones presentaron en todo el ensayo los mejores
resultados.
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