Download 1. INTRODUCCIÓN En nuestro país, el cultivo del lilium como flor de

1.
INTRODUCCIÓN
En nuestro país, el cultivo del lilium como flor de corte tiene una importancia
económica relevante dentro del mercado exportador de flores, alcanzando un valor de
US $ 1,6 millones durante el año 2005, representando más del 60% del total de
exportaciones (ODEPA, 2005).
En cultivos al aire libre de la IX y X regiones, y en invernaderos de la V región, se ha
presentado una sintomatología semejante a la descrita para Botrytis (VERDUGO,
2006)*.
Este género tiene la capacidad de ser agente patógeno del cultivo provocando daño
foliar, y la consecuente pérdida económica, debido a los costos que supone su control
preventivo y curativo, debido al alto nivel de exigencia sanitaria que se requiere para
exportar.
En la V región, el cultivo para flor de invierno se realiza en invernaderos donde se
producen condiciones óptimas de humedad y temperatura para el desarrollo de esta
enfermedad, lo que favorece su propagación espacial y temporal.
El conocimiento de la etiología y epifitiología permite determinar el ciclo de la
enfermedad, con lo cual es posible manejar estrategias de control eficientes basadas
en características definidas y estables del agente causal.
* Verdugo, G., Ing. Agrónomo. Ms. Cs. Profesora cátedra Floricultura Facultad de Agronomía PUCV.
Comunicación personal.
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De acuerdo a esto, la investigación tuvo como objetivos:
•
Estudiar la etiología y epifitiología de las enfermedades causadas por el
género Botrytis en un cultivo de lilium bajo invernadero frío, con el fin de
evaluar la incidencia de este tipo de patologías en la zona de estudio.
•
Demostrar la capacidad de Botrytis cinerea y Botrytis elliptica de causar
enfermedad en plantas de Lilium sp.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Antecedentes generales de la planta de Lilium sp.:
El género Lilium pertenece a la familia de las Liliáceas, al igual que importantes
especies utilizadas como flores de corte, tales como tulipanes, narcisos y Allium.
El bulbo, carente de túnica, está formado por hojas modificadas que se agrupan en un
disco basal o tallo modificado. Estas hojas son gruesas, generalmente de color blanco
y de forma triangular, cuya función es almacenar sustancias de reserva para iniciar el
crecimiento vegetativo.
El sistema radicular es abundante, presentan raíces adventicias caulinares y otras de
tipo basal. Las raíces principales basales son carnosas con tonalidades marrones;
tienen grosores de 2 a 3 mm de diámetro y longitudes de 15 a 20 cm. Las raíces
adventicias aparecen en el tallo por sobre el bulbo y permiten el desarrollo aéreo al
complementar la función de las raíces basales.
El tallo surge del disco basal situado en el interior del bulbo. Las hojas son
lanceoladas u oval-lanceoladas, de dimensiones variables (10 a 15 cm de largo y
anchos de 1 a 3 cm), sésiles o mínimamente pecioladas. El color es generalmente
verde intenso.
Las flores se sitúan en el extremo del tallo; sus sépalos son de varios colores, y se
encuentran desplegados o curvados dando a la flor apariencia de trompeta. Se
disponen solitarias o agrupadas en inflorescencias (racimos o corimbos), mostrándose
erguidas o péndulas (BAÑON et al., 1993).
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2.2. Antecedentes generales del cultivo:
El cultivo se puede efectuar todo el año, incluso se pueden realizar hasta tres cultivos
dependiendo de las características de los cultivares.
La plantación se hace generalmente en mesas, en suelos con buen drenaje, estructura
y con buen contenido de materia orgánica. Durante el período de cultivo es necesaria
la utilización de mallas plásticas que sirven de soporte, las cuales se elevan a medida
que éste crece (SEEMANN y ANDRADE, 1999).
2.3. Condiciones ambientales en el invernadero:
2.3.1 Temperatura.
Para obtener un producto de calidad es necesario conseguir una buena formación de
raíces. Esto se consigue con temperaturas ambientales de 12 a 13 °C durante el
primer mes de plantación. Temperaturas más bajas alargan innecesariamente el
período de crecimiento.
Durante el desarrollo del cultivo, en el caso de los híbridos asiáticos, deben
mantenerse temperaturas promedio de 14 a 15°C. Para obtener la máxima calidad se
requiere que las temperaturas alcancen los 20° a 25°C durante el día y de 8 a 10 °C
durante la noche. Con temperaturas nocturnas superiores a 15-20°C se reduce la
calidad de las flores. Si las temperaturas nocturnas son superiores a 20 °C, se afecta la
calidad de la vara. Temperaturas muy bajas prolongan el cultivo.
Para los híbridos orientales, el manejo de temperaturas es más delicado, debiéndose
lograr una temperatura constante ente 15 a 17°C. Temperatura por debajo de los 15°C
pueden causar amarillamiento o caída de la hoja.
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Lilium longiflorum necesita temperaturas óptimas de 14°C a 16°C, pudiendo alcanzar
durante el día los 20 a 22° C. Si las temperaturas disminuyen de 14°C se observan
grietas en los pétalos (CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f).
2.3.2 Humedad
El nivel correcto de humedad relativa es de 80 a 85%. Es importante evitar
oscilaciones para evitar quemaduras de las hojas en cultivares sensibles. La
ventilación es fundamental para reducir la alta humedad relativa y para el control de
la temperatura. Se debe evitar que la humedad relativa baje demasiado rápido para
evitar daños en las hojas y ocasionar pérdidas de calidad. La humedad relativa alta
favorece la presencia de enfermedades, como las ocasionadas por Botrytis sp.
(CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f).
2.4. Antecedentes fitopatológicos :
Según BAÑON et al. (1993), lilium es atacado por las siguientes enfermedades:
La podredumbre del pie puede estar asociada a Phytophthora parasitica o
Phytophthora nicotianae. Los daños provocados se observan a nivel de cuello,
causando un decaimiento repentino por la obstrucción de los haces vasculares.
El hongo Pythium ultimum produce una lesión al cuello que afecta el sistema
radicular adventicio. Las raíces se vuelven café claro y de textura vidriosa, derivando
en una putrefacción general que termina con el corte del tallo, dando muerte a la
planta.
Rhizoctonia solani produce su daño a nivel de suelo. Su presencia se distingue por
que el brote apical presenta retraso en la emergencia y las primeras hojas están
podridas, las cuales caerán dejando cicatrices en el tallo.
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El hongo Fusarium oxysporum (f.sp.Lilii y f.sp. narcissi) es el agente causal de la
pudrición basal en bulbos. Los síntomas del ataque son una podredumbre pardo
oscura, que comienza en el disco basal para extenderse por toda la planta. La parte
externa presenta marchitez afectando incluso el botón floral, los cuales no serán
viables o tendrán antesis antes de su fecha de floración.
Cylindrocarpon destructans y Cylindrocarpon radicicola producen pudrición de
escamas y en el interior del bulbo.
Otros hongos que afectan al bulbo, principalmente en almacenaje, son Penicillium sp.
y Rhizopus nigricans.
Las especies de Botrytis, por ser parte fundamental de este estudio serán descritas
más adelante.
Lilium también es atacado por bacterias, siendo la principal especie Erwinia
carotovora que provoca manchas traslúcidas en las escamas y posterior pudrición del
bulbo que termina en marchites generalizada y muerte.
Los daños por virus se caracterizan por producir distorsiones, manchas jaspeadas a
nivel foliar y crecimiento enanizante. Existen variedades de lilium sensibles,
resistente e inmunes. Las resistentes pueden actuar como portadoras y contaminar
otras variedades sensibles. El LSV (Lily Simtomless Virus) es particularmente
importante por provocar manchas cloróticas en las hojas, alargadas paralelamente a
las nervaduras y posteriormente se vuelven necróticas.
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2.5. Antecedentes fitopatológicos en Chile:
En nuestro país el cultivo ha tenido condiciones óptimas para su desarrollo. Sin
embargo, también se han detectado problemas de carácter patológico que pueden
frenar el cultivo si no se detectan a tiempo.
Los problemas más graves en multiplicación y producción de bulbos son los virus. En
la zona sur (VIII a X región) se realizaron estudios demostrando que el cultivo puede
infectarse principalmente por LSV (Lily Simtomless Virus), TVB (Tulip Break Virus)
y TRV (Tobacco Rattle Virus) (MUÑOZ y FERNÁNDEZ, 2000).
En la zona norte, principalmente en el valle de Azapa, se detectó Fusarium sp.,
provocando clorosis y pérdida de turgencia en las zonas basales (SEPÚLVEDACHAVERA et al., 2004)
2.6. Botrytis cinerea:
Botrytis pertenece al Phylum Ascomycota, clase Ascomycetes, orden Helotiales,
familia Sclerotiniaceae, género Botrytis (ITIS, 2005).
Dentro de este género, la especie Botrytis cinerea Pers. es la única especie polífaga,
afectando a más de 200 tipos de plantas. Todas las demás especies son consideradas
específicas, con un rango de hospederos estrecho. (VAN BAARLEEN, STAATS y
VAN KAN, 2003). Según AGRIOS (1996), es una de las enfermedades más comunes
y más ampliamente distribuidas de hortalizas, plantas ornamentales, frutales, cultivos
tradicionales y por sobre todo, en plantas cultivadas bajo invernadero.
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2.6.1. Síntomas
En plantas de lilium, se presenta produciendo el característico micelio gris,
afectándolas en cualquier estado de desarrollo, incluso en postcosecha, llegando a
producir muerte de plántulas, pudrición en la base de las varas, pudrición de bulbos y
tizón de la flor, donde además se observa abundante esporulación y desarrollo de
esclerocios si se producen condiciones adversas. B. cinerea puede ser aislada de
lesiones en hojas de lilium, pero no presenta lesiones tan extendidas como las
provocadas por Botrytis elliptica (GOULD, 1963).
VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN (2004), comprobaron la escasa
patogenicidad de B. cinerea, a través de la inoculación de plantas sanas de lilium.
Después de nueve días, se generaron pequeñas manchas oscuras, evidencia de escasas
células muertas. Las lesiones no se extendieron y a través del microscopio no
encontraron micelio, pese a observar germinación de conidias en el lugar de
infección. También demostraron que al aumentar la concentración del inóculo era
posible obtener síntomas.
2.6.2. Características morfológicas
Entre las características objetivas para distinguir a B.cinerea de otras especies de
Botrytis están: el crecimiento y forma del micelio, el tamaño y color del conidióforo,
la forma, tamaño y color de las conidias, y tamaño del esclerocio.
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2.6.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales
Las colonias al principio son hialinas, luego se tornan gris a café grisáceo con el
desarrollo de las conidias (CMI, 1974). Las hifas son septadas y ramificadas
(JARVIS, 1977).
Los conidióforos son erguidos, simples o ramificados (ALEXOPOULOS, 1966).
Miden 750 µm hasta 2 mm de longitud y 16-30 µm de ancho, tienen una
protuberancia apical con ramificaciones alternas. Presentan color café oscuro y tienen
la pared lisa (CMI, 1974). En las células apicales se producen racimos de conidias
unicelulares y multinucleadas (CMI, 1974). Los conidióforos y los racimos de
conidias se asemejan a un racimo de uvas (AGRIOS, 1996). En la superficie de las
hojas infectadas se elevan uno a dos mm.
Las conidias son ovales o esféricas, hialinas o de color café pálido, hidrófobas, de
pared lisa y miden entre 8-14 µm de largo y 6-9 µm de ancho (CMI, 1974, HSIANG
y CHASTAGNER, 1991).
2.6.2.3. Esclerocios
Este hongo produce esclerocios irregulares, planos, duros y de color negro (AGRIOS,
1996). Según HSIANG y CHASTAGNER (1992) el tamaño varía entre 3,5 y 5 mm.
Éstos consisten en una médula densamente empaquetada con un pseudoparénquima
color café a negro y una capa cortical de células de 5-10 µm de diámetro. La parte
externa está compuesta por una malla de hifas entramadas uniéndose en un cuerpo
compacto que va madurando por la acumulación de pigmentos de melanina.
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2.6.3. Reproducción sexual.
El teleomorfo es Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel . Este estado se caracteriza
por la producción de apotecios de color café claro que emergen del esclerocio durante
la primavera o a principios del verano. El apotecio se caracteriza por poseer una
superficie poco hendida, casi llana. El estipe mide entre 3 a 15 mm. Las ascosporas
que se originan del apotecio miden 8-12 µm de largo y 4-6 µm de ancho (CMI,
1974).
2.6.4. Desarrollo de la enfermedad.
2.6.4.1 Infestación
La infestación o inoculación es el proceso mediante el cual un patógeno y su
hospedero entran en contacto. En el caso de B. cinerea se produce cuando la conidia
diseminada entra en contacto con el hospedero. También ocurre cuando una
superficie infestada con micelio entra en contacto con un tejido sano (AGRIOS,
1996).
2.6.4.2. Penetración
La conidia, después de haber sido incubada unas horas bajo condiciones favorables a
la germinación, se adhiere fuertemente a un sustrato vivo o descompuesto mediante la
producción de
secreciones (DOSS et al., 1995). Una vez adherida penetra
directamente al perforar mecánica y/o enzimáticamente la cutícula e indirectamente
por heridas o por aberturas naturales (principalmente estomas y estigmas)
(LATORRE, 1986).
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La penetración mecánica de B. cinerea se realiza través del apresorio que nace del
extremo distal de la conidia germinada. De este apresorio surge el estilete de
infección, el cual penetra directamente la cutícula hasta las células epidermales
(AUGER, 1988). En lilium, las conidias que han germinado rara vez penetran
directamente en los tejidos que muestran un crecimiento activo, pero si lo hacen a
través de heridas o después de que se han desarrollado durante un cierto tiempo y han
formado micelio sobre pétalos de flores senescentes, follaje senescente, escamas de
bulbos muertos, etc. (HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001).
La penetración enzimática de la cutícula, se produce gracias a la producción de
enzimas como pectinasas y polygalacturonasas (VERHOEFF, 1974). Además, el
patógeno produce ácido oxálico que acidifica el tejido de la planta para facilitar la
hidrólisis de la pared celular (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004).
Durante la penetración, en las células del tejido de la hoja se produce peróxido de
hidrógeno y óxido nítrico, que permiten el ingreso del tubo de germinación de las
conidias (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004). Sin embargo, este
proceso de infección se bloquea durante la penetración de la pared celular, debido a
que la planta es capaz de generar una respuesta en defensa al ataque de este patógeno
(HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001).
2.6.4.3. Infección
La enfermedad puede manifestarse en forma sintomática o latente. La infección
sintomática corresponde a la infección común, en la cual el patógeno ha penetrado
directamente o por heridas. LATORRE (1986) señala que si las condiciones son
óptimas, la incubación ocurre en pocas horas y rápidamente se producen
reinfecciones, debido a las conidias producidas luego del desarrollo de los primeros
síntomas de Botrytis.
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La infección latente o asintomática es aquella en la que el patógeno ha cesado de estar
agresivo temporal o permanentemente y los síntomas no están presentes. Según
VERHOEFF (1974), la infección puede permanecer latente hasta un punto en el cual
el estado agresivo nunca se activa o lo hace muy tarde como para afectar gravemente
a la planta.
La presencia de B. cinerea en forma latente en lilium es particularmente dañina, ya
que durante el traslado o la exportación, si se producen las condiciones óptimas de
crecimiento, provocarían una pudrición (MILLER, 1992).
Esta fase es un mecanismo de sobrevivencia y de alguna forma podría influir en las
epidemias. Además le permite mantenerse hasta que el tejido se vuelva senescente y
no oponga resistencia al ataque (BRAUN y SUTTON, 1988).
2.6.4.4. Resistencia a la enfermedad
Un estudio realizado en lilium al inocular flores con conidias demostró que una
secreción de fitotoxinas lograban bloquear la infección en el interior del ovario, al
crear deficientes condiciones para el desarrollo del hongo. Se observo un aumento de
la acción de la peroxidasa cerca del crecimiento del micelio, además de un
incremento de la concentración alrededor en las paredes celulares. La peroxidasa
actúa lignificando la pared celular lo que provocaría una mayor resistencia
(GEORGIEVA, EDREVA y RODEVA, 2003).
Esta respuesta defensiva no es propia de lilium. En estudios realizados en tomate se
comprobó la presencia de un aumento de la peroxidasa frente al ataque de Botrytis
cinerea. Este efecto es una respuesta frente a la presencia de hongos, bacterias y virus
(GEORGIEVA et al., 2003)
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2.6.4.5. Dispersión
En clima húmedo, el hongo libera fácilmente sus conidias y éstas son diseminadas
por el viento (AGRIOS, 1996). Según LATORRE (1986) la lluvia, por el fenómeno
de salpicado, tiene también importancia en la liberación y diseminación de conidias.
Al interior de un invernadero, las conidias son liberadas al ambiente por un
mecanismo higroscópico asociado a un cambio rápido en la humedad relativa
(DAUGHTREY y BENSON 2005).
MILLER (1992) señala que es fundamental el manejo de los desechos del cultivo, ya
que ellos provocan una dispersión de esporas si no son tratados adecuadamente.
2.6.4.6. Sobrevivencia
B. cinerea puede sobrevivir como saprófito en un gran número de plantas cultivadas y
malezas, o en materias en descomposición (AUGER, 1988). Las conidias pueden
sobrevivir por más de 14 meses en almacenamiento, aunque disminuye su viabilidad.
(SALINAS et al., 1989). Sin embargo, sobre la tierra no son capaces de lograrlo. En
el suelo el hongo inverna en forma de esclerocios producidos sobre restos orgánicos
dejados luego de cosechar las flores, o de micelio que se desarrolla en restos de
plantas en proceso de descomposición (BERG y LENTZ, 1968).
2.6.4.7. Fuente de inóculo
DAUGHTREY y BENSON (2005), descubrieron que los esclerocios pueden
sobrevivir bastante tiempo y ser útiles como fuente de inóculo para la siguiente
estación. El tiempo que pueden sobrevivir fluctúa entre cinco y nueve meses.
Prácticas de control de malezas tanto químicas como mecánicas no tienen efecto en
su sobrevivencia.
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2.6.5. Efecto de los factores ambientales
Para que una enfermedad se produzca y se desarrolle óptimamente, debe haber una
combinación de tres factores: hospedero susceptible, patógeno infectante y un medio
ambiente favorable (AGRIOS, 1996).
2.6.5.1. Temperatura de crecimiento
JARVIS (1977) encontró que la temperatura óptima de crecimiento de micelio de
Botrytis cinerea en medio PDA es de 22°C. En condicionas ambientales controladas,
no se detectó producción de micelio aéreo ni de conidias a temperaturas de 30°C.
El micelio requiere de un clima húmedo y moderadamente frío (18 a 23°C) para que
se desarrolle adecuadamente, esporule, libere y germine sus esporas y para que
produzca infección (DAUGHTREY y BENSON, 2005).
2.6.5.2. Temperatura de esporulación
Existen diferencias notables de acuerdo al hospedero del cual se obtiene la cepa.
THOMAS, MAROIS y ENGLISH (1988) estudiando cepas del patógeno obtenidas
de uva; señalan que la mayor producción de conidias bajo condiciones ambientales
controladas se logró a 21°C. Sin embargo, JARVIS (1977), define la temperatura
óptima para la esporulación en 15°C.
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2.6.5.3. Temperatura de germinación e infección
Según LATORRE y RIOJA (2002) la germinación de conidias ocurre en un
amplio rango de temperaturas (5° a 30°C), con un óptimo de 20C°.
La infección puede ocurrir a bajas temperaturas cuando las plantas permanecen
mojadas por largos períodos de tiempo (RIES, 1995). JARVIS (1992) señala que la
temperatura óptima de germinación de esporas es de 20°C y la temperatura óptima de
crecimiento del tubo germinativo es de 30°C.
2.6.5.4. Temperatura para la formación de esclerocios.
De acuerdo con JARVIS (1992) los esclerocios se forman en otoño-invierno cuando
las temperaturas fluctúan entre 11° y 13°C y germinan con temperaturas de 22° a
24°C.
2.6.5.5 Humedad
El efecto más importante de la humedad ocurre sobre la germinación de las conidias
de los hongos y sobre la penetración del tubo germinativo en el hospedero. También
influye al incrementar la suculencia del hospedero, aumentando así su susceptibilidad
a ciertos patógenos (AGRIOS, 1996).
La humedad relativa necesaria para que ocurra infección es mayor al 90%, que
provoca condensaciones producto de la evapotranspiración, difíciles de medir, pero
suficientes para iniciar la germinación e infectar al hospedero. Los eventos de
infección en el campo se inician en respuesta a lluvias, lloviznas o presencia de
neblinas que condensan sobre el órgano afectado (LATORRE y RIOJA, 2002).
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2.7. Botrytis elliptica:
La especie Botrytis elliptica (Berk.) Cooke es infecciosa en la mayoría de las
variedades de lilium, incluso algunas pueden llegar a la muerte si las condiciones
favorecen su desarrollo ( GOULD, 1963).
Su distribución a nivel mundial se debe a la introducción de material vegetal
proveniente de zonas endémicas ( Holanda) hacia países donde el cultivo ha tenido
una buena perspectiva comercial. HUANG et al., (2000) descubrieron variabilidad
genética entre aislados de zonas tan distante como Norteamérica y Asia (Taiwán),
pero no se encontró evidencia de que algún morfotipo sea específico para una región
geográfica.
2.7.1. Síntomas.
La enfermedad provocada por este hongo, produce inicialmente manchas en hojas
con bordes bien delimitados, que al necrosarse toman una coloración café oxidado
con formación de anillos concéntricos, características que la diferencian de B.
cinerea. La superficie del tejido limitada por el anillo, visible tanto por el haz como
por el envés, se degrada poco a poco, se arruga y finalmente se seca. La hoja puede
ser atacada por el borde o el interior del limbo, al ingresar por el borde la hoja se
deforma y es fácilmente confundida con síntomas de virus (GOULD, 1963, MILLER,
1992, SEEMANN y ANDRADE, 1992).
CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO (2005) destacan su forma elíptica,
más anchas en el centro y con los extremos aguzados, que al envejecer adquieren
color grisáceo y aspecto velloso por la presencia de las estructuras reproductivas. Esta
necrosis comienza generalmente en el extremo de la hoja o en la parte media y luego
se extienden hasta el tallo. Señalan además que las infecciones más agudas se
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observan preferentemente sobre las hojas más jóvenes donde los síntomas son más
severos.
GOULD (1963) y BAÑON et al. (1993) concuerdan que, en plantas jóvenes, cuando
el daño se produce en el ápice, puede detener el crecimiento. El hongo puede atacar
los tallos cerca del nivel del suelo, provocando una amarillez en el follaje.
VAN BAARLEN, STAATS, y VAN KAN (2004) observaron como primer síntoma
la traslucides de la epidermis, anterior a la lesión necrótica, luego de un día de la
inoculación experimental. A través de microscopio óptico visualizaron plasmólisis de
las células, luego de tres días de infección ubicada en la zona adyacente a la lesión.
Las flores senescentes son un punto de entrada para la enfermedad. MILLER (1993)
menciona que éstas presentan manchas de color café y que en condiciones frías y
húmedas se pudren rápidamente cubriéndose de esporas. En condiciones secas las
lesiones dejan de crecer y se secan. Cuando los botones florales son infectados en sus
primeras fases de desarrollo, los más externos evidencian protuberancias y en los
tépalos aparecen una serie de punteaduras, de color gris que al tacto se manifiesta
como una podredumbre blanda. Si las flores no son removidas, se inclinan sobre las
hojas superiores reteniendo humedad, dando las condiciones apropiadas para el
ataque. Los híbridos orientales son menos susceptibles que los asiáticos.
En algunas ocasiones, en lilium asiáticos, la hoja presenta estrías amarillas o rojas en
sentido longitudinal a la lesión. DOOS, CHASTAGNER y RILEY (1988) señalaron
que esto era provocado por una aceleración de la senescencia en la zona adyacente al
punto de infección. Demostraron además que esto ocurría en plantas maduras y en
hojas basales.
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2.7.2
Características morfológicas
2.7.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales.
Las colonias se presentan blanquecinas, expansivas, de aspecto algodonoso y denso,
que luego se tornan gris, café grisáceo o negro. Las hifas son septadas y ramificadas
(CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO, 2005).
Esta especie se caracteriza por producir conidióforos formándose a partir del micelio,
ramificados en los extremos, formando estructuras fialídicas pequeñas (CABRERA,
ALVAREZ y SOSA, 2005). Los conidióforos son abundantes, de color café claro y
de 500 µm a 2 mm de largo (GRIGALIUNAITE, 2001).
En cada ápice de las fiálides del conidióforo nacen conidias hialinas o tenuemente
coloreadas, que se oscurecen a la madurez, de forma elipsoide a ovoide (SMITH et
al., 1992). Bajo condiciones favorables el conidióforo se desarrolla sobre las lesiones,
produciendo conidias que maduran en 9 horas (GOULD, 1963).
Según DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) este patógeno no produce conidias
en forma abundante en condiciones de laboratorio. Sin embargo, ellos lograron
obtener microconidias. Éstas son hialinas, de diámetro entre 2 a 3,4 µm y son
formadas en cortas fialides que miden entre 5,9 a 10,7 µm de largo. Según JARVIS
(1977) todas las especies de Botrytis tienen la capacidad de producir microconidias.
Las dimensiones de las conidias varían entre 18 a 32 µm de largo y 13 a 24 µm de
ancho (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984).
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HSIANG y CHASTAGNER (1991) midieron el tamaño de conidias sensibles a
fungicidas y las compararon con aquellas resistentes. El tamaño de las conidias
provenientes de cepas sensibles promedio 17,8 µm de largo y 10 µm de ancho
mientras que las cepas resistentes promediaron los 26,4 µm de largo y 19,2 µm de
ancho.
2.7.2.2. Esclerocios
B. elliptica produce esclerocios blancos en un principio, posteriormente se vuelven
negros, de forma redonda, elíptica o irregular. Bajo condiciones favorables germinan
en la primavera siguiente para producir micelio que dará origen a otro ciclo de
infección. Al madurar en las hojas afectadas caen a la tierra durante el verano. Estos
raramente se producen en el bulbo. (GOULD, 1963, VAN DEN ENDE y
PENNOCK-VOS, 1997). El diámetro varía entre 1 y 2,1 mm (HSIANG y
CHASTAGNER, 1992).
2.7.3. Reproducción sexual
Después de muchos ensayos, DOSS, CHASTAGNER, y RILEY (1992) fueron los
primeros en producir un estado sexual en laboratorio, al producir apotecios de los
cuales se originan ascosporas. Sin embargo, no se encontró evidencia suficiente de su
ocurrencia natural en el ambiente.
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2.7.4. Desarrollo de la enfermedad
2.7.4.1. Penetración
A través de estudios histológicos se ha podido determinar que la penetración ocurre
en el envés de la hoja a través del estoma (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984).
HSIEH, HAUNG y HSIANG (2001) observaron que a 20°C y 100% de humedad
relativa las conidias germinan en ambas superficies de la hoja de lilium, pero los
tubos de germinación no invaden las células epidermales del haz. El apresorio, de
poca longitud (menor a 20 µm), puede penetrar a través de la apertura estomática,
directamente en las células epidermales, pero el mayor porcentaje de penetración
ocurre en la epidermis de las células de guarda (52%). Bajo estas condiciones
controladas, luego de nueve horas el 60% de las conidias germinadas lograba la
penetración. GOULD (1963) señala que las primeras lesiones aparecen luego de 10
horas después de ocurrida la penetración si las condiciones favorables están presentes
en forma continua.
2.7.4.2. Infección
VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN (2004) señalan que la patogenicidad y
especialización de Botrytis elliptica para infectar plantas de lilium se demuestra por el
mecanismo denominado muerte celular programada. Una de las etapas es la
inducción de la fragmentación de ADN, proceso específico en la infección de B.
elliptica, el cual no ocurre durante el ataque de B. cinerea. Sin embargo, el área de
infección provocada permite a B. cinerea infectar y colonizar a la planta. El contenido
celular es ocupado como fuente nutritiva por el patógeno para continuar su avance
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por los tejidos. Otra diferencia sustancial es que B. elliptica afecta principalmente
tejido sano, mientras que B. cinerea afecta tejido dañado o muerto.
Esta enfermedad presenta un período muy breve de incubación, expandiéndose
rápidamente sobre hojas jóvenes o pétalos, debido a que estos órganos presentan
tejidos más débiles y suculentos. Destaca su carácter necrotrófico debido al rápido
avance y abundante esporulación sobre los tejidos muertos cuando tiene condiciones
ambientales favorables como las de un invernadero (ALVAREZ, CABRERA y
SOSA DE CASTRO, 2005).
2.7.4.3. Diseminación
La diseminación ocurre principalmente cuando, en condiciones favorables, los
esclerocios o el micelio producido en tejidos muertos producen conidias que son
transportadas por el viento, y por salpicaduras de agua hacia el follaje que se
encuentra en desarrollo durante la primavera ( HUANG et al., 2001).
2.7.4.4. Sobrevivencia
El patógeno perdura como saprófito en los residuos vegetales enfermos. (VAN DEN
ENDE y PENNOCK-VOS,1997)
Según GOULD (1963) sobrevive durante el invierno a través de los esclerocios. En
algunas ocasiones se ha demostrado que puede pudrir los bulbos, lo que significaría
otra forma de supervivencia, pero el autor señala que rara vez ocurre esto en la
naturaleza.
22
2.7.4.5. Fuente de inóculo
VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS (1997) mencionan que los esclerocios
formados en los tallos muertos de lilium luego de la cosecha juegan un rol importante
en la epidemiología. Ellos determinaron que los esclerocios que permanecen latentes
en el verano corresponden al inóculo primario para la infección de la próxima
temporada.
2.7.5. Resistencia a fungicidas.
El uso intensivo de fungicidas para el control de esta enfermedad ha provocado la
aparición de cepas resistentes. HSIANG y CHASTAGNER (1991) aislaron cepas
resistentes a Dicarboximidas y Benzimidazoles. Las primeras crecen más lento en
medio de cultivo, sus conidias son más largas y el doble de ancho que las conidias
normales. Los autores determinan que esta característica le confiere una capacidad de
sobrevivir más tiempo y ser más infectiva. Las cepas resistentes a Benzimidazoles
producen menos conidias y los esclerocios son de mayor tamaño y más numerosos
que los de las cepas sensibles.
2.7.6. Efecto de los factores ambientales
2.7.6.1. Temperatura de crecimiento
La temperatura óptima de crecimiento es de 15 °C (GOULD, 1963). Este autor señala
además que a dicha temperatura y humedad relativa alta la enfermedad se repite en
ciclos en pocos días durante todo el período de crecimiento del cultivo, produciendo
esclerocios en las partes enfermas. HSIANG y CHASTAGNER (1991) demostraron
experimentalmente que B. elliptica crece más lento que B. cinerea en medio de
cultivo a 20°C.
23
2.7.6.2. Temperatura de esporulación.
En laboratorio se ha demostrado que un rango de 5-20°C, acompañada de una
humedad relativa mayor al 90% produce la esporulación a partir de micelio. Las
temperaturas óptimas para la producción de conidias son aquellas menores a 10°C
( HUANG et al., 2001).
2.7.6.3. Temperatura de germinación e infección
La germinación de las conidias sobre el tejido ocurre a una temperatura óptima de
15°C, pero una vez que el hongo ha ingresado a la planta se desarrolla mejor a 21° C
(GOULD, 1963). DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) demostraron que la
infección es más rápida a 20° C que a 25° C, manteniendo las hojas con una película
de agua por 48 horas.
2.7.6.4. Humedad
Además de la amplitud térmica, la humedad relativa del ambiente es muy importante
para el desarrollo de la enfermedad. La humedad ambiente elevada (mayor al 90%)
presente en los invernaderos es un factor decisivo para los ataques de este hongo,
favoreciendo la germinación de las conidias ( VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS,
1997).En condiciones de baja humedad ambiental la lesión se seca y el patógeno deja
de extenderse. En cambio, bajo condiciones húmedas las lesiones se unen y afectan
toda la hoja, la cual se cubre de micelio grisáceo y acaba pudriéndose, afectando
luego a toda la planta. (GRIGALIUNAITÉ, 2001).
Una humedad relativa mayor al 90% permite la esporulación del esclerocio (VAN
DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997).
24
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación del muestreo:
El muestreo se realizó en un predio perteneciente a una empresa dedicada a la
producción y exportación de flores, ubicado en la comuna de Olmué, V región.
Se analizaron plantas con una misma fecha de plantación hasta la cosecha, de las
variedades asiáticas: All Round, Black Out, Tresor y Valdisole, entre los meses de
abril y julio de 2005, y luego un segundo período desde la segunda semana de julio
hasta septiembre de 2005 con las variedades asiáticas: Algarve, Black Out, Madrid,
Navona, Umbría, Menorca, Gironde y Wiener Blut.
El cultivo se encontraba bajo invernadero frío en mesas de 36 m de largo y 1,2 m de
ancho en las cuales existían 60 bulbos por metro cuadrado, correspondiente a un
calibre 12-14 cm. En la zona de muestreo existían 42.000 plantas en 21 mesas del
sector analizado durante del primer período. En el sector del segundo período existían
58.500 en 30 mesas aproximadamente ( Anexo 1).
Las labores realizadas corresponden al manejo propio de este cultivo a escala
comercial. Un detalle de la aplicación de fungicidas se describe en el Anexo 2.
3.2. Metodología de muestreo:
Las muestras fueron obtenidas semanalmente mediante un muestreo sistemático con
arranque aleatorio del 0,2%. El número de la primera planta fue elegido al azar, a la
cual se le sumó 500 en la misma mesa para obtener el número de la segunda planta a
muestrear y así sucesivamente. Para ello se utilizaron planillas en las cuales se
25
registró la incidencia anotando la presencia o ausencia del síntoma o signo del agente
causal Botrytis sp. (Anexo 3). Las muestras de hojas con lesiones eran recolectadas y
colocadas en bolsas plásticas con cierre hermético para su traslado al laboratorio.
3.3. Determinación de la incidencia de Botrytis.
Esta se realizó mediante la observación de síntomas presentes en la superficie de la
hoja. Para corroborar la presencia del agente causal se realizaron cámaras húmedas. A
partir de esta información se calculó la incidencia de Botrytis de acuerdo a la
siguiente fórmula:
Incidencia de Botrytis ( %) = N° de plantas con síntomas de Botrytis en hojas X 100
N° total de plantas muestreadas.
La incidencia fue calculada por variedad, para el caso de B. cinerea y B. elliptica.
Además, para esta última especie se calculó la incidencia sin considerar la variedad,
para observar la tendencia general de la enfermedad durante el período de estudio.
3.3.1. Correlación entre la incidencia de Botrytis y factores ambientales.
Para lograr correlacionar la incidencia de Botrytis con la temperatura y humedad
relativa en los sectores analizados, se dispusieron sensores calibrados para registrar
estos datos cada una hora. Una vez finalizado el muestreo, los datos fueron obtenidos
mediante el programa computacional Termocron. Las temperaturas máximas,
mínimas y humedad relativa diarias fueron utilizadas para obtener las medias
semanales. Estos datos se correlacionaron con la incidencia de Botrytis mediante
gráficos y el posterior análisis de los mismos.
26
3.4. Estimación del índice de daño:
Para calcular el índice de daño causado por ambas especies de Botrytis, este se
calculó mediante la siguiente fórmula:
Índice de daño: ID =
∑ (nv )100
VN
donde:
n : n° de plantas por nivel de la escala
v : nivel de la escala ( grado de ataque)
N : n° total de plantas observadas.
V : Rango máximo de la escala
El grado de ataque varió de 0 a 3, utilizándose la siguiente escala de evaluación:
0 = Ausencia de síntomas (lesión café circular o elíptica)
1 = 1-2 lesiones presentes en la hoja.
2 = 3-6 lesiones presentes en la hoja.
3 = 7 o más lesiones.
Para corroborar la presencia del agente causal, algunas hojas con síntomas colectadas
en el predio se colocaban siete días en cámaras húmedas, las que fueron
confeccionadas con envases de plástico en cuya tapa se registró la fecha de
recolección y la variedad muestreada. La bandeja era previamente desinfectada con
alcohol y luego se le cubría interiormente con papel absorbente estéril (toalla Nova)
humedecida con agua estéril. En cada una se colocaba una hoja. Estas bandejas
fueron colocadas a temperatura ambiente. Una vez obtenido el crecimiento de micelio
y la presencia de estructuras reproductivas, se pasaba a la etapa de aislamiento.
27
3.5. Pruebas de patogenicidad:
El desarrollo de esta parte del taller se realizó en el laboratorio e invernadero
climatizado de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia
Universidad Católica de Valparaíso, ubicado en el sector de La Palma, comuna de
Quillota, V región.
Para ambas especies se realizaron los postulados de Koch por no tener referencias a
nivel nacional de la presencia de estos patógenos infectando plantas de lilium.
3.5.1. Aislamiento
Una vez obtenidas las muestras con sintomatología en el campo se procedió a aislar
en el medio nutritivo agar papa dextrosa acidulado (APDA) con el fin de obtener
aislados, purificarlos y describir las características que presentaban los hongos así
obtenidos. De las muestras a aislar se extrajeron trozos mediante bisturí, de 0,5 a 1
cm2 de la zona de avance de las lesiones. Los trozos de tejido enfermo fueron
sumergidos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 15 segundos para
eliminar poblaciones de bacterias y otros saprófitos, luego fueron lavados en agua
estéril, dejándolos secar en papel absorbente cerca de un mechero dentro de una
cámara de flujo laminar. Posteriormente eran colocados cuatro trozos en forma
equidistante en el medio anteriormente descrito.
Para las hojas colocadas en cámara húmeda, al observar conidias se pasaba
superficialmente un asa, con la cual se realizaba un estriado en placas con el mismo
medio.
28
Los aislados se incubaron a 23 ºC en cámara de crecimiento hasta observar el
crecimiento del micelio. Los patógenos obtenidos se purificaron a partir de repiques
de trozos de hifas desde el margen de las colonias. Una vez crecidas las colonias
purificadas se describieron sus características y se conservaron en tubos de ensayo
con agua estéril a 5°C. Dos placas por cepa fueron puestas bajo luz cercana a UV (luz
negra) para estimular la producción de conidias.
3.5.2. Recuperación de aislados.
A partir de los aislados 786, 787 y 911 guardados durante el año 2003, clasificados
como Sclerotinia sp. por presentar micelio blanco, esclerocios pequeños de forma
elíptica y no producir esporas, se comenzó a investigar la posibilidad de producir
apotecio en laboratorio, utilizando la metodología propuesta por GUTIERREZ y
SHEW (1995) con el fin de corrobar la presencia de este patógeno y obtener
ascosporas para su posterior inoculación en las plantas.
Los aislados fueron recuperados de tubos de ensayos guardados a 5°C, luego
cultivados en placas con medio de cultivo (APDA) y colocados en cámara de
crecimiento a 25°C. Posteriormente fueron retirados para colocarlos a temperatura
ambiente hasta observar la presencia de esclerocios. Una vez obtenidos, se
dispusieron en frascos con arena esterilizada y humedecida con agua estéril. Se
incubaron a 4°C durante un mes. Posteriormente fueron transferidos a una cámara de
crecimiento a 12°C.
Los esclerocios puestos bajo estas condiciones, dieron origen a micelio y producción
de conidias, descartando la presencia de Sclerotinia sp., siendo reclasificados estos
aislados como pertenecientes a la especie Botrytis elliptica.
29
3.5.3. Inoculación en plantas de lilium.
Luego de aislados los patógenos, se procedió a inocular plantas sanas que fueron
cultivadas en bolsas plásticas, a partir de bulbos previamente desinfectados, de las
variedades Algarve, Wiener Blut, Gironde y Navona. El sustrato utilizado también
fue previamente desinfectado. El control ambiental fue dado por la utilización de aire
forzado obteniendo condiciones de temperatura entre 15 y 20°C. La humedad relativa
igual o superior al 90%, fue conseguida mediante aspersión de agua sobre las hojas,
los pasillos y las paredes.
Se inocularon seis cepas elegidas al azar, tres correspondientes a la especie B. cinerea
(1010,1014 y 1016) y tres a la especie B. elliptica ( 786,787 y 911).
Cada inóculo fue preparado mediante el raspado de cinco placas por cepa, el que fue
depositado en 600 ml de agua estéril. Luego se agitó por cinco minutos y se agrego
una gota de Tween 20 para disminuir la tensión superficial del agua. El inóculo se
concentró a 1 x 106 conidias o propágulo (fragmentos de micelio)/ ml.
Las plantas fueron inoculadas al azar. El ensayo se llevó a cabo con 84 plantas en
total, 21 plantas por variedad. Por cada variedad de lilium se inocularon tres plantas
por cepa, dejándose tres plantas como testigo.
Los patógenos fueron inoculados mediante un asperjador manual, rociando las plantas
con una suspensión de conidias para el caso de las cepas de B. cinerea, y de
fragmentos de micelio para el caso de las cepas de B. elliptica (debido a su dificultad
para esporular in vitro). Los testigos fueron rociados con agua estéril. Luego de la
inoculación, las plantas fueron cubiertas con una bolsa plástica de polietileno
transparente, cerrando con elástico a la maceta para evitar el contagio entre
30
tratamientos y lograr un efecto de cámara húmeda. Estas se mantuvieron por 48 horas
para ser posteriormente retiradas.
Las plantas fueron observadas en forma periódica, con el fin de monitorear la
aparición de síntomas, realizando una evaluación final de las plantas luego de tres
semanas de inoculadas. La evaluación se realizó usando una escala de índice de daño
distinta a la usada en el muestreo, ya que se observó mayor daño debido a que las
condiciones eran favorables y la enfermedad se manifestó con mayor expresión de
síntomas (Anexo 4).
3.5.3.1. Análisis estadístico.
El análisis estadístico de los datos proporcionados por los resultados de las
inoculaciones, se llevo a cabo a través de un análisis de varianza multifactorial
usando un diseño completamente al azar (DCA). Para comparar entre tratamientos se
realizó el test de Duncan para el nivel de significancia del 5 %.
3.5.4. Reaislamiento.
Se debe reaislar el hongo de las plantas inoculadas siguiendo el mismo procedimiento
del aislamiento anterior, para corroborar la presencia de las especies de Botrytis y su
correspondiente identificación.
3.5.5. Identificación de cepas de Botrytis obtenidas:
Para identificar las especies de Botrytis aisladas a partir de síntomas, se observó el
color de la colonia, el tamaño de las conidias, conidióforo y esclerocios y se comparó
con literatura.
31
Por cada cepa se midió a través de microscopio óptico ( 40 X) el largo y ancho de 50
conidias y 10 conidióforos. Estos resultados se promediaron y se obtuvo el tamaño
por especie. En el caso de los esclerocios, fueron medidos 20 por cepa.
32
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Incidencia de Botrytis cinerea por variedad:
La presencia de Botrytis cinerea en las plantas se manifestó en forma de lesiones
necróticas circulares, de un color café oscuro a negro, encontrándose algunas con el
característico micelio grisáceo.
Al analizar la Figura 1, se observa que la presencia de la enfermedad ocurre en forma
puntual durante el período comprendido desde abril a julio, sin presentar algún tipo
de tendencia.
Las variedades All Round y Tresor son las primeras en presentar la patología durante
la última semana del mes de abril. La humedad relativa media es de un 85%,
condición desfavorable para provocar infección (LATORRE y RIOJA, 2002,
GOULD, 1963). Es probable que el patógeno hubiera entrado por heridas sufridas
durante la emergencia de la planta, y que la humedad del tejido facilite su
germinación y posterior penetración.
Luego de un mes sin presencia de la enfermedad, aparece en la variedad Valdisole,
verificándose un aumento en las temperaturas máximas, aptas para la germinación y
el desarrollo del micelio. A su vez las temperaturas mínimas media descendieron,
favoreciendo la esporulación del micelio, manifestándose el patógeno durante la
semana siguiente en las variedades All Round y Black Out, registrándose condiciones
óptimas para el crecimiento del micelio como para la germinación de las conidias.
% Valdisole
% Black Out
% All Round
% Tresor
T°Mín. media sem.
T°Máx. media sem.
% H.R. media sem.
30
90
25
80
70
º C ( Tº )
20
60
15
50
40
10
30
20
5
10
0
0
4°
5º
ABRIL
1°
2°
3°
4°
5º
MAYO
1°
2°
3°
JUNIO
4º
1°
JULIO
Semanas
FIGURA 1. Incidencia de Botrytis cinerea en plantas de lilium durante abril a julio de 2005. Olmué, V región.
% ( H.R.), % ( Incidencia)
100
Nuevamente ocurre un período sin incidencia, a pesar de presentar condiciones de
temperatura aptas para esporulación. El factor determinante es la humedad
relativa,que no logra superar el 90%. Esta es controlada en el predio mediante
extractores de aire y la apertura de cortinas a través de un sistema que permite regular
la altura de las mismas permitiendo una ventilación adecuada en cada momento.
La primera semana de julio y la última correspondiente al muestreo efectuado, se
observa presencia en Valdisole y Black Out. La humedad relativa alcanza el máximo
valor del período (93%), lo que puede provocar condensaciones encima de la
superficie foliar estimulando la germinación de conidias (LATORRE y RIOJA,
2002). Además, algunas flores antes de cosecha presentaron antesis y liberaron polen
al ambiente, el que según SALINAS et al. (1989) puede ser usado por B. cinerea
como fuente nutritiva inicial.
El patógeno, al ser de naturaleza polífaga y actuar además como saprófito, puede
provenir de múltiples focos. El predio se encuentra inserto en una zona de intensa
producción agrícola, donde los desechos de los cultivos no son manejados
correctamente para evitar la diseminación. Sin embargo el intensivo uso de fungicidas
permite un control eficiente de esta enfermedad, evidenciándose en su nula incidencia
durante el segundo período de muestreo.
La presencia de B. cinerea es muy particular durante el desarrollo del cultivo. Es
probable que la penetración ocurriera a través del daño provocado por el roce de las
mallas de soporte y al pasar entre las mesas durante las labores propias del cultivo. La
infección en las variedades se observa en períodos diversos, al inicio con plantas
pequeñas y susceptibles a daño (All Round y Tresor), en un período intermedio entre
vegetativo y aparición de primeras flores (Valdisole, All Round y Black Out) y
cercano al período de cosecha antes de antesis (Tresor, Black Out y Valdisole).
36
4.2. Índice de intensidad de daño de B. cinerea:
El grado de ataque provocado por B. cinerea en hojas de lilium, fue de una a dos
lesiones por hoja. Si se analizan los índices, se encuentran en un nivel bajo
alcanzando el máximo valor de 3,3% en la variedad Black Out. El detalle de los
índices se encuentra el Anexo 5.
Al analizar en forma conjunta la incidencia y el índice de daño, es posible inferir que
la enfermedad provocada por este patógeno no fue un problema significativo durante
el período estudiado.
4.3. Incidencia de Botrytis elliptica en el cultivo:
Durante el primer período observado no se detectó su presencia en el cultivo. Las
condiciones de humedad relativa mayor al 95% favorables para la germinación de las
conidias sólo se presentan al final del período (Figura 1). Además las temperaturas
máximas no descendieron de los 20 °C, lo cual sí ocurrió durante el segundo período
de evaluación.
De acuerdo a los síntomas observados en terreno y al posterior análisis efectuado en
laboratorio, este patógeno comenzó su desarrollo entre la segunda y tercera semana
de julio, pasando de un 0% de incidencia hasta alcanzar el valor máximo de 45%
(Figura 2).
Al observar los datos de humedad y temperatura mínima, se desprende que existió
una condición predisponente durante esa semana para la germinación de conidias
sobre las hojas y su posterior infección, observando períodos del día superiores al
95% de humedad relativa, con temperaturas mínimas que fluctuaron entre 3° y 8°C,
con
una
mínima
media
de
5°C.
INCIDENCIA (%)
Tº Mín. media sem.
Tº Máx. media sem.
H.R. media sem.
100
30
80
70
ºC ( Tº)
20
60
50
15
40
10
30
20
5
% ( H.R ), % (Incidencia)
90
25
10
0
0
2°
3°
JULIO
4°
1°
2°
3°
4°
AGOSTO
1°
2°
3°
4°
5º
SEPTIEMBRE
Semanas
FIGURA 2. Incidencia de Botrytis elliptica en cultivo de lilium bajo invernadero, Olmué, julio a septiembre de 20
La variación de las condiciones entre la semana anterior y en la cual se observó la
lesión es muy notoria, visualizándose claramente un descenso en la temperatura. Al
analizar detenidamente estos datos, se deduce que debió haber condensación sobre las
superficies de las hojas. Estas condiciones contribuyeron a formar una película de
agua que junto a temperaturas que bordean los 15° favorecen la germinación de
conidias (GOULD, 1963).
Las temperaturas máximas mayores al 20 °C durante algunas horas del día,
favorecieron el posterior desarrollo de la enfermedad ya que el patógeno una vez
ingresado a la planta crece mejor a 21°C (GOULD, 1963).
Las probables fuentes de infección pueden ser esclerocios originados durante la
temporada anterior, que permanecen en el suelo de los alrededores, en los pasillos o
en potreros cercanos. Además, algunos restos del cultivo eran depositado en
quebradas cercanas, y al encontrar condiciones adversas el micelio produce este tipo
de estructuras de resistencia. Las bajas temperaturas y la alta humedad relativa
invernal dada por las lluvias (mayor al 90%) fuera de los invernaderos, permiten
suponer que los esclerocios encontraron las condiciones para esporular, y estas
conidias lograron ser diseminadas por el viento (VAN DEN ENDE y PENNOCK–
VOS, 1997).
La diseminación de las conidias dentro el invernadero es probable que se produzca a
través del movimiento de aire que ocurre al levantar las cortinas para bajar la
humedad relativa ( HUANG et al., 2001).
Al igual que B. cinerea, las conidias tienen una fuente nutritiva al contar con polen
proveniente de los cultivos anteriores que se encuentran en período de cosecha. A
pesar de que la vara se cosecha en botón cerrado, algunas flores abren antes de
39
tiempo, liberan el polen que se dispersa por el viento y se deposita en la superficie de
las hojas de plantas cercanas.
En forma general, se observa un descenso paulatino durante el período comprendido
entre julio y septiembre, debido probablemente a la aplicación semanal y rotación de
tratamientos químicos que frenan el desarrollo del hongo. Sin embargo, a medida que
se desarrolla el cultivo presenta una mayor área foliar que impide el ingreso de
productos a zonas más bajas.
Durante las primeras semanas de agosto se observa un descenso de un 10% de
incidencia respecto al mes anterior, dado probablemente por un aumento de las
temperaturas mínimas que impidieron la formación de películas de agua permanentes
para la germinación de conidias. Se registró un leve aumento de la incidencia durante
la tercera semana, condición dada por un aumento de las temperaturas mínimas
medias de las semanas anteriores, observándose además un aumento de la humedad
con respecto a las dos primeras semanas, pasando de un 88 a un 91% promedio
semanal, lo que favorece la germinación de conidias que no alcanzaron a germinar en
julio o probablemente a un nuevo ciclo de infección dado por la formación de
conidióforos sobre las lesiones anteriores (GOULD, 1963).
En el mes de septiembre, durante la primera semana se mantiene la tendencia de
agosto a pesar de que la temperatura máxima descendió considerablemente y la
humedad relativa media alcanzó su máximo valor (94%). En las últimas semanas se
distingue un aumento progresivo de la temperatura y un descenso de la humedad,
coincidiendo con las mínimas incidencias. Estas condiciones son muy distintas a las
que dieron origen a la infección.
Cabe destacar que no se encontró síntomas en flores o tallos, solamente en hojas
principalmente en la mitad superior de la planta.
40
4.4. Índice de intensidad de daño de B.elliptica:
En forma general, la intensidad de daño de B. elliptica, al igual que su incidencia, va
disminuyendo durante el período. Analizando los datos (Anexo 6), es posible inferir
que la enfermedad no afectó a la planta en forma agresiva, alcanzando en forma
general una a dos lesiones presentes en la hoja, encontrándose en forma puntual el
índice 2 (tres a seis lesiones por hoja) al inicio del período, momento en el cual se
encontraban las condiciones ambientales favorables para su desarrollo.
No se encontraron plantas con más de siete lesiones y que comprometieran el estado
general de la planta, y como se señaló anteriormente, debido al fuerte uso de
pesticidas para frenar las enfermedades y lograr una mejor calidad de la vara.
4.5. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad:
De acuerdo a la Figura 3, las variedades más afectadas corresponden a Algarve,
Wiener Blut, Menorca, Madrid y Umbría. Cabe destacar que estas variedades
presentan un ancho de hoja mayor que las otras variedades, lo que permite captar una
mayor cantidad de inóculo, además de dificultar la ventilación, originando
condiciones favorables para la presencia de agua libre sobre su superficie.
La tendencia presentada en las variedades Navona y Gironde es notoriamente
diferente. Existe una menor incidencia al comienzo de la infección, la que se
mantiene constante hasta la ausencia de síntomas al final del período. Es preciso
señalar que sus hojas son de forma alargada y con inclinación de los ápices hacia el
suelo, lo que dificulta la permanencia de gotas de agua necesarias para la germinación
de las conidias (GOULD,1963). Esto además favorece una ventilación más adecuada
en
zonas
bajas.
NAVONA
W. BLUT
Tº Mín. media sem.
UMBRIA
MADRID
Tº Máx. media sem.
GIRONDE
ALGARVE
H.R. media sem.
MENORCA
B. OUT
100
30
25
80
70
ºC ( Tº)
20
60
15
50
40
10
30
% ( H.R ), % (Incidencia)
90
20
5
10
0
0
2°
3°
JULIO
4°
1°
2°
3°
4°
AGOSTO
1°
2°
3°
4°
5º
SEPTIEMBRE
Semanas
FIGURA 3. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad en cultivo de lilium. Julio a septiembre 2005. Olmué, V región
A diferencia de Algarve y Umbría, y usando la misma densidad de plantación es
posible divisar el suelo desde la parte superior ya que las variedades anteriormente
mencionadas formaban una barrera que dificultaba el paso del aire, y mantenía el
suelo húmedo luego de los riegos.
Black Out, única variedad cultivada en ambos períodos de muestreo, no presentó
síntomas asociados a este tipo de enfermedades.
4.6. Índice de intensidad de daño por variedad:
Las variedades Algarve, Menorca y Wiener Blut presentan su mayor índice de daño
(Figura 4) en el momento en que ocurre la mayor incidencia del período (tercera
semana de julio). Estas tres variedades alcanzan hasta seis lesiones por hoja,
disminuyendo considerablemente el área fotosintética. La tendencia observada es una
disminución de este índice a medida que se aproxima la cosecha. El mayor índice lo
presenta Wiener Blut alcanzando el 35,4 %. Al igual como se mencionó en la
incidencia, estas variedades presentan una mayor superficie por hoja y una gran
cantidad de follaje que favorece al patógeno para encontrar una película de agua para
germinar y provocar infección.
En el caso de la variedades Madrid, Navona Umbría y Gironde, el índice varía
durante el período o se mantiene constante, no presentando una tendencia general. En
estas variedades el grado de ataque alcanzó una a dos lesiones por hoja.
NAVONA
W. BLUT
Tº Mín. media sem.
UMBRIA
MADRID
Tº Máx. media sem.
GIRONDE
ALGARVE
% H.R. Media sem.
MENORCA
B. OUT
100
30
25
80
70
ºC ( Tº)
20
60
50
15
40
10
30
20
5
% ( H.R ), % (Indice de daño)
90
10
0
0
2°
3°
JULIO
4°
1°
2°
3°
4°
1°
2°
AGOSTO
3°
4°
5º
SEPTIEMBRE
Semanas
FIGURA 4. Índice de daño de Botrytis elliptica por variedad durante el cultivo de lilium. Julio a Septiembre 2005.
Olmué,
V
región.
4.7. Identificación de cepas obtenidas:
Los aislados anteriores (786,787 y 911) y los encontrados en el predio de Olmué,
fueron identificados a través de características proporcionada por literatura, poniendo
énfasis a las estructuras reproductivas como tamaño de conidias, tamaño del
conidióforo, tamaño de los esclerocios. Además se estudiaron las características de la
colonia y sintomatología observada en terreno como la realizada en las pruebas de
patogenicidad.
La examinación microscópica de las características morfológicas y la observación
visual de las colonias crecidas en medio de cultivo, permitieron corrobar que las
cepas aisladas durante el primer período de muestreo corresponden a la especie
Botrytis cinerea (Anexo 7).
Las características de la lesión provocada en la hoja, las características de la colonia y
de los esclerocios permitieron identificar como Botrytis elliptica a las cepas aisladas
durante el segundo período (Anexo 7). Estas cepas no lograron esporular dada su
dificultad de producir conidias in vitro, incluso sometiéndolas a los mismos
tratamientos de luz UV-A de B. cinerea.
Las cepas 786, 787 y 911 lograron producir conodióforos y conidias luego de colocar
hojas con lesiones, obtenidas de las pruebas de patogenicidad, en cámaras húmedas.
4.7.1. Color de la colonia
Las colonias de B. cinerea cultivadas en medio APDA presentaron un micelio
blanquecino que luego de colocarlas en luz negra (UV-A, 320 nm) se tornó grisáceo y
café grisáceo (Figura 5c). Esta característica concuerda por lo descrito por la
descripción n° 431 del CMI (1974). Por su parte, las colonias de B. elliptica tiene
45
aspecto algodonoso, con micelio denso creciendo sobre la superficie del agar, de
color blanco sin cambio aparente luego del tratamiento de luz (Figura 5d). Éstas no
presentaron color grisáceo como lo observado por CABRERA, ALVAREZ y SOSA
(2005). Es probable que la falta de coloración sea debido a que no desarrolló
estructuras reproductivas en las placas, debido a su dificultad para esporular bajo
condiciones de laboratorio, según lo observado por DOSS, CHASTAGNER y RILEY
(1984).
4.7.2. Características de estructuras reproductivas
Las conidias de B. cinerea se observaron lisas, de forma oval. Miden en promedio
10,05 µm de largo y 6,27 µm de ancho. Los conidióforos de 10 cepas fueron medidos
al microscopio óptico, encontrando un promedio de 1.422 µm largo y de 11,6 µm de
ancho. Los conidióforos se presentan en forma libre y ramificados. (Figura 5a). Las
dimensiones de ambas estructuras se encuentran dentro de los rangos presentados por
la descripción n° 431 del CMI (1974).
Las conidias de B. elliptica se observaron de forma elipsoide a ovoide, de
dimensiones 23,7 µm de largo promedio y de 16,5 µm de ancho promedio. Los
conidióforos de Botrytis elliptica presentan 955 µm de largo y 86 µm de ancho. Estos
se encuentran poco ramificados en los extremos (Figura 5b). Estas características
concuerdan con la información presentada por DOSS, CHASTAGNER y RILEY
(1984), para describir esta especie.
46
FIGURA 5. a) Conidióforo y conidias de Botrytis cinerea. Barra = 20 µm.
b) Conidióforo y conidias de Botrytis elliptica. Barra = 20 µm.
c)Colonia correspondiente a Botrytis cinerea, luego de 6 días puesta bajo luz negra.
d) Colonia de Botrytis elliptica, expuesta a la misma condición.
47
4.7.3. Características del esclerocio.
Los esclerocios de B. cinerea son de color negro, de forma y tamaño irregular, miden
de 3 a 5 mm de diámetro, promediando 3,85 mm. Estas dimensiones concuerdan con
las observadas por HSIANG y CHASTAGNER (1992). Se les encuentra aglomerados
o creciendo en forma individual.
Los esclerocios de B. elliptica son de forma redondeada y elíptica, de color negro, en
su mayoría creciendo en forma individual, de 1 a 2 mm de diámetro. El promedio es
de 1,49 mm. Las dimensiones también concuerdan con lo observado por HSIANG y
CHASTAGNER ( 1992).
4.8. Pruebas de patogenicidad:
4.8.1. Síntomas observados
Luego de dos días, las plantas inoculadas con B. elliptica comenzaron a mostrar
síntomas en el envés de la hoja, con presencia de manchas de un color café oxidado a
naranjo, y de forma alargada (Figura 6c). Posteriormente en el haz, se colocó
traslúcida la zona afectada. Este síntoma también fue observado por VAN
BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004. Esa lesión evolucionó hasta colocarse de
color café oxidado, alcanzando entre 1 a 2 cm de largo y 0.5 cm de ancho. Sin
embargo, algunas hojas mantuvieron la mancha traslúcida y en otras quedó un orificio
en el lugar de la infección.
El síntoma característico de la lesión necrótica, se observa primero en la variedad
Algarve, la cual presenta lesiones de forma alargada en las hojas superiores, que
luego de seis días comenzaron a expandirse. Estos mismos síntomas se observaron en
las variedades Gironde, Wiener blut y Navona luego de 10 días.
48
FIGURA 6. a) Lilium infectado por Botrytis elliptica durante el segundo período.
b) Lesiones necróticas presentadas en var. Algarve en las pruebas de patogenicidad.
c) Síntoma inicial de B. elliptica observado en el envés. d) Manchas necróticas
puntiformes asociadas a B.cinerea en hojas de lilium artificialmente inoculadas.
49
A los 20 días de inoculación, dos plantas de la variedad Algarve inoculadas con las
cepas 786 y 911 presentaron marchitez total de la planta, con hojas y tallos secos
donde se aprecian en forma muy nítida de un color más oscuro el lugar de las lesiones
iniciales y los anillos concéntricos. Las demás variedades presentan sólo algunas
hojas con lesiones que al extenderse se unían, provocando marchites y posterior
desecamiento ( Figura 6b).
En las plantas inoculadas con B. cinerea, se observaron lesiones muy puntuales, de un
color café oscuro de no más de un cm, no extendidas y en menor número que las
generadas por B. elliptica. Un síntoma muy distintivo fue observado en el envés de la
hoja, la cual presentaba puntuaciones superficiales de color negro, que luego de
aislarlas en APDA confirmaron la presencia de este patógeno (Figura 6d).
Gironde y Navona además de presentar las lesiones características, manifestaron en
las hojas inferiores estrías amarillas continuas a la lesión, observadas anteriormente
por DOSS, CHASTAGNER y RILEY(1988).
4.8.2. Evaluación de la enfermedad.
Luego de 20 días se evaluaron las plantas. Los datos obtenidos fueron sometidos al
análisis estadístico correspondiente para demostrar la capacidad patogénica de ambos
tipos de Botrytis.
Al ser reaisladas las cepas de ambas especies de Botrytis desde las plantas inoculadas,
éstas mantuvieron las mismas características de los aislados originales. Mediante esta
comparación se cumplen los postulados de KOCH, con lo cual se logró aislar e
identificar las especies Botrytis elliptica (cepa 786,787 y 911) y Botrytis cinerea
(cepa 1010,1014 y 1016) como causantes de enfermedad en lilium cultivados en
invernaderos de la zona de Olmué.
50
Todas las plantas inoculadas con B. elliptica originaron síntomas de lesión expansiva
y necrótica, en mayor o menor grado, por lo cual se reconoce como hongo capaz de
provocar enfermedad en cultivares asiáticos de Lilium sp.
Las cepas de B. cinerea, a diferencia de B. elliptica, no lograron ser patogénicas para
todas las plantas, lo que sumado a la baja incidencia en el muestreo realizado (Figura
1), se reconoce como un patógeno poco agresivo, pero capaz de provocar
enfermedad.
Las plantas testigos permanecieron sanas durante el ensayo.
Según el análisis de varianza existe interacción entre la cepa de Botrytis y la variedad
en el desarrollo de la enfermedad. Si se compara el efecto de ambas patógenos, se
distingue claramente un mayor daño de B. elliptica por sobre B. cinerea (Figura 7).
Según los resultados de las pruebas de patogenicidad, Wiener blut no presentó
diferencias significativas de acuerdo a la cepa de B.elliptica. inoculada.
La variedad Algarve se vio más afectada que Navona, independiente de la cepa
utilizada.
Las otras variedades tuvieron diferentes efectos dependiendo de la cepa.
Es importante mencionar que no se tienen antecedentes a nivel bibliográfico de la
susceptibilidad o tolerancia a B. elliptica. de las variedades empleadas.
7
a
a
ab
6
abc
abcd
5
Escala
de
bcd
cd
cd
4
fg
3
fgh
gh
2
hhhh
hh
h
h
h
ef
fg
GIRONDE
fgh
h
h
h
ALGARVE
NAVONA
W.BLUT
h
1
0
Test
1016
1014
1010
911
787
786
Tratamientos
FIGURA 7.
Ìndice de daño observado en
estadísticamente
significativas,
las pruebas de patogenicidad. Letras distintas indican diferencias
al
5%,
según
Duncan.
5. CONCLUSIONES
De acuerdo a las pruebas de patogenicidad efectuadas, se demuestra que Botrytis
cinerea y Botrytis elliptica son patógenos capaces de generar enfermedad en lilium
cultivados en invernaderos, aunque los aislados correspondientes a la especie Botrytis
elliptica son los que provocan un mayor daño.
Conforme al estudio epidemiológico realizado, la incidencia de Botrytis elliptica se
inició en el mes de julio, desarrollándose la enfermedad hasta septiembre, en cultivos
bajo invernadero frío ubicados en Olmué, V región. La incidencia máxima alcanzada
fue de un 45%, la que ocurrió en el mes de julio, asociadas a temperaturas máximas
inferiores a los 20°C y humedades relativas superiores al 90%.La especie Botrytis
cinerea aparece en forma dispersa durante el período comprendido entre abril y julio,
con un nivel de de incidencia máxima de un 10%.
53
6. RESUMEN
Durante el año 2003, se observaron lesiones necróticas en hojas de lilium cultivados
bajo invernadero frío en la zona de Olmué, V región. En la presente investigación, los
aislados producidos y conservados en ese período fueron recuperados para determinar
su patogenicidad.. Al mismo tiempo se realizaron dos muestreos entre abril y
septiembre en la misma zona para determinar la incidencia e índice de daño
provocada por el patógeno. Esto se relacionó con la temperatura y humedad relativa
presente en el invernadero.
La identificación de los aislados obtenidos se realizó comparando las características
con literatura. Esto permitió corroborar la presencia de Botrytis cinerea y Botrytis
elliptica.
Botrytis cinerea se detectó sólo durante el primer muestreo (abril-julio), en forma
puntual y sin presentar algún tipo de tendencia. De los resultados de la incidencia e
índice de daño, se demuestra que Botrytis cinerea no afecta significativamente al
cultivo. Por el contrario, Botrytis elliptica, no se presentó en el primer muestreo,
apareciendo en el mes de julio. La incidencia y el índice de daño disminuyen a
medida que transcurre el muestreo, debido a que varían las condiciones de
temperatura y humedad relativa.
Para realizar las pruebas de patogenicidad, se eligieron los aislados 1010,1014 y 1016
correspondientes a Botrytis cinerea, y 786,787 y 911 correspondientes a Botrytis
elliptica, los cuales fueron inoculados en las variedades Algarve, Wiener Blut,
Gironde y Navona cultivadas bajo condiciones ambientales controladas. Escasas
plantas mostraron sintomatología asociada a Botrytis cinerea. Todas las variedades
presentaron, en distintos grados, lesiones asociadas a Botrytis elliptica.
De acuerdo al análisis efectuado, se concluye que ambos patógenos son capaces de
generar enfermedad en plantas de lilium cultivados en invernadero, pero la especie
Botrytis elliptica es la que provoca un mayor daño al cultivo.
54
7. ABSTRACT
During the year 2003, necrotic lesions were observed on lily (lilium sp.) leaves, from
plants cultivated an unheated greenhouse, in Olmué, 5th Region, Chile. In this study,
isolates that were collected and stored were then re-introduced to determine their
pathogenicity. In the same area, between April and September, two samplings were
done to determine the incidence and damage levels provoked by the pathogens. These
were than related to the temperature and relative humidity conditions of the
greenhouse.
The identification of the isolates was done by comparing their characteristics with
previous descriptions from the literature, thus permitting to confirmation of the
presence of Botrytis cinerea and Botrytis elliptica. Botrytis cinerea was detected only
in the first sampling (April-July), and did not show a pattern. The results of the
incidence and damage index show that Botrytis cinerea did not significantly affect the
lilies. On the other hand Botrytis elliptica was not present in the first sampling; it
appeared in the month of July. The incidence and damage index diminished over the
sampling time, due to the variability of temperature and relative humidity conditions.
The Botrytis cinerea isolates 1010,1014 and 1016, and Botrytis elliptica 786, 787,
and 911, were chosen for inoculating the lily varieties Algarve, Wiener Blut, Gironde
and Navona cultivated under controlled environmental conditions. Few plants showed
the symptomatology associated with Botrytis cinerea. All of the varieties had, in
varying degrees, lesions associated with Botrytis elliptica.
As a result of these analyses, it was concluded that both pathogens are capable of
producing disease in greenhouses- grown lilies, but the Botrytis elliptica species
provokes greater damage in this crop.
55
8. LITERATURA CITADA
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ANEXOS
ANEXO 1
N° de plantas por variedad de lilium muestreadas.
Variedades del primer período.
N° de plantas
All Round
6400
Black Out
4400
Tresor
12400
Valdisole
18800
Total
42000
Variedades del segundo período
N° de plantas
Algarve
12500
Madrid
6000
Wiener Blut
8000
Menorca
6500
Navona
3000
Umbria
12000
Gironde
8500
Black Out
2000
Total
58500
63
ANEXO 2
Fungicidas aplicados durante el primer muestreo.( abril-julio)
3 de mayo
Sumisclex
6 de mayo
Switch
27 de mayo
Sumisclex
10 de junio
Vangard
15 de junio
Aliette
23 de junio
Bemex
Fungicidas aplicados durante el segundo muestreo ( julio-septiembre)
9 de julio
Actara
14 de julio
Switch
19 de julio
Vangard
27 de julio
Sumisclex
5 de agosto
Switch
13 de agosto
Vangard
22 de agosto
Aliette
5 de septiembre
Sumisclex
16 de septiembre
Bemex
64
ANEXO 3
Fecha:
Variedad:
N° de plantas:
Nº de planta
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Incidencia
Índice de daño
65
ANEXO 4
Escala para determinar índice de daño en plantas inoculadas bajo condiciones
controladas.
Índice
Daño por planta
1
0 lesión
2
1-5 lesiones
3
6-10 lesiones
4
11-15 lesiones
5
16-20 lesiones
6
> 21 lesiones
66
ANEXO 5
Índice de daño (%) por variedad causado por Botrytis cinerea, durante el período
abril-julio 2005.
Valdisole
Black Out
All Round
Tresor
19/4
0
0
0
0
26/4
0
0
2.2
1.3
8/5
0
0
0
0
10/5
0
0
0
0
17/5
0
0
0
0
24/5
0
0
0
0
31/5
2.6
0
0
0
7/6
0
3.3
2.2
0
14/6
0
0
0
0
21/6
0
0
0
0
28/6
0
0
0
1.3
5/7
0.8
3.3
0
0
67
ANEXO 6.
Índice de daño general (%) provocado por B.elliptica, durante el período julioseptiembre.
Fecha
Índice de daño(%)
12/7
0
19/7
17.62
26/7
11.08
2/8
11.39
9/8
10.82
16/8
11.96
23/8
12.53
30/8
10.53
6/9
9.21
13/9
8.34
20/9
8.15
27/9
4.21
68
ANEXO 7
Cepas correspondientes a Botrytis cinerea y Botrytis elliptica encontradas entre abril
y septiembre de 2005.
Cepa (Aislado)
Especie
998
Botrytis cinerea
1005
Botrytis cinerea
1010
Botrytis cinerea
1011
Botrytis cinerea
1012
Botrytis cinerea
1013
Botrytis cinerea
1014
Botrytis cinerea
1015
Botrytis cinerea
1016
Botrytis cinerea
1017
Botrytis cinerea
1018
Botrytis cinerea
1031
Botrytis elliptica
1032
Botrytis elliptica
1033
Botrytis elliptica
1034
Botrytis elliptica
1035
Botrytis elliptica
1036
Botrytis elliptica
1037
Botrytis elliptica
1038
Botrytis elliptica
1039
Botrytis elliptica