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1. INTRODUCCIÓN En nuestro país, el cultivo del lilium como flor de corte tiene una importancia económica relevante dentro del mercado exportador de flores, alcanzando un valor de US $ 1,6 millones durante el año 2005, representando más del 60% del total de exportaciones (ODEPA, 2005). En cultivos al aire libre de la IX y X regiones, y en invernaderos de la V región, se ha presentado una sintomatología semejante a la descrita para Botrytis (VERDUGO, 2006)*. Este género tiene la capacidad de ser agente patógeno del cultivo provocando daño foliar, y la consecuente pérdida económica, debido a los costos que supone su control preventivo y curativo, debido al alto nivel de exigencia sanitaria que se requiere para exportar. En la V región, el cultivo para flor de invierno se realiza en invernaderos donde se producen condiciones óptimas de humedad y temperatura para el desarrollo de esta enfermedad, lo que favorece su propagación espacial y temporal. El conocimiento de la etiología y epifitiología permite determinar el ciclo de la enfermedad, con lo cual es posible manejar estrategias de control eficientes basadas en características definidas y estables del agente causal. * Verdugo, G., Ing. Agrónomo. Ms. Cs. Profesora cátedra Floricultura Facultad de Agronomía PUCV. Comunicación personal. 2 De acuerdo a esto, la investigación tuvo como objetivos: • Estudiar la etiología y epifitiología de las enfermedades causadas por el género Botrytis en un cultivo de lilium bajo invernadero frío, con el fin de evaluar la incidencia de este tipo de patologías en la zona de estudio. • Demostrar la capacidad de Botrytis cinerea y Botrytis elliptica de causar enfermedad en plantas de Lilium sp. 3 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. Antecedentes generales de la planta de Lilium sp.: El género Lilium pertenece a la familia de las Liliáceas, al igual que importantes especies utilizadas como flores de corte, tales como tulipanes, narcisos y Allium. El bulbo, carente de túnica, está formado por hojas modificadas que se agrupan en un disco basal o tallo modificado. Estas hojas son gruesas, generalmente de color blanco y de forma triangular, cuya función es almacenar sustancias de reserva para iniciar el crecimiento vegetativo. El sistema radicular es abundante, presentan raíces adventicias caulinares y otras de tipo basal. Las raíces principales basales son carnosas con tonalidades marrones; tienen grosores de 2 a 3 mm de diámetro y longitudes de 15 a 20 cm. Las raíces adventicias aparecen en el tallo por sobre el bulbo y permiten el desarrollo aéreo al complementar la función de las raíces basales. El tallo surge del disco basal situado en el interior del bulbo. Las hojas son lanceoladas u oval-lanceoladas, de dimensiones variables (10 a 15 cm de largo y anchos de 1 a 3 cm), sésiles o mínimamente pecioladas. El color es generalmente verde intenso. Las flores se sitúan en el extremo del tallo; sus sépalos son de varios colores, y se encuentran desplegados o curvados dando a la flor apariencia de trompeta. Se disponen solitarias o agrupadas en inflorescencias (racimos o corimbos), mostrándose erguidas o péndulas (BAÑON et al., 1993). 4 2.2. Antecedentes generales del cultivo: El cultivo se puede efectuar todo el año, incluso se pueden realizar hasta tres cultivos dependiendo de las características de los cultivares. La plantación se hace generalmente en mesas, en suelos con buen drenaje, estructura y con buen contenido de materia orgánica. Durante el período de cultivo es necesaria la utilización de mallas plásticas que sirven de soporte, las cuales se elevan a medida que éste crece (SEEMANN y ANDRADE, 1999). 2.3. Condiciones ambientales en el invernadero: 2.3.1 Temperatura. Para obtener un producto de calidad es necesario conseguir una buena formación de raíces. Esto se consigue con temperaturas ambientales de 12 a 13 °C durante el primer mes de plantación. Temperaturas más bajas alargan innecesariamente el período de crecimiento. Durante el desarrollo del cultivo, en el caso de los híbridos asiáticos, deben mantenerse temperaturas promedio de 14 a 15°C. Para obtener la máxima calidad se requiere que las temperaturas alcancen los 20° a 25°C durante el día y de 8 a 10 °C durante la noche. Con temperaturas nocturnas superiores a 15-20°C se reduce la calidad de las flores. Si las temperaturas nocturnas son superiores a 20 °C, se afecta la calidad de la vara. Temperaturas muy bajas prolongan el cultivo. Para los híbridos orientales, el manejo de temperaturas es más delicado, debiéndose lograr una temperatura constante ente 15 a 17°C. Temperatura por debajo de los 15°C pueden causar amarillamiento o caída de la hoja. 5 Lilium longiflorum necesita temperaturas óptimas de 14°C a 16°C, pudiendo alcanzar durante el día los 20 a 22° C. Si las temperaturas disminuyen de 14°C se observan grietas en los pétalos (CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f). 2.3.2 Humedad El nivel correcto de humedad relativa es de 80 a 85%. Es importante evitar oscilaciones para evitar quemaduras de las hojas en cultivares sensibles. La ventilación es fundamental para reducir la alta humedad relativa y para el control de la temperatura. Se debe evitar que la humedad relativa baje demasiado rápido para evitar daños en las hojas y ocasionar pérdidas de calidad. La humedad relativa alta favorece la presencia de enfermedades, como las ocasionadas por Botrytis sp. (CENTRO INTERNACIONAL DE BULBOS DE FLOR, s. f). 2.4. Antecedentes fitopatológicos : Según BAÑON et al. (1993), lilium es atacado por las siguientes enfermedades: La podredumbre del pie puede estar asociada a Phytophthora parasitica o Phytophthora nicotianae. Los daños provocados se observan a nivel de cuello, causando un decaimiento repentino por la obstrucción de los haces vasculares. El hongo Pythium ultimum produce una lesión al cuello que afecta el sistema radicular adventicio. Las raíces se vuelven café claro y de textura vidriosa, derivando en una putrefacción general que termina con el corte del tallo, dando muerte a la planta. Rhizoctonia solani produce su daño a nivel de suelo. Su presencia se distingue por que el brote apical presenta retraso en la emergencia y las primeras hojas están podridas, las cuales caerán dejando cicatrices en el tallo. 6 El hongo Fusarium oxysporum (f.sp.Lilii y f.sp. narcissi) es el agente causal de la pudrición basal en bulbos. Los síntomas del ataque son una podredumbre pardo oscura, que comienza en el disco basal para extenderse por toda la planta. La parte externa presenta marchitez afectando incluso el botón floral, los cuales no serán viables o tendrán antesis antes de su fecha de floración. Cylindrocarpon destructans y Cylindrocarpon radicicola producen pudrición de escamas y en el interior del bulbo. Otros hongos que afectan al bulbo, principalmente en almacenaje, son Penicillium sp. y Rhizopus nigricans. Las especies de Botrytis, por ser parte fundamental de este estudio serán descritas más adelante. Lilium también es atacado por bacterias, siendo la principal especie Erwinia carotovora que provoca manchas traslúcidas en las escamas y posterior pudrición del bulbo que termina en marchites generalizada y muerte. Los daños por virus se caracterizan por producir distorsiones, manchas jaspeadas a nivel foliar y crecimiento enanizante. Existen variedades de lilium sensibles, resistente e inmunes. Las resistentes pueden actuar como portadoras y contaminar otras variedades sensibles. El LSV (Lily Simtomless Virus) es particularmente importante por provocar manchas cloróticas en las hojas, alargadas paralelamente a las nervaduras y posteriormente se vuelven necróticas. 7 2.5. Antecedentes fitopatológicos en Chile: En nuestro país el cultivo ha tenido condiciones óptimas para su desarrollo. Sin embargo, también se han detectado problemas de carácter patológico que pueden frenar el cultivo si no se detectan a tiempo. Los problemas más graves en multiplicación y producción de bulbos son los virus. En la zona sur (VIII a X región) se realizaron estudios demostrando que el cultivo puede infectarse principalmente por LSV (Lily Simtomless Virus), TVB (Tulip Break Virus) y TRV (Tobacco Rattle Virus) (MUÑOZ y FERNÁNDEZ, 2000). En la zona norte, principalmente en el valle de Azapa, se detectó Fusarium sp., provocando clorosis y pérdida de turgencia en las zonas basales (SEPÚLVEDACHAVERA et al., 2004) 2.6. Botrytis cinerea: Botrytis pertenece al Phylum Ascomycota, clase Ascomycetes, orden Helotiales, familia Sclerotiniaceae, género Botrytis (ITIS, 2005). Dentro de este género, la especie Botrytis cinerea Pers. es la única especie polífaga, afectando a más de 200 tipos de plantas. Todas las demás especies son consideradas específicas, con un rango de hospederos estrecho. (VAN BAARLEEN, STAATS y VAN KAN, 2003). Según AGRIOS (1996), es una de las enfermedades más comunes y más ampliamente distribuidas de hortalizas, plantas ornamentales, frutales, cultivos tradicionales y por sobre todo, en plantas cultivadas bajo invernadero. 8 2.6.1. Síntomas En plantas de lilium, se presenta produciendo el característico micelio gris, afectándolas en cualquier estado de desarrollo, incluso en postcosecha, llegando a producir muerte de plántulas, pudrición en la base de las varas, pudrición de bulbos y tizón de la flor, donde además se observa abundante esporulación y desarrollo de esclerocios si se producen condiciones adversas. B. cinerea puede ser aislada de lesiones en hojas de lilium, pero no presenta lesiones tan extendidas como las provocadas por Botrytis elliptica (GOULD, 1963). VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN (2004), comprobaron la escasa patogenicidad de B. cinerea, a través de la inoculación de plantas sanas de lilium. Después de nueve días, se generaron pequeñas manchas oscuras, evidencia de escasas células muertas. Las lesiones no se extendieron y a través del microscopio no encontraron micelio, pese a observar germinación de conidias en el lugar de infección. También demostraron que al aumentar la concentración del inóculo era posible obtener síntomas. 2.6.2. Características morfológicas Entre las características objetivas para distinguir a B.cinerea de otras especies de Botrytis están: el crecimiento y forma del micelio, el tamaño y color del conidióforo, la forma, tamaño y color de las conidias, y tamaño del esclerocio. 9 2.6.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales Las colonias al principio son hialinas, luego se tornan gris a café grisáceo con el desarrollo de las conidias (CMI, 1974). Las hifas son septadas y ramificadas (JARVIS, 1977). Los conidióforos son erguidos, simples o ramificados (ALEXOPOULOS, 1966). Miden 750 µm hasta 2 mm de longitud y 16-30 µm de ancho, tienen una protuberancia apical con ramificaciones alternas. Presentan color café oscuro y tienen la pared lisa (CMI, 1974). En las células apicales se producen racimos de conidias unicelulares y multinucleadas (CMI, 1974). Los conidióforos y los racimos de conidias se asemejan a un racimo de uvas (AGRIOS, 1996). En la superficie de las hojas infectadas se elevan uno a dos mm. Las conidias son ovales o esféricas, hialinas o de color café pálido, hidrófobas, de pared lisa y miden entre 8-14 µm de largo y 6-9 µm de ancho (CMI, 1974, HSIANG y CHASTAGNER, 1991). 2.6.2.3. Esclerocios Este hongo produce esclerocios irregulares, planos, duros y de color negro (AGRIOS, 1996). Según HSIANG y CHASTAGNER (1992) el tamaño varía entre 3,5 y 5 mm. Éstos consisten en una médula densamente empaquetada con un pseudoparénquima color café a negro y una capa cortical de células de 5-10 µm de diámetro. La parte externa está compuesta por una malla de hifas entramadas uniéndose en un cuerpo compacto que va madurando por la acumulación de pigmentos de melanina. 10 2.6.3. Reproducción sexual. El teleomorfo es Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel . Este estado se caracteriza por la producción de apotecios de color café claro que emergen del esclerocio durante la primavera o a principios del verano. El apotecio se caracteriza por poseer una superficie poco hendida, casi llana. El estipe mide entre 3 a 15 mm. Las ascosporas que se originan del apotecio miden 8-12 µm de largo y 4-6 µm de ancho (CMI, 1974). 2.6.4. Desarrollo de la enfermedad. 2.6.4.1 Infestación La infestación o inoculación es el proceso mediante el cual un patógeno y su hospedero entran en contacto. En el caso de B. cinerea se produce cuando la conidia diseminada entra en contacto con el hospedero. También ocurre cuando una superficie infestada con micelio entra en contacto con un tejido sano (AGRIOS, 1996). 2.6.4.2. Penetración La conidia, después de haber sido incubada unas horas bajo condiciones favorables a la germinación, se adhiere fuertemente a un sustrato vivo o descompuesto mediante la producción de secreciones (DOSS et al., 1995). Una vez adherida penetra directamente al perforar mecánica y/o enzimáticamente la cutícula e indirectamente por heridas o por aberturas naturales (principalmente estomas y estigmas) (LATORRE, 1986). 11 La penetración mecánica de B. cinerea se realiza través del apresorio que nace del extremo distal de la conidia germinada. De este apresorio surge el estilete de infección, el cual penetra directamente la cutícula hasta las células epidermales (AUGER, 1988). En lilium, las conidias que han germinado rara vez penetran directamente en los tejidos que muestran un crecimiento activo, pero si lo hacen a través de heridas o después de que se han desarrollado durante un cierto tiempo y han formado micelio sobre pétalos de flores senescentes, follaje senescente, escamas de bulbos muertos, etc. (HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001). La penetración enzimática de la cutícula, se produce gracias a la producción de enzimas como pectinasas y polygalacturonasas (VERHOEFF, 1974). Además, el patógeno produce ácido oxálico que acidifica el tejido de la planta para facilitar la hidrólisis de la pared celular (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004). Durante la penetración, en las células del tejido de la hoja se produce peróxido de hidrógeno y óxido nítrico, que permiten el ingreso del tubo de germinación de las conidias (VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004). Sin embargo, este proceso de infección se bloquea durante la penetración de la pared celular, debido a que la planta es capaz de generar una respuesta en defensa al ataque de este patógeno (HSIEH, HAUNG y HSIANG, 2001). 2.6.4.3. Infección La enfermedad puede manifestarse en forma sintomática o latente. La infección sintomática corresponde a la infección común, en la cual el patógeno ha penetrado directamente o por heridas. LATORRE (1986) señala que si las condiciones son óptimas, la incubación ocurre en pocas horas y rápidamente se producen reinfecciones, debido a las conidias producidas luego del desarrollo de los primeros síntomas de Botrytis. 12 La infección latente o asintomática es aquella en la que el patógeno ha cesado de estar agresivo temporal o permanentemente y los síntomas no están presentes. Según VERHOEFF (1974), la infección puede permanecer latente hasta un punto en el cual el estado agresivo nunca se activa o lo hace muy tarde como para afectar gravemente a la planta. La presencia de B. cinerea en forma latente en lilium es particularmente dañina, ya que durante el traslado o la exportación, si se producen las condiciones óptimas de crecimiento, provocarían una pudrición (MILLER, 1992). Esta fase es un mecanismo de sobrevivencia y de alguna forma podría influir en las epidemias. Además le permite mantenerse hasta que el tejido se vuelva senescente y no oponga resistencia al ataque (BRAUN y SUTTON, 1988). 2.6.4.4. Resistencia a la enfermedad Un estudio realizado en lilium al inocular flores con conidias demostró que una secreción de fitotoxinas lograban bloquear la infección en el interior del ovario, al crear deficientes condiciones para el desarrollo del hongo. Se observo un aumento de la acción de la peroxidasa cerca del crecimiento del micelio, además de un incremento de la concentración alrededor en las paredes celulares. La peroxidasa actúa lignificando la pared celular lo que provocaría una mayor resistencia (GEORGIEVA, EDREVA y RODEVA, 2003). Esta respuesta defensiva no es propia de lilium. En estudios realizados en tomate se comprobó la presencia de un aumento de la peroxidasa frente al ataque de Botrytis cinerea. Este efecto es una respuesta frente a la presencia de hongos, bacterias y virus (GEORGIEVA et al., 2003) 13 2.6.4.5. Dispersión En clima húmedo, el hongo libera fácilmente sus conidias y éstas son diseminadas por el viento (AGRIOS, 1996). Según LATORRE (1986) la lluvia, por el fenómeno de salpicado, tiene también importancia en la liberación y diseminación de conidias. Al interior de un invernadero, las conidias son liberadas al ambiente por un mecanismo higroscópico asociado a un cambio rápido en la humedad relativa (DAUGHTREY y BENSON 2005). MILLER (1992) señala que es fundamental el manejo de los desechos del cultivo, ya que ellos provocan una dispersión de esporas si no son tratados adecuadamente. 2.6.4.6. Sobrevivencia B. cinerea puede sobrevivir como saprófito en un gran número de plantas cultivadas y malezas, o en materias en descomposición (AUGER, 1988). Las conidias pueden sobrevivir por más de 14 meses en almacenamiento, aunque disminuye su viabilidad. (SALINAS et al., 1989). Sin embargo, sobre la tierra no son capaces de lograrlo. En el suelo el hongo inverna en forma de esclerocios producidos sobre restos orgánicos dejados luego de cosechar las flores, o de micelio que se desarrolla en restos de plantas en proceso de descomposición (BERG y LENTZ, 1968). 2.6.4.7. Fuente de inóculo DAUGHTREY y BENSON (2005), descubrieron que los esclerocios pueden sobrevivir bastante tiempo y ser útiles como fuente de inóculo para la siguiente estación. El tiempo que pueden sobrevivir fluctúa entre cinco y nueve meses. Prácticas de control de malezas tanto químicas como mecánicas no tienen efecto en su sobrevivencia. 14 2.6.5. Efecto de los factores ambientales Para que una enfermedad se produzca y se desarrolle óptimamente, debe haber una combinación de tres factores: hospedero susceptible, patógeno infectante y un medio ambiente favorable (AGRIOS, 1996). 2.6.5.1. Temperatura de crecimiento JARVIS (1977) encontró que la temperatura óptima de crecimiento de micelio de Botrytis cinerea en medio PDA es de 22°C. En condicionas ambientales controladas, no se detectó producción de micelio aéreo ni de conidias a temperaturas de 30°C. El micelio requiere de un clima húmedo y moderadamente frío (18 a 23°C) para que se desarrolle adecuadamente, esporule, libere y germine sus esporas y para que produzca infección (DAUGHTREY y BENSON, 2005). 2.6.5.2. Temperatura de esporulación Existen diferencias notables de acuerdo al hospedero del cual se obtiene la cepa. THOMAS, MAROIS y ENGLISH (1988) estudiando cepas del patógeno obtenidas de uva; señalan que la mayor producción de conidias bajo condiciones ambientales controladas se logró a 21°C. Sin embargo, JARVIS (1977), define la temperatura óptima para la esporulación en 15°C. 15 2.6.5.3. Temperatura de germinación e infección Según LATORRE y RIOJA (2002) la germinación de conidias ocurre en un amplio rango de temperaturas (5° a 30°C), con un óptimo de 20C°. La infección puede ocurrir a bajas temperaturas cuando las plantas permanecen mojadas por largos períodos de tiempo (RIES, 1995). JARVIS (1992) señala que la temperatura óptima de germinación de esporas es de 20°C y la temperatura óptima de crecimiento del tubo germinativo es de 30°C. 2.6.5.4. Temperatura para la formación de esclerocios. De acuerdo con JARVIS (1992) los esclerocios se forman en otoño-invierno cuando las temperaturas fluctúan entre 11° y 13°C y germinan con temperaturas de 22° a 24°C. 2.6.5.5 Humedad El efecto más importante de la humedad ocurre sobre la germinación de las conidias de los hongos y sobre la penetración del tubo germinativo en el hospedero. También influye al incrementar la suculencia del hospedero, aumentando así su susceptibilidad a ciertos patógenos (AGRIOS, 1996). La humedad relativa necesaria para que ocurra infección es mayor al 90%, que provoca condensaciones producto de la evapotranspiración, difíciles de medir, pero suficientes para iniciar la germinación e infectar al hospedero. Los eventos de infección en el campo se inician en respuesta a lluvias, lloviznas o presencia de neblinas que condensan sobre el órgano afectado (LATORRE y RIOJA, 2002). 16 2.7. Botrytis elliptica: La especie Botrytis elliptica (Berk.) Cooke es infecciosa en la mayoría de las variedades de lilium, incluso algunas pueden llegar a la muerte si las condiciones favorecen su desarrollo ( GOULD, 1963). Su distribución a nivel mundial se debe a la introducción de material vegetal proveniente de zonas endémicas ( Holanda) hacia países donde el cultivo ha tenido una buena perspectiva comercial. HUANG et al., (2000) descubrieron variabilidad genética entre aislados de zonas tan distante como Norteamérica y Asia (Taiwán), pero no se encontró evidencia de que algún morfotipo sea específico para una región geográfica. 2.7.1. Síntomas. La enfermedad provocada por este hongo, produce inicialmente manchas en hojas con bordes bien delimitados, que al necrosarse toman una coloración café oxidado con formación de anillos concéntricos, características que la diferencian de B. cinerea. La superficie del tejido limitada por el anillo, visible tanto por el haz como por el envés, se degrada poco a poco, se arruga y finalmente se seca. La hoja puede ser atacada por el borde o el interior del limbo, al ingresar por el borde la hoja se deforma y es fácilmente confundida con síntomas de virus (GOULD, 1963, MILLER, 1992, SEEMANN y ANDRADE, 1992). CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO (2005) destacan su forma elíptica, más anchas en el centro y con los extremos aguzados, que al envejecer adquieren color grisáceo y aspecto velloso por la presencia de las estructuras reproductivas. Esta necrosis comienza generalmente en el extremo de la hoja o en la parte media y luego se extienden hasta el tallo. Señalan además que las infecciones más agudas se 17 observan preferentemente sobre las hojas más jóvenes donde los síntomas son más severos. GOULD (1963) y BAÑON et al. (1993) concuerdan que, en plantas jóvenes, cuando el daño se produce en el ápice, puede detener el crecimiento. El hongo puede atacar los tallos cerca del nivel del suelo, provocando una amarillez en el follaje. VAN BAARLEN, STAATS, y VAN KAN (2004) observaron como primer síntoma la traslucides de la epidermis, anterior a la lesión necrótica, luego de un día de la inoculación experimental. A través de microscopio óptico visualizaron plasmólisis de las células, luego de tres días de infección ubicada en la zona adyacente a la lesión. Las flores senescentes son un punto de entrada para la enfermedad. MILLER (1993) menciona que éstas presentan manchas de color café y que en condiciones frías y húmedas se pudren rápidamente cubriéndose de esporas. En condiciones secas las lesiones dejan de crecer y se secan. Cuando los botones florales son infectados en sus primeras fases de desarrollo, los más externos evidencian protuberancias y en los tépalos aparecen una serie de punteaduras, de color gris que al tacto se manifiesta como una podredumbre blanda. Si las flores no son removidas, se inclinan sobre las hojas superiores reteniendo humedad, dando las condiciones apropiadas para el ataque. Los híbridos orientales son menos susceptibles que los asiáticos. En algunas ocasiones, en lilium asiáticos, la hoja presenta estrías amarillas o rojas en sentido longitudinal a la lesión. DOOS, CHASTAGNER y RILEY (1988) señalaron que esto era provocado por una aceleración de la senescencia en la zona adyacente al punto de infección. Demostraron además que esto ocurría en plantas maduras y en hojas basales. 18 2.7.2 Características morfológicas 2.7.2.1. Micelio y estructuras reproductivas asexuales. Las colonias se presentan blanquecinas, expansivas, de aspecto algodonoso y denso, que luego se tornan gris, café grisáceo o negro. Las hifas son septadas y ramificadas (CABRERA, ALVAREZ y SOSA DE CASTRO, 2005). Esta especie se caracteriza por producir conidióforos formándose a partir del micelio, ramificados en los extremos, formando estructuras fialídicas pequeñas (CABRERA, ALVAREZ y SOSA, 2005). Los conidióforos son abundantes, de color café claro y de 500 µm a 2 mm de largo (GRIGALIUNAITE, 2001). En cada ápice de las fiálides del conidióforo nacen conidias hialinas o tenuemente coloreadas, que se oscurecen a la madurez, de forma elipsoide a ovoide (SMITH et al., 1992). Bajo condiciones favorables el conidióforo se desarrolla sobre las lesiones, produciendo conidias que maduran en 9 horas (GOULD, 1963). Según DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) este patógeno no produce conidias en forma abundante en condiciones de laboratorio. Sin embargo, ellos lograron obtener microconidias. Éstas son hialinas, de diámetro entre 2 a 3,4 µm y son formadas en cortas fialides que miden entre 5,9 a 10,7 µm de largo. Según JARVIS (1977) todas las especies de Botrytis tienen la capacidad de producir microconidias. Las dimensiones de las conidias varían entre 18 a 32 µm de largo y 13 a 24 µm de ancho (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984). 19 HSIANG y CHASTAGNER (1991) midieron el tamaño de conidias sensibles a fungicidas y las compararon con aquellas resistentes. El tamaño de las conidias provenientes de cepas sensibles promedio 17,8 µm de largo y 10 µm de ancho mientras que las cepas resistentes promediaron los 26,4 µm de largo y 19,2 µm de ancho. 2.7.2.2. Esclerocios B. elliptica produce esclerocios blancos en un principio, posteriormente se vuelven negros, de forma redonda, elíptica o irregular. Bajo condiciones favorables germinan en la primavera siguiente para producir micelio que dará origen a otro ciclo de infección. Al madurar en las hojas afectadas caen a la tierra durante el verano. Estos raramente se producen en el bulbo. (GOULD, 1963, VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997). El diámetro varía entre 1 y 2,1 mm (HSIANG y CHASTAGNER, 1992). 2.7.3. Reproducción sexual Después de muchos ensayos, DOSS, CHASTAGNER, y RILEY (1992) fueron los primeros en producir un estado sexual en laboratorio, al producir apotecios de los cuales se originan ascosporas. Sin embargo, no se encontró evidencia suficiente de su ocurrencia natural en el ambiente. 20 2.7.4. Desarrollo de la enfermedad 2.7.4.1. Penetración A través de estudios histológicos se ha podido determinar que la penetración ocurre en el envés de la hoja a través del estoma (DOSS, CHASTAGNER y RILEY, 1984). HSIEH, HAUNG y HSIANG (2001) observaron que a 20°C y 100% de humedad relativa las conidias germinan en ambas superficies de la hoja de lilium, pero los tubos de germinación no invaden las células epidermales del haz. El apresorio, de poca longitud (menor a 20 µm), puede penetrar a través de la apertura estomática, directamente en las células epidermales, pero el mayor porcentaje de penetración ocurre en la epidermis de las células de guarda (52%). Bajo estas condiciones controladas, luego de nueve horas el 60% de las conidias germinadas lograba la penetración. GOULD (1963) señala que las primeras lesiones aparecen luego de 10 horas después de ocurrida la penetración si las condiciones favorables están presentes en forma continua. 2.7.4.2. Infección VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN (2004) señalan que la patogenicidad y especialización de Botrytis elliptica para infectar plantas de lilium se demuestra por el mecanismo denominado muerte celular programada. Una de las etapas es la inducción de la fragmentación de ADN, proceso específico en la infección de B. elliptica, el cual no ocurre durante el ataque de B. cinerea. Sin embargo, el área de infección provocada permite a B. cinerea infectar y colonizar a la planta. El contenido celular es ocupado como fuente nutritiva por el patógeno para continuar su avance 21 por los tejidos. Otra diferencia sustancial es que B. elliptica afecta principalmente tejido sano, mientras que B. cinerea afecta tejido dañado o muerto. Esta enfermedad presenta un período muy breve de incubación, expandiéndose rápidamente sobre hojas jóvenes o pétalos, debido a que estos órganos presentan tejidos más débiles y suculentos. Destaca su carácter necrotrófico debido al rápido avance y abundante esporulación sobre los tejidos muertos cuando tiene condiciones ambientales favorables como las de un invernadero (ALVAREZ, CABRERA y SOSA DE CASTRO, 2005). 2.7.4.3. Diseminación La diseminación ocurre principalmente cuando, en condiciones favorables, los esclerocios o el micelio producido en tejidos muertos producen conidias que son transportadas por el viento, y por salpicaduras de agua hacia el follaje que se encuentra en desarrollo durante la primavera ( HUANG et al., 2001). 2.7.4.4. Sobrevivencia El patógeno perdura como saprófito en los residuos vegetales enfermos. (VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS,1997) Según GOULD (1963) sobrevive durante el invierno a través de los esclerocios. En algunas ocasiones se ha demostrado que puede pudrir los bulbos, lo que significaría otra forma de supervivencia, pero el autor señala que rara vez ocurre esto en la naturaleza. 22 2.7.4.5. Fuente de inóculo VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS (1997) mencionan que los esclerocios formados en los tallos muertos de lilium luego de la cosecha juegan un rol importante en la epidemiología. Ellos determinaron que los esclerocios que permanecen latentes en el verano corresponden al inóculo primario para la infección de la próxima temporada. 2.7.5. Resistencia a fungicidas. El uso intensivo de fungicidas para el control de esta enfermedad ha provocado la aparición de cepas resistentes. HSIANG y CHASTAGNER (1991) aislaron cepas resistentes a Dicarboximidas y Benzimidazoles. Las primeras crecen más lento en medio de cultivo, sus conidias son más largas y el doble de ancho que las conidias normales. Los autores determinan que esta característica le confiere una capacidad de sobrevivir más tiempo y ser más infectiva. Las cepas resistentes a Benzimidazoles producen menos conidias y los esclerocios son de mayor tamaño y más numerosos que los de las cepas sensibles. 2.7.6. Efecto de los factores ambientales 2.7.6.1. Temperatura de crecimiento La temperatura óptima de crecimiento es de 15 °C (GOULD, 1963). Este autor señala además que a dicha temperatura y humedad relativa alta la enfermedad se repite en ciclos en pocos días durante todo el período de crecimiento del cultivo, produciendo esclerocios en las partes enfermas. HSIANG y CHASTAGNER (1991) demostraron experimentalmente que B. elliptica crece más lento que B. cinerea en medio de cultivo a 20°C. 23 2.7.6.2. Temperatura de esporulación. En laboratorio se ha demostrado que un rango de 5-20°C, acompañada de una humedad relativa mayor al 90% produce la esporulación a partir de micelio. Las temperaturas óptimas para la producción de conidias son aquellas menores a 10°C ( HUANG et al., 2001). 2.7.6.3. Temperatura de germinación e infección La germinación de las conidias sobre el tejido ocurre a una temperatura óptima de 15°C, pero una vez que el hongo ha ingresado a la planta se desarrolla mejor a 21° C (GOULD, 1963). DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984) demostraron que la infección es más rápida a 20° C que a 25° C, manteniendo las hojas con una película de agua por 48 horas. 2.7.6.4. Humedad Además de la amplitud térmica, la humedad relativa del ambiente es muy importante para el desarrollo de la enfermedad. La humedad ambiente elevada (mayor al 90%) presente en los invernaderos es un factor decisivo para los ataques de este hongo, favoreciendo la germinación de las conidias ( VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997).En condiciones de baja humedad ambiental la lesión se seca y el patógeno deja de extenderse. En cambio, bajo condiciones húmedas las lesiones se unen y afectan toda la hoja, la cual se cubre de micelio grisáceo y acaba pudriéndose, afectando luego a toda la planta. (GRIGALIUNAITÉ, 2001). Una humedad relativa mayor al 90% permite la esporulación del esclerocio (VAN DEN ENDE y PENNOCK-VOS, 1997). 24 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Ubicación del muestreo: El muestreo se realizó en un predio perteneciente a una empresa dedicada a la producción y exportación de flores, ubicado en la comuna de Olmué, V región. Se analizaron plantas con una misma fecha de plantación hasta la cosecha, de las variedades asiáticas: All Round, Black Out, Tresor y Valdisole, entre los meses de abril y julio de 2005, y luego un segundo período desde la segunda semana de julio hasta septiembre de 2005 con las variedades asiáticas: Algarve, Black Out, Madrid, Navona, Umbría, Menorca, Gironde y Wiener Blut. El cultivo se encontraba bajo invernadero frío en mesas de 36 m de largo y 1,2 m de ancho en las cuales existían 60 bulbos por metro cuadrado, correspondiente a un calibre 12-14 cm. En la zona de muestreo existían 42.000 plantas en 21 mesas del sector analizado durante del primer período. En el sector del segundo período existían 58.500 en 30 mesas aproximadamente ( Anexo 1). Las labores realizadas corresponden al manejo propio de este cultivo a escala comercial. Un detalle de la aplicación de fungicidas se describe en el Anexo 2. 3.2. Metodología de muestreo: Las muestras fueron obtenidas semanalmente mediante un muestreo sistemático con arranque aleatorio del 0,2%. El número de la primera planta fue elegido al azar, a la cual se le sumó 500 en la misma mesa para obtener el número de la segunda planta a muestrear y así sucesivamente. Para ello se utilizaron planillas en las cuales se 25 registró la incidencia anotando la presencia o ausencia del síntoma o signo del agente causal Botrytis sp. (Anexo 3). Las muestras de hojas con lesiones eran recolectadas y colocadas en bolsas plásticas con cierre hermético para su traslado al laboratorio. 3.3. Determinación de la incidencia de Botrytis. Esta se realizó mediante la observación de síntomas presentes en la superficie de la hoja. Para corroborar la presencia del agente causal se realizaron cámaras húmedas. A partir de esta información se calculó la incidencia de Botrytis de acuerdo a la siguiente fórmula: Incidencia de Botrytis ( %) = N° de plantas con síntomas de Botrytis en hojas X 100 N° total de plantas muestreadas. La incidencia fue calculada por variedad, para el caso de B. cinerea y B. elliptica. Además, para esta última especie se calculó la incidencia sin considerar la variedad, para observar la tendencia general de la enfermedad durante el período de estudio. 3.3.1. Correlación entre la incidencia de Botrytis y factores ambientales. Para lograr correlacionar la incidencia de Botrytis con la temperatura y humedad relativa en los sectores analizados, se dispusieron sensores calibrados para registrar estos datos cada una hora. Una vez finalizado el muestreo, los datos fueron obtenidos mediante el programa computacional Termocron. Las temperaturas máximas, mínimas y humedad relativa diarias fueron utilizadas para obtener las medias semanales. Estos datos se correlacionaron con la incidencia de Botrytis mediante gráficos y el posterior análisis de los mismos. 26 3.4. Estimación del índice de daño: Para calcular el índice de daño causado por ambas especies de Botrytis, este se calculó mediante la siguiente fórmula: Índice de daño: ID = ∑ (nv )100 VN donde: n : n° de plantas por nivel de la escala v : nivel de la escala ( grado de ataque) N : n° total de plantas observadas. V : Rango máximo de la escala El grado de ataque varió de 0 a 3, utilizándose la siguiente escala de evaluación: 0 = Ausencia de síntomas (lesión café circular o elíptica) 1 = 1-2 lesiones presentes en la hoja. 2 = 3-6 lesiones presentes en la hoja. 3 = 7 o más lesiones. Para corroborar la presencia del agente causal, algunas hojas con síntomas colectadas en el predio se colocaban siete días en cámaras húmedas, las que fueron confeccionadas con envases de plástico en cuya tapa se registró la fecha de recolección y la variedad muestreada. La bandeja era previamente desinfectada con alcohol y luego se le cubría interiormente con papel absorbente estéril (toalla Nova) humedecida con agua estéril. En cada una se colocaba una hoja. Estas bandejas fueron colocadas a temperatura ambiente. Una vez obtenido el crecimiento de micelio y la presencia de estructuras reproductivas, se pasaba a la etapa de aislamiento. 27 3.5. Pruebas de patogenicidad: El desarrollo de esta parte del taller se realizó en el laboratorio e invernadero climatizado de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicado en el sector de La Palma, comuna de Quillota, V región. Para ambas especies se realizaron los postulados de Koch por no tener referencias a nivel nacional de la presencia de estos patógenos infectando plantas de lilium. 3.5.1. Aislamiento Una vez obtenidas las muestras con sintomatología en el campo se procedió a aislar en el medio nutritivo agar papa dextrosa acidulado (APDA) con el fin de obtener aislados, purificarlos y describir las características que presentaban los hongos así obtenidos. De las muestras a aislar se extrajeron trozos mediante bisturí, de 0,5 a 1 cm2 de la zona de avance de las lesiones. Los trozos de tejido enfermo fueron sumergidos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 15 segundos para eliminar poblaciones de bacterias y otros saprófitos, luego fueron lavados en agua estéril, dejándolos secar en papel absorbente cerca de un mechero dentro de una cámara de flujo laminar. Posteriormente eran colocados cuatro trozos en forma equidistante en el medio anteriormente descrito. Para las hojas colocadas en cámara húmeda, al observar conidias se pasaba superficialmente un asa, con la cual se realizaba un estriado en placas con el mismo medio. 28 Los aislados se incubaron a 23 ºC en cámara de crecimiento hasta observar el crecimiento del micelio. Los patógenos obtenidos se purificaron a partir de repiques de trozos de hifas desde el margen de las colonias. Una vez crecidas las colonias purificadas se describieron sus características y se conservaron en tubos de ensayo con agua estéril a 5°C. Dos placas por cepa fueron puestas bajo luz cercana a UV (luz negra) para estimular la producción de conidias. 3.5.2. Recuperación de aislados. A partir de los aislados 786, 787 y 911 guardados durante el año 2003, clasificados como Sclerotinia sp. por presentar micelio blanco, esclerocios pequeños de forma elíptica y no producir esporas, se comenzó a investigar la posibilidad de producir apotecio en laboratorio, utilizando la metodología propuesta por GUTIERREZ y SHEW (1995) con el fin de corrobar la presencia de este patógeno y obtener ascosporas para su posterior inoculación en las plantas. Los aislados fueron recuperados de tubos de ensayos guardados a 5°C, luego cultivados en placas con medio de cultivo (APDA) y colocados en cámara de crecimiento a 25°C. Posteriormente fueron retirados para colocarlos a temperatura ambiente hasta observar la presencia de esclerocios. Una vez obtenidos, se dispusieron en frascos con arena esterilizada y humedecida con agua estéril. Se incubaron a 4°C durante un mes. Posteriormente fueron transferidos a una cámara de crecimiento a 12°C. Los esclerocios puestos bajo estas condiciones, dieron origen a micelio y producción de conidias, descartando la presencia de Sclerotinia sp., siendo reclasificados estos aislados como pertenecientes a la especie Botrytis elliptica. 29 3.5.3. Inoculación en plantas de lilium. Luego de aislados los patógenos, se procedió a inocular plantas sanas que fueron cultivadas en bolsas plásticas, a partir de bulbos previamente desinfectados, de las variedades Algarve, Wiener Blut, Gironde y Navona. El sustrato utilizado también fue previamente desinfectado. El control ambiental fue dado por la utilización de aire forzado obteniendo condiciones de temperatura entre 15 y 20°C. La humedad relativa igual o superior al 90%, fue conseguida mediante aspersión de agua sobre las hojas, los pasillos y las paredes. Se inocularon seis cepas elegidas al azar, tres correspondientes a la especie B. cinerea (1010,1014 y 1016) y tres a la especie B. elliptica ( 786,787 y 911). Cada inóculo fue preparado mediante el raspado de cinco placas por cepa, el que fue depositado en 600 ml de agua estéril. Luego se agitó por cinco minutos y se agrego una gota de Tween 20 para disminuir la tensión superficial del agua. El inóculo se concentró a 1 x 106 conidias o propágulo (fragmentos de micelio)/ ml. Las plantas fueron inoculadas al azar. El ensayo se llevó a cabo con 84 plantas en total, 21 plantas por variedad. Por cada variedad de lilium se inocularon tres plantas por cepa, dejándose tres plantas como testigo. Los patógenos fueron inoculados mediante un asperjador manual, rociando las plantas con una suspensión de conidias para el caso de las cepas de B. cinerea, y de fragmentos de micelio para el caso de las cepas de B. elliptica (debido a su dificultad para esporular in vitro). Los testigos fueron rociados con agua estéril. Luego de la inoculación, las plantas fueron cubiertas con una bolsa plástica de polietileno transparente, cerrando con elástico a la maceta para evitar el contagio entre 30 tratamientos y lograr un efecto de cámara húmeda. Estas se mantuvieron por 48 horas para ser posteriormente retiradas. Las plantas fueron observadas en forma periódica, con el fin de monitorear la aparición de síntomas, realizando una evaluación final de las plantas luego de tres semanas de inoculadas. La evaluación se realizó usando una escala de índice de daño distinta a la usada en el muestreo, ya que se observó mayor daño debido a que las condiciones eran favorables y la enfermedad se manifestó con mayor expresión de síntomas (Anexo 4). 3.5.3.1. Análisis estadístico. El análisis estadístico de los datos proporcionados por los resultados de las inoculaciones, se llevo a cabo a través de un análisis de varianza multifactorial usando un diseño completamente al azar (DCA). Para comparar entre tratamientos se realizó el test de Duncan para el nivel de significancia del 5 %. 3.5.4. Reaislamiento. Se debe reaislar el hongo de las plantas inoculadas siguiendo el mismo procedimiento del aislamiento anterior, para corroborar la presencia de las especies de Botrytis y su correspondiente identificación. 3.5.5. Identificación de cepas de Botrytis obtenidas: Para identificar las especies de Botrytis aisladas a partir de síntomas, se observó el color de la colonia, el tamaño de las conidias, conidióforo y esclerocios y se comparó con literatura. 31 Por cada cepa se midió a través de microscopio óptico ( 40 X) el largo y ancho de 50 conidias y 10 conidióforos. Estos resultados se promediaron y se obtuvo el tamaño por especie. En el caso de los esclerocios, fueron medidos 20 por cepa. 32 4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1. Incidencia de Botrytis cinerea por variedad: La presencia de Botrytis cinerea en las plantas se manifestó en forma de lesiones necróticas circulares, de un color café oscuro a negro, encontrándose algunas con el característico micelio grisáceo. Al analizar la Figura 1, se observa que la presencia de la enfermedad ocurre en forma puntual durante el período comprendido desde abril a julio, sin presentar algún tipo de tendencia. Las variedades All Round y Tresor son las primeras en presentar la patología durante la última semana del mes de abril. La humedad relativa media es de un 85%, condición desfavorable para provocar infección (LATORRE y RIOJA, 2002, GOULD, 1963). Es probable que el patógeno hubiera entrado por heridas sufridas durante la emergencia de la planta, y que la humedad del tejido facilite su germinación y posterior penetración. Luego de un mes sin presencia de la enfermedad, aparece en la variedad Valdisole, verificándose un aumento en las temperaturas máximas, aptas para la germinación y el desarrollo del micelio. A su vez las temperaturas mínimas media descendieron, favoreciendo la esporulación del micelio, manifestándose el patógeno durante la semana siguiente en las variedades All Round y Black Out, registrándose condiciones óptimas para el crecimiento del micelio como para la germinación de las conidias. % Valdisole % Black Out % All Round % Tresor T°Mín. media sem. T°Máx. media sem. % H.R. media sem. 30 90 25 80 70 º C ( Tº ) 20 60 15 50 40 10 30 20 5 10 0 0 4° 5º ABRIL 1° 2° 3° 4° 5º MAYO 1° 2° 3° JUNIO 4º 1° JULIO Semanas FIGURA 1. Incidencia de Botrytis cinerea en plantas de lilium durante abril a julio de 2005. Olmué, V región. % ( H.R.), % ( Incidencia) 100 Nuevamente ocurre un período sin incidencia, a pesar de presentar condiciones de temperatura aptas para esporulación. El factor determinante es la humedad relativa,que no logra superar el 90%. Esta es controlada en el predio mediante extractores de aire y la apertura de cortinas a través de un sistema que permite regular la altura de las mismas permitiendo una ventilación adecuada en cada momento. La primera semana de julio y la última correspondiente al muestreo efectuado, se observa presencia en Valdisole y Black Out. La humedad relativa alcanza el máximo valor del período (93%), lo que puede provocar condensaciones encima de la superficie foliar estimulando la germinación de conidias (LATORRE y RIOJA, 2002). Además, algunas flores antes de cosecha presentaron antesis y liberaron polen al ambiente, el que según SALINAS et al. (1989) puede ser usado por B. cinerea como fuente nutritiva inicial. El patógeno, al ser de naturaleza polífaga y actuar además como saprófito, puede provenir de múltiples focos. El predio se encuentra inserto en una zona de intensa producción agrícola, donde los desechos de los cultivos no son manejados correctamente para evitar la diseminación. Sin embargo el intensivo uso de fungicidas permite un control eficiente de esta enfermedad, evidenciándose en su nula incidencia durante el segundo período de muestreo. La presencia de B. cinerea es muy particular durante el desarrollo del cultivo. Es probable que la penetración ocurriera a través del daño provocado por el roce de las mallas de soporte y al pasar entre las mesas durante las labores propias del cultivo. La infección en las variedades se observa en períodos diversos, al inicio con plantas pequeñas y susceptibles a daño (All Round y Tresor), en un período intermedio entre vegetativo y aparición de primeras flores (Valdisole, All Round y Black Out) y cercano al período de cosecha antes de antesis (Tresor, Black Out y Valdisole). 36 4.2. Índice de intensidad de daño de B. cinerea: El grado de ataque provocado por B. cinerea en hojas de lilium, fue de una a dos lesiones por hoja. Si se analizan los índices, se encuentran en un nivel bajo alcanzando el máximo valor de 3,3% en la variedad Black Out. El detalle de los índices se encuentra el Anexo 5. Al analizar en forma conjunta la incidencia y el índice de daño, es posible inferir que la enfermedad provocada por este patógeno no fue un problema significativo durante el período estudiado. 4.3. Incidencia de Botrytis elliptica en el cultivo: Durante el primer período observado no se detectó su presencia en el cultivo. Las condiciones de humedad relativa mayor al 95% favorables para la germinación de las conidias sólo se presentan al final del período (Figura 1). Además las temperaturas máximas no descendieron de los 20 °C, lo cual sí ocurrió durante el segundo período de evaluación. De acuerdo a los síntomas observados en terreno y al posterior análisis efectuado en laboratorio, este patógeno comenzó su desarrollo entre la segunda y tercera semana de julio, pasando de un 0% de incidencia hasta alcanzar el valor máximo de 45% (Figura 2). Al observar los datos de humedad y temperatura mínima, se desprende que existió una condición predisponente durante esa semana para la germinación de conidias sobre las hojas y su posterior infección, observando períodos del día superiores al 95% de humedad relativa, con temperaturas mínimas que fluctuaron entre 3° y 8°C, con una mínima media de 5°C. INCIDENCIA (%) Tº Mín. media sem. Tº Máx. media sem. H.R. media sem. 100 30 80 70 ºC ( Tº) 20 60 50 15 40 10 30 20 5 % ( H.R ), % (Incidencia) 90 25 10 0 0 2° 3° JULIO 4° 1° 2° 3° 4° AGOSTO 1° 2° 3° 4° 5º SEPTIEMBRE Semanas FIGURA 2. Incidencia de Botrytis elliptica en cultivo de lilium bajo invernadero, Olmué, julio a septiembre de 20 La variación de las condiciones entre la semana anterior y en la cual se observó la lesión es muy notoria, visualizándose claramente un descenso en la temperatura. Al analizar detenidamente estos datos, se deduce que debió haber condensación sobre las superficies de las hojas. Estas condiciones contribuyeron a formar una película de agua que junto a temperaturas que bordean los 15° favorecen la germinación de conidias (GOULD, 1963). Las temperaturas máximas mayores al 20 °C durante algunas horas del día, favorecieron el posterior desarrollo de la enfermedad ya que el patógeno una vez ingresado a la planta crece mejor a 21°C (GOULD, 1963). Las probables fuentes de infección pueden ser esclerocios originados durante la temporada anterior, que permanecen en el suelo de los alrededores, en los pasillos o en potreros cercanos. Además, algunos restos del cultivo eran depositado en quebradas cercanas, y al encontrar condiciones adversas el micelio produce este tipo de estructuras de resistencia. Las bajas temperaturas y la alta humedad relativa invernal dada por las lluvias (mayor al 90%) fuera de los invernaderos, permiten suponer que los esclerocios encontraron las condiciones para esporular, y estas conidias lograron ser diseminadas por el viento (VAN DEN ENDE y PENNOCK– VOS, 1997). La diseminación de las conidias dentro el invernadero es probable que se produzca a través del movimiento de aire que ocurre al levantar las cortinas para bajar la humedad relativa ( HUANG et al., 2001). Al igual que B. cinerea, las conidias tienen una fuente nutritiva al contar con polen proveniente de los cultivos anteriores que se encuentran en período de cosecha. A pesar de que la vara se cosecha en botón cerrado, algunas flores abren antes de 39 tiempo, liberan el polen que se dispersa por el viento y se deposita en la superficie de las hojas de plantas cercanas. En forma general, se observa un descenso paulatino durante el período comprendido entre julio y septiembre, debido probablemente a la aplicación semanal y rotación de tratamientos químicos que frenan el desarrollo del hongo. Sin embargo, a medida que se desarrolla el cultivo presenta una mayor área foliar que impide el ingreso de productos a zonas más bajas. Durante las primeras semanas de agosto se observa un descenso de un 10% de incidencia respecto al mes anterior, dado probablemente por un aumento de las temperaturas mínimas que impidieron la formación de películas de agua permanentes para la germinación de conidias. Se registró un leve aumento de la incidencia durante la tercera semana, condición dada por un aumento de las temperaturas mínimas medias de las semanas anteriores, observándose además un aumento de la humedad con respecto a las dos primeras semanas, pasando de un 88 a un 91% promedio semanal, lo que favorece la germinación de conidias que no alcanzaron a germinar en julio o probablemente a un nuevo ciclo de infección dado por la formación de conidióforos sobre las lesiones anteriores (GOULD, 1963). En el mes de septiembre, durante la primera semana se mantiene la tendencia de agosto a pesar de que la temperatura máxima descendió considerablemente y la humedad relativa media alcanzó su máximo valor (94%). En las últimas semanas se distingue un aumento progresivo de la temperatura y un descenso de la humedad, coincidiendo con las mínimas incidencias. Estas condiciones son muy distintas a las que dieron origen a la infección. Cabe destacar que no se encontró síntomas en flores o tallos, solamente en hojas principalmente en la mitad superior de la planta. 40 4.4. Índice de intensidad de daño de B.elliptica: En forma general, la intensidad de daño de B. elliptica, al igual que su incidencia, va disminuyendo durante el período. Analizando los datos (Anexo 6), es posible inferir que la enfermedad no afectó a la planta en forma agresiva, alcanzando en forma general una a dos lesiones presentes en la hoja, encontrándose en forma puntual el índice 2 (tres a seis lesiones por hoja) al inicio del período, momento en el cual se encontraban las condiciones ambientales favorables para su desarrollo. No se encontraron plantas con más de siete lesiones y que comprometieran el estado general de la planta, y como se señaló anteriormente, debido al fuerte uso de pesticidas para frenar las enfermedades y lograr una mejor calidad de la vara. 4.5. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad: De acuerdo a la Figura 3, las variedades más afectadas corresponden a Algarve, Wiener Blut, Menorca, Madrid y Umbría. Cabe destacar que estas variedades presentan un ancho de hoja mayor que las otras variedades, lo que permite captar una mayor cantidad de inóculo, además de dificultar la ventilación, originando condiciones favorables para la presencia de agua libre sobre su superficie. La tendencia presentada en las variedades Navona y Gironde es notoriamente diferente. Existe una menor incidencia al comienzo de la infección, la que se mantiene constante hasta la ausencia de síntomas al final del período. Es preciso señalar que sus hojas son de forma alargada y con inclinación de los ápices hacia el suelo, lo que dificulta la permanencia de gotas de agua necesarias para la germinación de las conidias (GOULD,1963). Esto además favorece una ventilación más adecuada en zonas bajas. NAVONA W. BLUT Tº Mín. media sem. UMBRIA MADRID Tº Máx. media sem. GIRONDE ALGARVE H.R. media sem. MENORCA B. OUT 100 30 25 80 70 ºC ( Tº) 20 60 15 50 40 10 30 % ( H.R ), % (Incidencia) 90 20 5 10 0 0 2° 3° JULIO 4° 1° 2° 3° 4° AGOSTO 1° 2° 3° 4° 5º SEPTIEMBRE Semanas FIGURA 3. Incidencia de Botrytis elliptica por variedad en cultivo de lilium. Julio a septiembre 2005. Olmué, V región A diferencia de Algarve y Umbría, y usando la misma densidad de plantación es posible divisar el suelo desde la parte superior ya que las variedades anteriormente mencionadas formaban una barrera que dificultaba el paso del aire, y mantenía el suelo húmedo luego de los riegos. Black Out, única variedad cultivada en ambos períodos de muestreo, no presentó síntomas asociados a este tipo de enfermedades. 4.6. Índice de intensidad de daño por variedad: Las variedades Algarve, Menorca y Wiener Blut presentan su mayor índice de daño (Figura 4) en el momento en que ocurre la mayor incidencia del período (tercera semana de julio). Estas tres variedades alcanzan hasta seis lesiones por hoja, disminuyendo considerablemente el área fotosintética. La tendencia observada es una disminución de este índice a medida que se aproxima la cosecha. El mayor índice lo presenta Wiener Blut alcanzando el 35,4 %. Al igual como se mencionó en la incidencia, estas variedades presentan una mayor superficie por hoja y una gran cantidad de follaje que favorece al patógeno para encontrar una película de agua para germinar y provocar infección. En el caso de la variedades Madrid, Navona Umbría y Gironde, el índice varía durante el período o se mantiene constante, no presentando una tendencia general. En estas variedades el grado de ataque alcanzó una a dos lesiones por hoja. NAVONA W. BLUT Tº Mín. media sem. UMBRIA MADRID Tº Máx. media sem. GIRONDE ALGARVE % H.R. Media sem. MENORCA B. OUT 100 30 25 80 70 ºC ( Tº) 20 60 50 15 40 10 30 20 5 % ( H.R ), % (Indice de daño) 90 10 0 0 2° 3° JULIO 4° 1° 2° 3° 4° 1° 2° AGOSTO 3° 4° 5º SEPTIEMBRE Semanas FIGURA 4. Índice de daño de Botrytis elliptica por variedad durante el cultivo de lilium. Julio a Septiembre 2005. Olmué, V región. 4.7. Identificación de cepas obtenidas: Los aislados anteriores (786,787 y 911) y los encontrados en el predio de Olmué, fueron identificados a través de características proporcionada por literatura, poniendo énfasis a las estructuras reproductivas como tamaño de conidias, tamaño del conidióforo, tamaño de los esclerocios. Además se estudiaron las características de la colonia y sintomatología observada en terreno como la realizada en las pruebas de patogenicidad. La examinación microscópica de las características morfológicas y la observación visual de las colonias crecidas en medio de cultivo, permitieron corrobar que las cepas aisladas durante el primer período de muestreo corresponden a la especie Botrytis cinerea (Anexo 7). Las características de la lesión provocada en la hoja, las características de la colonia y de los esclerocios permitieron identificar como Botrytis elliptica a las cepas aisladas durante el segundo período (Anexo 7). Estas cepas no lograron esporular dada su dificultad de producir conidias in vitro, incluso sometiéndolas a los mismos tratamientos de luz UV-A de B. cinerea. Las cepas 786, 787 y 911 lograron producir conodióforos y conidias luego de colocar hojas con lesiones, obtenidas de las pruebas de patogenicidad, en cámaras húmedas. 4.7.1. Color de la colonia Las colonias de B. cinerea cultivadas en medio APDA presentaron un micelio blanquecino que luego de colocarlas en luz negra (UV-A, 320 nm) se tornó grisáceo y café grisáceo (Figura 5c). Esta característica concuerda por lo descrito por la descripción n° 431 del CMI (1974). Por su parte, las colonias de B. elliptica tiene 45 aspecto algodonoso, con micelio denso creciendo sobre la superficie del agar, de color blanco sin cambio aparente luego del tratamiento de luz (Figura 5d). Éstas no presentaron color grisáceo como lo observado por CABRERA, ALVAREZ y SOSA (2005). Es probable que la falta de coloración sea debido a que no desarrolló estructuras reproductivas en las placas, debido a su dificultad para esporular bajo condiciones de laboratorio, según lo observado por DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984). 4.7.2. Características de estructuras reproductivas Las conidias de B. cinerea se observaron lisas, de forma oval. Miden en promedio 10,05 µm de largo y 6,27 µm de ancho. Los conidióforos de 10 cepas fueron medidos al microscopio óptico, encontrando un promedio de 1.422 µm largo y de 11,6 µm de ancho. Los conidióforos se presentan en forma libre y ramificados. (Figura 5a). Las dimensiones de ambas estructuras se encuentran dentro de los rangos presentados por la descripción n° 431 del CMI (1974). Las conidias de B. elliptica se observaron de forma elipsoide a ovoide, de dimensiones 23,7 µm de largo promedio y de 16,5 µm de ancho promedio. Los conidióforos de Botrytis elliptica presentan 955 µm de largo y 86 µm de ancho. Estos se encuentran poco ramificados en los extremos (Figura 5b). Estas características concuerdan con la información presentada por DOSS, CHASTAGNER y RILEY (1984), para describir esta especie. 46 FIGURA 5. a) Conidióforo y conidias de Botrytis cinerea. Barra = 20 µm. b) Conidióforo y conidias de Botrytis elliptica. Barra = 20 µm. c)Colonia correspondiente a Botrytis cinerea, luego de 6 días puesta bajo luz negra. d) Colonia de Botrytis elliptica, expuesta a la misma condición. 47 4.7.3. Características del esclerocio. Los esclerocios de B. cinerea son de color negro, de forma y tamaño irregular, miden de 3 a 5 mm de diámetro, promediando 3,85 mm. Estas dimensiones concuerdan con las observadas por HSIANG y CHASTAGNER (1992). Se les encuentra aglomerados o creciendo en forma individual. Los esclerocios de B. elliptica son de forma redondeada y elíptica, de color negro, en su mayoría creciendo en forma individual, de 1 a 2 mm de diámetro. El promedio es de 1,49 mm. Las dimensiones también concuerdan con lo observado por HSIANG y CHASTAGNER ( 1992). 4.8. Pruebas de patogenicidad: 4.8.1. Síntomas observados Luego de dos días, las plantas inoculadas con B. elliptica comenzaron a mostrar síntomas en el envés de la hoja, con presencia de manchas de un color café oxidado a naranjo, y de forma alargada (Figura 6c). Posteriormente en el haz, se colocó traslúcida la zona afectada. Este síntoma también fue observado por VAN BAARLEN, STAATS y VAN KAN, 2004. Esa lesión evolucionó hasta colocarse de color café oxidado, alcanzando entre 1 a 2 cm de largo y 0.5 cm de ancho. Sin embargo, algunas hojas mantuvieron la mancha traslúcida y en otras quedó un orificio en el lugar de la infección. El síntoma característico de la lesión necrótica, se observa primero en la variedad Algarve, la cual presenta lesiones de forma alargada en las hojas superiores, que luego de seis días comenzaron a expandirse. Estos mismos síntomas se observaron en las variedades Gironde, Wiener blut y Navona luego de 10 días. 48 FIGURA 6. a) Lilium infectado por Botrytis elliptica durante el segundo período. b) Lesiones necróticas presentadas en var. Algarve en las pruebas de patogenicidad. c) Síntoma inicial de B. elliptica observado en el envés. d) Manchas necróticas puntiformes asociadas a B.cinerea en hojas de lilium artificialmente inoculadas. 49 A los 20 días de inoculación, dos plantas de la variedad Algarve inoculadas con las cepas 786 y 911 presentaron marchitez total de la planta, con hojas y tallos secos donde se aprecian en forma muy nítida de un color más oscuro el lugar de las lesiones iniciales y los anillos concéntricos. Las demás variedades presentan sólo algunas hojas con lesiones que al extenderse se unían, provocando marchites y posterior desecamiento ( Figura 6b). En las plantas inoculadas con B. cinerea, se observaron lesiones muy puntuales, de un color café oscuro de no más de un cm, no extendidas y en menor número que las generadas por B. elliptica. Un síntoma muy distintivo fue observado en el envés de la hoja, la cual presentaba puntuaciones superficiales de color negro, que luego de aislarlas en APDA confirmaron la presencia de este patógeno (Figura 6d). Gironde y Navona además de presentar las lesiones características, manifestaron en las hojas inferiores estrías amarillas continuas a la lesión, observadas anteriormente por DOSS, CHASTAGNER y RILEY(1988). 4.8.2. Evaluación de la enfermedad. Luego de 20 días se evaluaron las plantas. Los datos obtenidos fueron sometidos al análisis estadístico correspondiente para demostrar la capacidad patogénica de ambos tipos de Botrytis. Al ser reaisladas las cepas de ambas especies de Botrytis desde las plantas inoculadas, éstas mantuvieron las mismas características de los aislados originales. Mediante esta comparación se cumplen los postulados de KOCH, con lo cual se logró aislar e identificar las especies Botrytis elliptica (cepa 786,787 y 911) y Botrytis cinerea (cepa 1010,1014 y 1016) como causantes de enfermedad en lilium cultivados en invernaderos de la zona de Olmué. 50 Todas las plantas inoculadas con B. elliptica originaron síntomas de lesión expansiva y necrótica, en mayor o menor grado, por lo cual se reconoce como hongo capaz de provocar enfermedad en cultivares asiáticos de Lilium sp. Las cepas de B. cinerea, a diferencia de B. elliptica, no lograron ser patogénicas para todas las plantas, lo que sumado a la baja incidencia en el muestreo realizado (Figura 1), se reconoce como un patógeno poco agresivo, pero capaz de provocar enfermedad. Las plantas testigos permanecieron sanas durante el ensayo. Según el análisis de varianza existe interacción entre la cepa de Botrytis y la variedad en el desarrollo de la enfermedad. Si se compara el efecto de ambas patógenos, se distingue claramente un mayor daño de B. elliptica por sobre B. cinerea (Figura 7). Según los resultados de las pruebas de patogenicidad, Wiener blut no presentó diferencias significativas de acuerdo a la cepa de B.elliptica. inoculada. La variedad Algarve se vio más afectada que Navona, independiente de la cepa utilizada. Las otras variedades tuvieron diferentes efectos dependiendo de la cepa. Es importante mencionar que no se tienen antecedentes a nivel bibliográfico de la susceptibilidad o tolerancia a B. elliptica. de las variedades empleadas. 7 a a ab 6 abc abcd 5 Escala de bcd cd cd 4 fg 3 fgh gh 2 hhhh hh h h h ef fg GIRONDE fgh h h h ALGARVE NAVONA W.BLUT h 1 0 Test 1016 1014 1010 911 787 786 Tratamientos FIGURA 7. Ìndice de daño observado en estadísticamente significativas, las pruebas de patogenicidad. Letras distintas indican diferencias al 5%, según Duncan. 5. CONCLUSIONES De acuerdo a las pruebas de patogenicidad efectuadas, se demuestra que Botrytis cinerea y Botrytis elliptica son patógenos capaces de generar enfermedad en lilium cultivados en invernaderos, aunque los aislados correspondientes a la especie Botrytis elliptica son los que provocan un mayor daño. Conforme al estudio epidemiológico realizado, la incidencia de Botrytis elliptica se inició en el mes de julio, desarrollándose la enfermedad hasta septiembre, en cultivos bajo invernadero frío ubicados en Olmué, V región. La incidencia máxima alcanzada fue de un 45%, la que ocurrió en el mes de julio, asociadas a temperaturas máximas inferiores a los 20°C y humedades relativas superiores al 90%.La especie Botrytis cinerea aparece en forma dispersa durante el período comprendido entre abril y julio, con un nivel de de incidencia máxima de un 10%. 53 6. RESUMEN Durante el año 2003, se observaron lesiones necróticas en hojas de lilium cultivados bajo invernadero frío en la zona de Olmué, V región. En la presente investigación, los aislados producidos y conservados en ese período fueron recuperados para determinar su patogenicidad.. Al mismo tiempo se realizaron dos muestreos entre abril y septiembre en la misma zona para determinar la incidencia e índice de daño provocada por el patógeno. Esto se relacionó con la temperatura y humedad relativa presente en el invernadero. La identificación de los aislados obtenidos se realizó comparando las características con literatura. Esto permitió corroborar la presencia de Botrytis cinerea y Botrytis elliptica. Botrytis cinerea se detectó sólo durante el primer muestreo (abril-julio), en forma puntual y sin presentar algún tipo de tendencia. De los resultados de la incidencia e índice de daño, se demuestra que Botrytis cinerea no afecta significativamente al cultivo. Por el contrario, Botrytis elliptica, no se presentó en el primer muestreo, apareciendo en el mes de julio. La incidencia y el índice de daño disminuyen a medida que transcurre el muestreo, debido a que varían las condiciones de temperatura y humedad relativa. Para realizar las pruebas de patogenicidad, se eligieron los aislados 1010,1014 y 1016 correspondientes a Botrytis cinerea, y 786,787 y 911 correspondientes a Botrytis elliptica, los cuales fueron inoculados en las variedades Algarve, Wiener Blut, Gironde y Navona cultivadas bajo condiciones ambientales controladas. Escasas plantas mostraron sintomatología asociada a Botrytis cinerea. Todas las variedades presentaron, en distintos grados, lesiones asociadas a Botrytis elliptica. De acuerdo al análisis efectuado, se concluye que ambos patógenos son capaces de generar enfermedad en plantas de lilium cultivados en invernadero, pero la especie Botrytis elliptica es la que provoca un mayor daño al cultivo. 54 7. ABSTRACT During the year 2003, necrotic lesions were observed on lily (lilium sp.) leaves, from plants cultivated an unheated greenhouse, in Olmué, 5th Region, Chile. In this study, isolates that were collected and stored were then re-introduced to determine their pathogenicity. In the same area, between April and September, two samplings were done to determine the incidence and damage levels provoked by the pathogens. These were than related to the temperature and relative humidity conditions of the greenhouse. The identification of the isolates was done by comparing their characteristics with previous descriptions from the literature, thus permitting to confirmation of the presence of Botrytis cinerea and Botrytis elliptica. Botrytis cinerea was detected only in the first sampling (April-July), and did not show a pattern. The results of the incidence and damage index show that Botrytis cinerea did not significantly affect the lilies. On the other hand Botrytis elliptica was not present in the first sampling; it appeared in the month of July. The incidence and damage index diminished over the sampling time, due to the variability of temperature and relative humidity conditions. The Botrytis cinerea isolates 1010,1014 and 1016, and Botrytis elliptica 786, 787, and 911, were chosen for inoculating the lily varieties Algarve, Wiener Blut, Gironde and Navona cultivated under controlled environmental conditions. Few plants showed the symptomatology associated with Botrytis cinerea. All of the varieties had, in varying degrees, lesions associated with Botrytis elliptica. As a result of these analyses, it was concluded that both pathogens are capable of producing disease in greenhouses- grown lilies, but the Botrytis elliptica species provokes greater damage in this crop. 55 8. LITERATURA CITADA AGRIOS, G. 1996. Fitopatología. 2a. ed. México, D. F., Limusa. 838p. ALEXOPOULOS, C. 1966. Introducción a la micología. 2a. ed. 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N° de plantas All Round 6400 Black Out 4400 Tresor 12400 Valdisole 18800 Total 42000 Variedades del segundo período N° de plantas Algarve 12500 Madrid 6000 Wiener Blut 8000 Menorca 6500 Navona 3000 Umbria 12000 Gironde 8500 Black Out 2000 Total 58500 63 ANEXO 2 Fungicidas aplicados durante el primer muestreo.( abril-julio) 3 de mayo Sumisclex 6 de mayo Switch 27 de mayo Sumisclex 10 de junio Vangard 15 de junio Aliette 23 de junio Bemex Fungicidas aplicados durante el segundo muestreo ( julio-septiembre) 9 de julio Actara 14 de julio Switch 19 de julio Vangard 27 de julio Sumisclex 5 de agosto Switch 13 de agosto Vangard 22 de agosto Aliette 5 de septiembre Sumisclex 16 de septiembre Bemex 64 ANEXO 3 Fecha: Variedad: N° de plantas: Nº de planta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Incidencia Índice de daño 65 ANEXO 4 Escala para determinar índice de daño en plantas inoculadas bajo condiciones controladas. Índice Daño por planta 1 0 lesión 2 1-5 lesiones 3 6-10 lesiones 4 11-15 lesiones 5 16-20 lesiones 6 > 21 lesiones 66 ANEXO 5 Índice de daño (%) por variedad causado por Botrytis cinerea, durante el período abril-julio 2005. Valdisole Black Out All Round Tresor 19/4 0 0 0 0 26/4 0 0 2.2 1.3 8/5 0 0 0 0 10/5 0 0 0 0 17/5 0 0 0 0 24/5 0 0 0 0 31/5 2.6 0 0 0 7/6 0 3.3 2.2 0 14/6 0 0 0 0 21/6 0 0 0 0 28/6 0 0 0 1.3 5/7 0.8 3.3 0 0 67 ANEXO 6. Índice de daño general (%) provocado por B.elliptica, durante el período julioseptiembre. Fecha Índice de daño(%) 12/7 0 19/7 17.62 26/7 11.08 2/8 11.39 9/8 10.82 16/8 11.96 23/8 12.53 30/8 10.53 6/9 9.21 13/9 8.34 20/9 8.15 27/9 4.21 68 ANEXO 7 Cepas correspondientes a Botrytis cinerea y Botrytis elliptica encontradas entre abril y septiembre de 2005. Cepa (Aislado) Especie 998 Botrytis cinerea 1005 Botrytis cinerea 1010 Botrytis cinerea 1011 Botrytis cinerea 1012 Botrytis cinerea 1013 Botrytis cinerea 1014 Botrytis cinerea 1015 Botrytis cinerea 1016 Botrytis cinerea 1017 Botrytis cinerea 1018 Botrytis cinerea 1031 Botrytis elliptica 1032 Botrytis elliptica 1033 Botrytis elliptica 1034 Botrytis elliptica 1035 Botrytis elliptica 1036 Botrytis elliptica 1037 Botrytis elliptica 1038 Botrytis elliptica 1039 Botrytis elliptica