Download Extracto de Tomillo - Pontificia Universidad Javeriana

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE
TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum
MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA D.C.
Diciembre 12 de 2007
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NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique
nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no
contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en
ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE
TOMILLO (Thymus vulgaris) CONTRA
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum
MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------------Dr JAIRO CUERVO A.
DIRECTOR
-----------------------------------------------ING. AGRÓNOMO OMAR GUTIÉRREZ
JURADO
------------------------------------------------MARIA XIMENA RODRIGUEZ Ph. D
ASESOR
---------------------------------------------MARCO HELI FRANCO MSc.
JURADO
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO DE
TOMILLO (Thymus vulgaris) contra
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum
MARIA CAROLINA LIZCANO GONZALEZ
APROBADO
--------------------------------------------------------------Dra. ANGELA UMAÑA
Decana Académica
Facultad de Ciencias
----------------------------------------------------------------Dra. JANETH ARIAS
Directora de Carrera
Microbiología Agrícola y Veterinaria
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DEDICATORIA
A Dios que siempre ha estado presente en mi vida.
A los que ya no están y siempre me acompañan.
A mis padres.
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AGRADECIMIENTOS
A mis padres Edgar y Ligia que siempre estuvieron presentes en este largo
camino y que me mostraron las cosas importantes de la vida.
A mis hermanitos Andrés, Camilo y Laura por su buena energía y compañía.
A Alejandrito que en los momentos difíciles siempre estuvo dándome ánimo y
haciendo parte de los felices.
A todas aquellas personas que siempre confiaron en mí, Sonia y Gabriel.
Al Doctor Jairo Leonardo Cuervo por su apoyo y paciencia para la realización de
este trabajo.
A Maria Ximena Rodríguez por su comprensión, colaboración y tiempo.
A Carolina Parra por su amistad, apoyo, ayuda incondicional y desinteresada.
A todas las personas que hacen parten, de una o de otra manera del Laboratorio
de Biología del Suelo de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional
de Colombia.
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TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO
1.
2.
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.5.1
2.5.1.1
2.5.1.2
2.5.1.3
2.5.1.4
2.5.1.5
2.5.2
2.5.2.1
2.5.2.2
2.5.2.3
2.5.2.4
2.5.2.5
2.5.3
2.5.3.1
2.5.3.2
2.5.3.3
2.5.3.4
2.5.3.5
2.6
2.6.1
3.
3.1
3.2
4.
4.1
4.2
5.
5.1
5.1.1
5.1.1.1
5.1.2
5.1.2.1
6.1.2
6.
6.1
6.1.1
6.2
6.2.1
INTRODUCCIÓN
MARCO TEÓRICO
Fungicidas Biológicos
Generalidades del Cultivo de Tomillo (Thymus vulgaris)
Generalidades del Cultivo de Albahaca (Ocimun basilicum
Control contra Hongos Fitopatógenos en Plantas Aromáticas
Hongos Fitopatógenos de Plantas Aromáticas
Generalidades de Botrytis cinerea
Descripción básica
Huéspedes y Especialización
Enfermedad
Epidemiología
Control
Generalidades de Fusarium oxysporum
Descripción básica
Especialización de huéspedes
Síntomas de enfermedad
Ciclo de enfermedad
Epidemiología y control
Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum
Descripción básica
Huéspedes
Enfermedad
Epidemiología
Control
Extracción de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
Métodos de extracción
FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Formulación del Problema
Justificación
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño de la investigación
Obtención del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
Obtención del Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
Pruebas In Vitro
Técnica de Crecimiento Radial
Prueba de Invernadero
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Prueba In Vitro
Técnica de Crecimiento Radial
Prueba de Invernadero
Función Curativa
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13
13
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18
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23
23
23
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24
24
24
24
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25
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27
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28
28
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31
35
35
35
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37
37
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38
38
38
39
39
40
43
43
43
51
52
8
6.2.2
7.
8.
9.
10.
Función Preventiva
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
REFERENCIAS
ANEXOS
53
55
56
57
64
9
RESUMEN
Los extractos vegetales forman una parte muy importante en la agroecología, ya
que estos benefician al medio ambiente, combatiendo organismos fitopatógenos,
sin recurrir a agentes químicos.
El objetivo principal de este estudio es el de evaluar la actividad antifúngica del
extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis
cinerea,
Fusarium
oxysporum
y
Sclerotinia
sclerotiorum
causantes
de
enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum), haciendo que cultivos enteros
se pierdan debido a la baja calidad y a la muerte total de las plantas.
El estudio se desarrollo en los laboratorios y en los invernaderos de la Facultad
de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia. En esta investigación,
se evaluó el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) a concentraciones de 150,
250 y 500g/L con dos tiempos de tratamiento térmico (15 y 30 min). Las pruebas
realizadas fueron In vitro; se obtuvo un medio de cultivo con los extractos y se
evaluó la tasa de crecimiento radial de los hongos, El tratamiento de 500 g/L y
30 minutos fue el que obtuvo mejores resultados, se le adicionó a plantas de
albahaca inoculadas con Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia
sclerotiorum.
En la prueba de Invernadero se evaluó la actividad del el extracto de Tomillo
(Thymus vulgaris) en forma preventiva y curativa o de control de la enfermedad,
se estimó el porcentaje de incidencia y severidad. Después de ser evaluados los
resultados se obtuvo que el extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) puede
disminuir el crecimiento de Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia
sclerotiorum. Y al adicionarse sobre las plantas inoculadas se redujo la expresión
de los síntomas de las enfermedades.
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ABSTRACT
The vegetal extracts makes a very important role in the Agro-ecology, they
benefit to the environment and to the entire ecosystem around, fighting Infectious
diseases in plants caused by Phyto-pathogens organisms, without using any
kind chemical agents.
The intention of this analysis is to estimate the fungicide action of the Thyme
(Thymus vulgaris) extract in the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum, this fungus are able to cause
diseases in the Basil (Ocimum basilicum), which can cause serious damage in
this herb, resulting in loss of yield and thus profit.
The entire investigation was developed in the greenhouses and laboratories of
the Department of Agronomy of the Universidad Nacional de Colombia.
In this investigation was evaluate the Thyme (Thymus vulgaris) extract in
concentrations of 150, 250 y 500g/L in different times of boiling (15 and 30
minutes). The related examinations were made In vitro; using this extracts, there
was obtained a Growth medium, at the same time, the radial grown rate of the
fungus was evaluated, later, the treatment with better results was added to the
sick Basil (Ocimum basilicum),
previously inoculated with Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum.
During the tests was seen the reactions and activities of the Thyme (Thymus
vulgaris) extract, in a preventive, curative, control and healthy way for the Basil
(Ocimum basilicum); the percentage of incidence and severity was measured.
After a large and punctual examination of the results, we can conclude that the
Thyme (Thymus vulgaris) extract can change the growth of the Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum and Sclerotinia sclerotiorum in the Basil (Ocimum
basilicum) for good, giving better results in a preventive way than a curative way.
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1. INTRODUCCIÓN
La agricultura ecológica, orgánica o biológica enmarca todos los sistemas
agrícolas que promueven la producción sana y segura de fibras y alimentos,
desde el punto de vista ambiental, social y económico. Está basada en un
sistema de producción sostenible, en el cual no se hace uso de fertilizantes,
herbicidas o pesticidas químicos, u otras sustancias toxicas que pueden llegar a
causar algún daño a la salud humana, animal y al medio ambiente. Dicho de otra
forma, la agricultura ecológica trabaja bajo el concepto de producción sostenible
y competitividad, sin deterioro de los recursos naturales, con un fin muy claro, el
crecimiento económico y del mejoramiento de la calidad de vida de la población.
La agricultura ecológica aboga por una producción más limpia, libre de
sustancias perjudiciales tanto para las personas como para el medio ambiente,
y puede en algunos casos representar una mejora en la ganancia del
productor.
En la actualidad se han ido desarrollando diferentes formas de contribuir a la
conservación del medio ambiente en el área agrícola con productos biológicos,
estos productos evitan o excluyen insumos externos de síntesis químicas que
empobrecen el suelo contrarrestando la acción de las poblaciones
de
organismos benéficos, disminuyendo los nutrientes para las plantas y
contaminando fuentes de agua.
El Manejo Integrado de Plagas es un método para combatir poblaciones no
deseadas siendo responsable con el medio ambiente. Existen productos
biológicos que pueden llegar a ser muy efectivos para el control de plagas. Se
conocen sustancias extraídas de plantas que tiene un efecto antifúngico contra
la población dañina y sin contaminación del recurso suelo y agua.
La Albahaca (Ocimum basilicum) es una de las plantas aromáticas más cultivada
y comercializada debido a su importancia medicinal y culinaria. Esta a su vez
sufre ataques de hongos fitopatógenos, los más representativos son Botrytis
cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum que llevan a veces a
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perdidas hasta de un 100% de la producción de este cultivo por su agresividad al
atacar.
Teniendo conocimiento de la problemática del cultivo de la Albahaca (Ocimum
basilicum) se utilizó un antifúngico natural, extracto acuoso de Tomillo (Thymus
vulgaris) que es una planta reconocida por sus propiedades terapéuticas y
cuyas partes aéreas ya han sido estudiadas comprobándose la existencia de
sustancias en ella con actividad antifúngica.
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2. MARCO TEORICO
2.1 FUNGICIDAS BIOLÓGICOS
Los Hongos constituyen el grupo más importante entre los agentes causales de
tipo infectivo que provocan enfermedades de las plantas. El número exacto de
hongos fitopatógenos se desconoce, pero se estiman en un número superior a
las diez mil especies, pertenecientes a diversas categorías taxonómicas
(Asocolflores, 1995).
El uso de Productos Naturales es tan antiguo como la humanidad. Los productos
naturales son de naturaleza muy variada, desde sustancias biológicamente
activas de origen marino, exudados de raíz y los más explorados, aquellos
provenientes
de
plantas.
La
química
orgánica
estudia
la
estructura,
transformación y efectos biológicos de los metabolitos secundarios presentes en
diferentes organismos. Debido a sus propiedades y principios activos se están
aplicando en medicina moderna, cosmetología, farmacéutica, biotecnología y
últimamente con contribución muy prometedora en la agricultura ecológica
(Fonnegra y Jiménez 2006).
En la naturaleza existen de 250.000 a 500.000 especies vegetales, de las cuales
se estima que al menos el 10% han sido estudiados en sus aspectos químicos y
propiedades biológicas. Como se mencionó anteriormente, esta temática no es
nueva, se había dejado en el olvido por un largo periodo de tiempo y
recientemente, el interés ha sido renovado valorando la diversidad de estructuras
químicas en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos (Piñol, 2001).
Los productos de origen vegetal han sido, en las últimas dos décadas,
mayormente estudiados en su parte química, con énfasis en los metabolitos
secundarios, los cuales están implicados en el control biológico contra patógenos
o plagas, y en ciertos casos, activando procesos de defensa en la planta,
brindando una protección preventiva (Kagale et al. 2004).
Los metabolitos secundarios, son sustancias de bajo peso molecular, no son
comunes en todas las plantas y por el contrario, pueden ser una expresión de la
individualidad química de un organismo. Los productos del proceso fundamental
de la fotosíntesis proporcionan los intermediarios biosínteticos necesarios para
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dar lugar a la formación de los metabolitos secundarios, haciéndose evidente la
interconexión entre productos del metabolismo primario con el secundario (Gil,
2002).
Los compuestos fenólicos sencillos (hidroxibenzoicos o hidroxicinámicos), son
metabolitos secundarios comunes en las plantas con propiedades fungicidas.
Las cumarinas clasificadas como antifúngicas y antibacteriana. Los conjugados
de fenilpropanoides con aminas, se incorporan a la pared celular vegetal para
aumentar su rigidez e impedir la entrada de los patógenos. En cuanto a las
fitoalexinas, estas son sintetizadas por las plantas, después de la infección y en
actividad inhibitoria de microorganismos patógenos, se han identificado un grupo
importante, por ejemplo, la pisatina, la cual es un flavonoide sintetizado por el
guisante, Pisum sativum, como reacción a la infección por hongos, siendo esta la
primera fitoalexina aislada y caracterizada (Gil, 2002).
Por otro lado, aquellas que hacen parte de la respuesta hipersensible, como es
el caso de algunos compuestos pertenecientes a los grupos de los alcaloides,
los terpenoides y los fenilpropanoides, participan activamente eliminando
directamente al microorganismo patógeno y/o restringiendo su invasión al resto
de la planta. Al mismo tiempo, otros metabolitos secundarios contribuyen a
destruir las especies reactivas de oxígeno que son tóxicas para la misma célula
vegetal, las cuales se sintetizan durante las etapas tempranas de la respuesta
de defensa. Es así, como algunos metabolitos secundarios constituyen una parte
importante de la respuesta de la defensa de las plantas sometidas al ataque por
patógenos (Sepúlveda et al. 2003).
Existen varios reportes en la literatura en donde registran plantas con actividad
fungicida, como es el caso de Allium sativum, la cual contiene como compuesto
activo aliína un aminoácido sulfurado; el aceite esencial de hojas de orégano
mexicano (Lipp iagraveolens), presenta fenoles timol y carvacol que son los
principales componentes que le confieren poder antibacteriano y antifúngico
(Kagale et al. 2004).
(Cymbopogon
citratus),
El aceite esencial obtenido desde hojas de limón
que
es
rico
en
citral,
myrceno,
dipenteno,
methylheptenona, ciertos alcoholes, y ácidos volátiles, presento actividad
antifúngica, contra Mycosphaerella fijiensis en bioensayos realizados in vitro
(Obledo et al. 2004).
15
En Colombia evaluaron el efecto biofungicida de Momordica charantia, Awinglea
glutinosa, Salvia officinalis, Carica papaya, Azadirachta indica y Jatropha sp.
Utilizando como adherente natural el aceite de Ricinus comunis, los autores
encontraron que hubo respuesta de sensibilidad del hongo a los tratamientos, sin
embargo el químico presentó los mejores resultados en todas las variables
(Marín et al. 2006).
En el caso del patosistema pepino-Podosphera xanthii, causante del mildeo
polvoso, al ser tratado con un inductor exógeno, proveniente de las hojas de
malsana (Reynoutria sachalinensis), se observó rápidamente la síntesis de una
fitoalexina, C-glycosdsil conocida como cucumarina, la cual se acumula en el
sitio de penetración del hongo, jugando un papel importante en el bloqueo,
colonización y supervivencia del patógeno. Se reporto la lignificación de la pared
celular y el aumento en actividad de las enzimas quitinasas, peroxidasas y β-1,3
glucanasas (Fofana et al. 2005).
Los efectos fungicidas in vitro de los Aceites esenciales de plantas aromáticas
contra Fusarium sp ha sido determinados por la capacidad inhibitoria en el
crecimiento del fitopatógeno con estos productos (Fernández y Vega 1990).
Los extractos provenientes del cedro blanco (Hiba arborvitae) inhiben la
germinación de esporas de Botrytis cinerea (Hernández y Bautista 2007); y el
crecimiento
micelial
Sclerotinia
sclerotiorum
aplicados
a
diferentes
concentraciones (Zapata et al. 2003).
2.2 GENERALIDADES DEL CULTIVO DE TOMILLO (Thymus vulgaris)
El tomillo (Thymus vulgaris) pertenece de la familia Lamiaceae. Es una planta
aromática, vivaz, leñosa, muy polimorfa, de 10 a 40 cm de altura, con numerosas
ramas leñosas, erectas, compactas, parduzcas o blanco-aterciopeladas. Las
hojas de 3 a 8 mm son lineares, oblongas, sentadas o brevemente pediceladas,
opuestas, tomentosas, sin cilios, con el pecíolo o sus márgenes revueltos hacia
abajo y blanquecinas por su envés. Las flores son axilares y agrupadas en la
extremidad de las ramas, formando una especie de capitulo Terminal, a veces,
con inflorescencia interrumpida; las brácteas son verde grisácea; el cáliz, algo
giboso, con pelos duros, con tres dientes en el labio superior, cortos, casi iguales
y dos en el inferior, muy agudos, mas largos , con pelos es sus bordes y de color
16
rojizo; la corola, un poco mas larga que el cáliz, con el labio superior erguido y el
inferior trilobulado y de color blanquecino o rosado; los cuatro estambres
sobresalen de la corola. El fruto es un tetraquenio, lampiño, de color marrón (Gil,
2002).
Es una especie muy variable, tanto en su fenología como en la composición
química de su aceite, en la que ya se han detectado siete quimotipos. Debido a
esto ha dado lugar a confusiones taxonómicas en este género, en el que se han
considerado como especies distintas, a sus variedades o ecotipos (Fonnegra y
Jiménez 2006).
Su hábitat son países de cuenca mediterránea occidental, sobre suelos secos y
soleados. Es abundante en el este, centro y sur de la península y en Baleares.
Crece sobre suelos calizos, arcillosos y menos frecuentes en silicios. La latitud
es de 0 a 1.800 m. El clima más favorable para su cultivo es templado, templadocalido y de montaña. Resiste bien a las heladas y sequías, pero no el
encharcamiento ni exceso de humedad ambiente. Aunque prefiere los suelos
ricos y calcáreos, se adapta a los arcillosos, ligeros y silicios. Prefiere la
exposición a medio día. Su reproducción puede hacerse por semillas o
vegetativamente, por división de pies o por esquejes (Latorre,1999).
Las enfermedades que puede atacar el cultivo, se destaca sobre la parte aérea,
a veces, un amarillamiento de hojas, de algunas ramas, de la parte superior,
debido a un ataque de nematodos fitófagos, a nivel de las raíces. Una invasión
generalizada conduce a la desaparición de la totalidad de los pies atacados. El
responsable principal es Meloidogyne hapla. La única lucha posible
es la
desinfección de suelos y mediante la multiplicación vegetativa, recurrir a los pies
sanos. No se debe implantar el cultivo de tomillo en parcelas donde se ha
detectado presencia de nematodos. La defoliación y el amarilleo confirmado
después de la floración, son fenómenos naturales, que no deben confundirse
con enfermedades (Gutierrez, 1996)
La composición química de las ramas contiene flavonoides, derivados del
apigenol y del luteolol; ácidos fenolitos, caféico, rosmarínico, clorogénico; ácidos
triterpénicos, ursólico y oleanoico; saponinas; contiene también elementos
minerales. El aceite esencial contiene carvacrol y timol (aunque las plantas
17
españolas, apenas contienen timol) en porcentaje del 20 al 70%, según las
razas; también contiene p-cimeno, terpinenos, linalol, borneol y sus esteres
acéticos, cíñelo, geraniol, cariofileno. En Francia se han encontrado hasta la
fecha, siete quimiotipos diferentes de Thymus vulgaris (Fonnegra y Jiménez
2006).
La mayoría del aceite comercial de tomillo es extraído de Thymus zygis. Los
principales componentes del aceite de tomillo son mostrados en la TABLA Nº 1.
Los aceites ricos en timol son producidos en grandes cantidades y son valorados
por su aroma. Se observan las variaciones en la composición del aceite debido a
diferentes quimiotipos reconocidos. Se reportan rendimientos de aceite entre 0.5
– 1.5%.
TABLA Nº 1 .Contenido (%) de algunos de los principales componentes de
diferentes quimiotipos de Thymus zygis.
QUIMIOTIPO
QUIMIOTIPO
QUIMIOTIPO
QUIMOL
CARVACROL
LINALOL
Y - terpineno
9.9
11.9
0.2
P – cimeno
18.9
20.8
1.5
Linalol
3.2
4.1
79.0
Timol
49.8
0.8
0.9
Carvacrol
2.0
43.9
1.1
COMPUESTO
Fuente: Proyecto Hierbas Aromáticas. UNAL
2.3 Generalidades del Cultivo de Albahaca (Ocimum basilicum).
La albahaca (Ocimum basilicum) es una planta herbáceas, anual, de tallos
erectos y ramificados, que alcanza de 30 a 50 cm de altura. Las hojas de 2 a 5
cm son opuestas, pecioladas, aovadas, lanceoladas y ligeramente dentadas. Las
flores son blancas o ligeramente purpúreas, dispuestas en espigas alargadas,
axilares, en la parte superior del tallo o en los extremos de las ramas. El fruto
esta formado por cuatro aquenios pequeños lisos (Latorre, 1999).
18
Es originaria Persia y Asia menor, se ha extendido su cultivo por las regiones
templadas, sobre todo los países de la cuenca mediterránea.
Su multiplicación puede ser por semilla o por siembra directa durante 15 días a
una temperatura de 20 a 25ºC (Jarvis, 1981).
En plena floración de la planta cuando se estima a obtener su aceite se recolecta
se corta a unos 15cm del suelo con el fin de preservar las yemas basales de los
tallos. La albahaca produce aceite esencial, de color amarillo rico en linalol, metil
chavicol y eugenol, con rendimientos aproximados de 0.6%(en peso fresco) y 1.2
% (en peso seco) (Espitia, 2004).
2.4 Control contra hongos fitopatógenos en plantas aromáticas
El método tradicional para el control de hongos en plantas aromáticas, ha sido
las prácticas culturales, dirigida a reducir la fuente de inóculo del patógeno y
forma parte de un programa de manejo integrado de la enfermedad. En este
sentido, el establecimiento de un buen sistema de drenaje, la remoción de las
hojas viejas en el suelo junto con la poda sanitaria, se han utilizado durante años
como estrategias para reducir la densidad del inóculo, sin dejar de lado, un
adecuado programa de fertilización. Se ha propuesto el establecimiento de altas
densidades de siembra, con el fin de generar un micro y mesoclima al interior de
la plantación, creando condiciones desfavorables para el patógeno (Rosales et
al. 2002).
El método de control químico, es el más ampliamente utilizado, se establece
dentro de un programa normal de rotación entre fungicidas, sistémicos y
protectantes, a lo largo del ciclo del cultivo. De acuerdo a Marín y Romero
(1998), los fungicidas para el control de esta enfermedad se pueden agrupar en
tres categorías, con base en su modo de acción: fungicidas de contacto o
protectantes, de acción sistémica local y fungicidas sistémicos. En cuanto a los
fungicidas protestantes, estos son utilizados de forma alternada con fungicidas
sistémicos, estos últimos, son aplicados con aceites o emulsiones como
adherente (Romero, 2006).
En la búsqueda de nuevas alternativas para el control de enfermedades de
platas aromáticas, se tienen algunas aproximaciones en el control biológico,
19
tendiente a reducir el inóculo de la enfermedad, utilizando microorganismos, que
en buena medida actuarían como antagonistas o en competencia contra los
hongos fitopatógenos (Patiño et al. 2006; Gutiérrez, 1996). A pesar de los
avances, el empleo de estos microorganismos y el como hacerlos eficientes para
uso masivo, esta aún poco desarrollado, máxime que una de las limitantes en su
aplicación es la efectividad disminuida causada por el efecto negativo de
factores ambientales, los cuales pueden alterar la supervivencia, actividad y vida
útil de estos en la superficie de la hoja.
La importancia de los metabolitos secundarios en control, se ve claramente en
los trabajos con extractos de plantas, en donde se han evidenciado como
potentes productos antifúngicos, antibacterianos, estimuladores del desarrollo
fisiológico de la planta o activando los mecanismo de defensa contra plagas y
enfermedades (Kagale, 2004).
2.5 Hongos fitopatógenos de plantas Aromáticas
En Estragón (Artemisa dracunculus) la principal enfermedad es la roya del
estragón, Puccinia dracunculina, que hace su aparición en los meses donde hay
elevadas temperaturas y la es humedad imperante (Gómez, 2004).
En la Albahaca sólo dos enfermedades de origen biótico de importancia han sido
descritas para esta especie, ambas causadas por patógenos que representan un
amplio rango de hospederos afectando otros cultivos (Goto, 1990).
El Tizón, este es
ocasionado por el hongo Botrytis cinerea, constituye el
principal problema patológico que afecta la parte aérea de las plantas de este
cultivo. Su presencia se manifiesta inicialmente como manchas foliares marrón,
que al crecer pueden comprometer toda la hoja. Es común observar la aparición
de moho gris sobre el tejido afectado, lo que facilita el diagnóstico. El desarrollo
del agente causal de esta enfermedad se ve favorecido, como ya se ha
señalado, por condiciones de alta humedad y agua libre sobre el follaje, siendo
particularmente susceptible el tejido senescente. De aquí que sea importante
favorecer la aireación dentro del cultivo para evitar que el agua se acumule en
hojas por periodos prolongados. Otras medidas culturales también indicadas
20
para esta enfermedad en otros cultivos son válidas para albahaca. Así es
importante la eliminación de hojas o cualquier tejido muerto o senescente y evitar
exceso de fertilización nitrogenada (Gil, 2002).
Pudriciones radicales y de corona, causadas por hongos de los géneros Pythium
spp., Rhizoctonia spp. Phytophthora spp. y Fusarium sp., los que producen
necrosis y podredumbre del sistema radical y corona, asociado a clorosis y
marchites de las plantas. Las raíces pierden su color blanco característico,
adquiriendo una coloración marrón. La principal vía de llegada de estos
patógenos al cultivo es a través de sustrato, bandejas, agua, solución nutritiva,
tanques y cañerías contaminados. De aquí, que una medida de control
fundamental la constituya el asegurar la limpieza de todas estas posibles fuentes
de inóculo del hongo. De igual manera se debe evitar la contaminación con suelo
de todos los componentes del sistema o recipientes que se vayan a utilizar
(Gómez, 2004).
En la Menta a existencia de enfermedades afecta el estado sanitario de los
cultivos y por lo tanto reducen la producción de materia verde y aceite esencial.
La enfermedad de mayor importancia en la Argentina para las mentas es la roya
(Puccinia menthae Pers) que, ataca a hojas y tallo, se caracteriza por la
aparición de pústulas amarillas que luego oscurece a tonos marrones (Goto,
1990).
Cuando el ataque es muy intenso puede provocar la caída de las hojas. El
control de esta enfermedad es difícil, en general se recomienda adelantar la
cosecha cuando se prevé un ataque severo (Latorre, 1999).
El marchitamiento es, una enfermedad producida por el hongo (Verticillum sp),
que se caracteriza porque las hojas se toman amarillas, la planta crece con
dificultad y termina por morir en poco tiempo, especialmente si el clima es seco
(Goto, 1990).
La antracnosis es causada por el hongo Sphaceloma mendiak, se caracteriza
por la aparición de manchas, grises con bordes marrón-rojizos en las hojas
21
jóvenes, que pueden extenderse a, los brotes, provocando la caída de las
primeras y la muertes de los segundos (Gutiérrez, 1996).
En Orégano (Pelcthranthus amboinicus), el ataque del tizón foliar (Alternaria
alternata) que si bien no se manifiesta severamente, es la enfermedad que
reviste mayor importancia, ya que causa el deterioro del producto. Se manifiesta
desde, el ápice hacia la base de la planta en forma de manchas foliares que se
localizan principalmente en las hojas superiores. En ataques severos se produce
la muerte de la planta. La predisponen la sucesión de días lluviosos, elevada
humedad y temperatura (Gil, 2002).
Dentro de la enfermedades fúngicas se nombra Phythophthora cryptogea que
produce necrosis a nivel del cuello de la raíz se caracteriza por un importante
deterioro de las plantas, ramas secas y las hojas presentan manchas amarillas,
marrones y negras, este hongo , se presenta en primavera en especial en suelos
húmedos y compactados (Gómez, 2004).
El orégano puede ser atacado por una podredumbre debido al desarrollo de
Botrytis cinerea y por Puccinia rubsaameni. Para el caso de la mejorana se
menciona a su vez el ataque de Puccinia menthae, así como Septoria origanicola
var. Mejorana ambas afectan al sistema fotosintético de las plantas (Gómez,
2004).
Una de las más importantes enfermedades del orégano es debida a
Colletotrichum spp causante de necrosis foliares que deprecian la calidad de la
producción en verde. Los síntomas que se observan primero son unas pequeñas
manchas pardas sobre las hojas y los tallos. Al extenderse progresivamente por
la lámina foliar, las áreas necróticas coalescentes producen
el total
marchitamiento de las hojas, que caen finalmente. Dos han sido las especies de
Colletotrichum aisladas del orégano: Colletotrichum dematium y Colletotrichum
gloeosporioides, ambos fueron aislados y cultivados en PDA (Patata-DextrosaAgar) dando dos tipos diferentes de colonias (Latorre, 1999).
De igual forma se ha descrito un hongo perteneciente a la familia de la
Pythiaceas, Phythophthora cryptogea, presente igualmente sobre romero, tomillo
22
y salvia, que provoca unas necrosis a nivel del cuello y de las raíces. El
marchitamiento del pie de las plantas afectadas se caracteriza por la presencia
de ramas secas y de hojas con manchas amarillas, pardas y negras. El hongo
está presente en los suelos húmedos y compactos, propensos a los
encharcamientos (Gutiérrez, 1996).
También se ha podido observar sobre cultivos de orégano un oidio causado por
Erysiphe galeopsidis el cual provoca unas manchas blancas sobre los tallos y las
hojas de las plantas enfermas (Gómez, 2004).
Otros agentes causantes de enfermedades de origen fúngico en el orégano son
Botrytis cinerea y una roya, Puccinia rubsaameni. Ambos parasitan al orégano y
le causan podredumbres (Goto, 1990).
El Damping-off en Salvia (Pluchea odorata) causado por Pythium debaryanum y
Pellicularia filamentosa. En los semilleros, donde las plantas están bastante
apiñadas y bajo muchas condiciones algunos de los plantones muertos pueden
ser la consecuencia de la acción de alguno de estos hongos. El control que se
puede realizar hoy por hoy es difícil pero se recomienda la solarización de los
suelos como prevención (Apablaza, 1999).
Manchas en las hojas es causado por Cercospora salviicola y Ramularia
salviicola. Arrancar y destruir las primeras hojas manchadas frecuentemente es
utilizado como método de control preventivo (Gamboa, 1998).
Muchas especies de royas atacan principalmente a especies silvestres de Salvia.
Algunas de las más comunes son Puccinia caulicola, P. farinacea, y P. salviicola.
Raramente se aplican métodos de control (Apablaza, 1999).
2.5.1 Generalidades de Botrytis cinerea
2.5.1.1 Descripción básica
Botrytinia se diferencia de Sclerotinia por tener una medula esclorotial más
compacta, gelatinizada y un anamorfo en Botrytis. El telemorfo puede
encontrarse en el campo, aun que predomina el anamorfo Botrytis cinerea. Los
esclerocios varían de forma y tamaño, pero normalmente son al menos de 3 mm
23
de diámetro; para que se produzcan apotecios se necesita un periodo de
almacenamiento en frío; los tallos de los apotecios llegan a 3 cm de longitud y a
1-2 mm de grueso; los discos son cóncavos , pardo amarillentos y de hasta 8mm
de diámetro. Las ascas son cilíndricas, las ascosporas elipsoidales a fusiformes,
y uninucleadas. Los conidióforos son mas o menos rectos, ramificados, pardos,
pero mas pálidos cerca del ápice; las ramas terminales producen conidias lisas,
unicelulares, obobales o elipsoidales, hialinas a pardo claro o, en masa, pardo
grisáceo (Elad y Volpin, 1999).
2.5.1.2 Hospedero y especialización
Es un parasito inespecífico que ataca un amplio numero de especies vegetales
(hortícola, ornamentales, cultivos extensivos, frutales) especialmente anuales;
también ataca a plántulas de árboles forestales. Puede comportarse como
patógeno y como saprofito. Aunque entre los aislados existen variaciones
notables de morfología cultural y de agresividad, no se ha encontrado
especialización respecto al huésped (Smith 2002).
2.5.1.3 Enfermedad
Produce una podredumbre blanda (podredumbre gris), marchitez súbita o
lesiones pardas. El hongo infecta a las plantas casi exclusivamente a partir de
tejidos colonizados muertos o senescentes o a través de heridas; puede causar
muerte de plántulas en pre y post emergencia (ornamentales, hortícolas, árboles
forestales); en tallos y pecíolos aparecen lesiones pardas que se extienden
lentamente por los tejidos del tallo. Sobre las hojas se desarrollan lesiones
pardas, a veces hidrópicas, que se extienden con rapidez, especialmente en
condiciones húmedas (Avila, 1993).
2.5.1.4 Epidemiología
El hongo sobrevive principalmente sobre restos vegetales infectados; aunque
ciertos aislados producen esclerocios in Vitro, no se conoce bien su papel en
vivo; puede infectar a la semilla. La principal fuente del inóculo son conidias
dispersadas por viento y lluvia (salpicaduras); las alternancia de humedad
relativa elevadas y bajas parecen favorecer la liberación de las conidias; también
puede dispersarse por el viento y la lluvia y constituyen la base de un inóculo
24
saprofitito importante que se adhiere a las superficies mojadas de las plantas
(Bayona, 1996).
2.5.1.5 Control
Los problemas de resistencia a fungicidas y en este caso, la falta de
especificidad del huésped, la enfermedad puede extenderse fácilmente de un
cultivo a otro (Doss, 1995).
2.5.2 Generalidades de Fusarium oxysporum
2.5.2.1 Descripción básica
Esta especie, la mas importante del género Fusarium, en PDA las colonias tiene
un aspecto variable que depende de la cepa; en general el micelio aéreo ye el
medio cambia de color a distintos tonos desde violeta a morado oscuro; si
abundan los esporodoquios las colonias puede aparecer crema o naranja. Las
microconidias, siempre presentes, son oval-elipsoides, mono o bicelulares, y se
forman en fialidas cortas no ramificadas, nunca en cadena, pero agrupadas en
falsos capítulos. Las macroconidias, normalmente 3-5 septadas, son fusoides,
ligeramente curvadas y a menudo tienen una célula basal pedicelada; se forman
al principio en fialidas individuales, luego en esporodoquios. Las clamidosporas
son solitarias o están en cadenas cortas (Agrios, 1998).
2.5.2.2 Especialización de hospedero
F. oxysporum es predominantemente un saprofito abundante y activo del suelo y
de materia orgánica. Además algunas cepas tienen una actividad patogénica
específica, pero constituyen una porción muy pequeña de la población total del
suelo aunque causan enfermedades importantes en los cultivos. Algunas están
poco especializadas y causan muerte de plántulas, necrosis o podredumbres; sin
embargo las formas responsables de las marchitez vasculares son las más
importantes. Causan perdidas en plantas pertenecientes a todas las familias
importantes de angiospermas (a excepción de las Gramineae) en regiones
templadas o tropicales (Smith 2002).
25
2.5.2.3 Síntomas de la enfermedad
Los síntomas de la marchitez fusárica varían según el huésped, el patotipo y las
condiciones de infección; en general las hojas mas viejas muestran al principio
un aclarado vascular leve, clorosis de la lamina o marchitez, y estos síntomas
progresan posteriormente a las hojas jóvenes, a menudo iniciándose
unilateralmente en algunas en correspondencia con una infección localizada en
parte del sistema vascular de raíz y tallo; las partes afectadas de la planta
empardecen. En el tallo aparecen estrías longitudinales necróticas que se
extienden hacia el ápice; los síntomas internos pueden verse a simple vista en
secciones de raíz, tallo y pecíolo. El empardecimiento comienza en el tejido
vascular y se extiende al córtex en las fases tardías de la infección. La marchitez
se desarrolla con especial rapidez en la floración o fructificación. En los cultivos
aparecen en focos que se extienden gradualmente, causando la muerte
prematura de las plantas afectadas. Debido a la consecuencia respecto al control
y a la posibilidad de conjunción con otras enfermedades es importante
comprobar los síntomas de las marchiteces debidas a Fusarium (Mazzanti,
1994).
2.5.2.4 Ciclo de la enfermedad
Las marchiteces debidas a Fusarium son enfermedades típicas del suelo, y en el
la principal fuente del inóculo son los restos vegetales infectado; las
clamidosporas pueden resistir de forma inactiva durante varios años y germinar
al disponer de nutrientes, por ejemplo la proximidad de partes jóvenes de raíces.
La clamidospora germinada da lugar a inóculo al gormar hifas, conidias y
clamidosporas; en este aspecto las cepas del patógeno se comportan igual que
otras especies de Fusarium (Agrios, 1998).
En la rizosfera hay una competencia intensa con otros microorganismos y en
particular con otros Fusarium; aunque muchas cepas de F. oxysporum son
capaces de penetrar en los tejidos corticales de la raíz las cepas especificas de
huésped son las únicas capaces de penetrar al tejido vascular y causar
marchitez; la penetración tiene lugar principalmente en la zona de elongación de
la raíz y puede facilitarse por heridas y por ataque de nematodos; desde el punto
de penetración el hongo se extiende hacia arriba por los vasos xilematicos
26
mediante crecimiento miceliar y formación de microconidias que se transportan
en la corriente transpiratoria (Latorre, 1999).
En estadíos posteriores puede extenderse al tejido adyacente causando necrosis
visibles exteriormente. La patogénesis esta relacionada con el bloqueo de los
vasos y la formación de enzimas y toxinas. Los Fusarium causantes de
marchitez pueden también invadir y colonizar plantas que no son huéspedes, en
las que causan síntomas leves; estos portadores asintomáticos contribuyen al
transporte y multiplicación del inóculo (Smith, 2002).
2.5.2.5 Epidemiología y control
Los Fusarium patogénicos causantes de marchiteces, que tiene una importancia
primordial en muchos cultivos (excepto cereales), puede dispersarse en el suelo,
polvo, agua de riego o por plantas infectadas (pero rara vez por semilla); los
agentes mas importantes en la practica son
el suelo y el material de
multiplicación vegetativa, que deben someterse a controles fitosanitarios para
impedir la dispersión. Aunque las clamidosporas son muy resistentes es posible
utilizar termoterapia en bulbos y tratamientos desinfectantes en el suelo que, sin
embargo, tiene a ser mas bien ineficaces en suelo in situ, dado que incluso
pequeñas cantidades de inóculo residual pueden ser acusa de ataques
importantes y que el inóculo que permanece en zonas profundas colonizará de
nuevo con rapidez la
zona desinfectada, en la que existe un vació
microbiológico (Smith, 2002).
En los sistemas intensivo de cultivo las raíces se desarrollan en un volumen
limitado de sustrato, que puede mantenerse en un principio libre de F.
oxysporum, sin embargo debe evitarse la re-infestación con plantas, polvo o
agua de riego. Algunos suelos son supresivos para las marchiteces debidas a
Fusarium, debido a que un alto nivel de competencia con otros microorganismos
impide que las formas especiales ataquen a las plantas cultivadas en ellos; este
efecto supresito puede incluso trasferirse a otros suelos y establecerse allí, lo
que abre perspectivas a un control microbiológico (Agrios, 1998).
Dado que suelo ácidos con deficiencias en potasio; y fertilización con Nitrógeno
amonico tiende a favorecer la enfermedad, el encalado, la fertilización potasita y
el uso de nitrato reducen a veces las perdidas. Otros factores que favorecen las
27
marchiteces por Fusarium son las temperaturas elevadas, el crecimiento rápido y
la transpiración intensa, pero no son fáciles de alterar sin afectar directamente la
producción.
El
éxito
inicial
del
control
con
fungicidas
sistémicos
(benzimidazoles) fue de corta duración al aparecer con rapidez cepas resistentes
de F. oxysporum. Las principales perspectivas para el control residen de hechos
en la mejora de cultivares resistentes, de los que se dispone comercialmente
para la amatoria de huéspedes importantes; tales cultivares pueden ser muy
resistentes solo a algunas razas o ser ampliamente tolerantes a distintas razas,
en algunos casos pueden dar buen resultado injertar sobre patrones con un
buen nivel de resistencia de base amplia (Polanco, 2004).
2.5.3 Generalidades de Sclerotinia sclerotiorum
2.5.3.1 Descripción básica
El hongo crece rápidamente en cultivo produciendo un micelio algodonoso
blanco, abundante, en el que se desarrollan esclerocios negros hasta de 1 cm.
de diámetro, con una superficie ligeramente punteada, que a menudo exudan
gotitas de liquido en atmósferas saturadas en
hipocótilos Sclerotinia
sclerotiorum se han descrito dos tipos morfológicamente distintos de hifas: Hifas
infecciosas
intercelulares
anchas
(diámetro
medio
17µm)
orientadas
predominantemente en paralelo al eje longitudinal de hipocótilo, que se forman al
principio, apareciendo el segundo tipo morfológico: hifas que se ramifican con un
diámetro medio de 8.5 µm y que se desarrollan sub-apicalmente a partir de las
hifas de infección, se ramifican abundantemente y se penetra en el huésped inter
e intracelularmente. En las colonias viejas se forman a menudo microconidias
fialidicas unicelulares cuyo papel en el ciclo vital, si es que lo tiene, no se ha
aclarado, aunque en distintas ocasiones se ha supuesto que se pueden
funcionar como espermatidas y se ha señalado su germinación in Vitro. No hay
Macroconidias. Los esclerocios tienen germinación miceliogénica y carpogénica;
en el primer caso dan lugar a hifas vegetativas y en segundo, a apotecios que
tiene forma de copa, son pardo-amarillento de hasta 10 mm de diámetro, sobre
un tallo cilíndrico liso que se origina del esclerocio. Las ascas son cilíndricas
clavadas de hasta 130 x 10 µ, con 8 esporas. Las ascosporas son uniseriadas y
elípticas de 9-13 x 4-6.5 µ (Smith, 2002).
28
2.5.3.2 Hospederos
S. sclerotiorum es uno de los patógenos con una gama de huéspedes más
amplia, se señala como huéspedes a 225 géneros de 64 familias de plantas
superiores, principalmente angiospermas. Es especialmente frecuente el
parasitismo
a
las
Solanaceae,
Cruciferae,
Umbeliferae,
Compositae,
Curcubitaceae y Leguminoseae. En raras ocasiones ataca a plantas leñosas, a
gramíneas y a cereales. Se ha demostrado que son capaces de atacar una
amplia gama de huéspedes (Agrios, 1998).
2.5.3.3 Enfermedad
S. sclerotiorum
causa en una amplia gama de huéspedes una podredumbre
blanda progresiva de tejidos no lignificados; los daños son especialmente
frecuentes en tallos de plantas herbáceas y en órganos de almacenamiento de
hortícola; también causa lesiones de hojas, pero solo si las condiciones para su
extensión son muy favorables. En distintos cultivos se dan nombre distintos a la
enfermedad, siendo generalizado el del mal del esclerocio. Son rasgos
característicos la formación de lesiones extensas blandas, normalmente de color
claro y el crecimiento de un tapiz miceliar blanco algodonoso sobre la superficie
y en el interior de las cavidades del huésped; posteriormente se forma en las
cavidades medulares de los tallos y de los pecíolos esclerocios negros
prominentes cuya aparición es un carácter diagnostico fiable. El primer síntoma
notable en plantas infectadas en el eje principal cerca del nivel del suelo suele
ser un marchitamiento, al que sigue rápidamente un colapso total y el
encamado (Purdy, 1999).
2.5.3.4 Epidemiología
Los esclerocios constituyen el principal medio de supervivencia; su supervivencia
en el suelo es muy variable, pero se considera seis-ocho años el límite superior.
El micelio también puede sobrevivir en las semillas, lo que tiene poca
importancia epidemiológica. En una amplia gama de condiciones la germinación
miceliogénica tiene poca importancia debido a que en el suelo no estéril la
extensión saprofítica es limitada; sin embargo cuando se encuentran próximos
los esclerocios y las plantas susceptibles pueden tener lugar infecciones
devastadoras del suelo (Adams, 1999).
29
Una condición para la germinación carpogénica es que haya habido un periodo
de helada que rompa la dormicíon y a continuación temperaturas mayores y
humedades altas; en las altitudes templadas los apotecios maduran típicamente;
los estipes de los apotecios se alargan en respuesta a la luz y las ascosporas se
dispersan por el viento; al aterrizar sobre huéspedes potenciales necesitan
durante 16-24 horas agua para germinar; pueden germinar en un intervalo de
temperatura desde 0-25º C, con un óptimo a 15-20 ºC (Smith, 2002).
También parece que para la infección se necesita una base exógena de
nutrientes. Los tejidos heridos, muertos o senescentes se colonizan con facilidad
y sirven como una base nutritiva, desde la que puede tener lugar la infección de
tejidos sanos (Adams, 1999).
Las ascosporas germinales producen apresorios que pueden variar desde
formas lobuladas simples a cojinetes ramificados complejos; la penetración
normalmente es directa a través de la cutícula, ayudada por una importante
disolución pectolítica y celulolítica de la estructura de la estructura celular del
huésped. Al descomponerse el huésped los esclerocios vuelven al suelo o
pueden distribuirse por las operaciones culturales, la recolección el pastoreo, etc.
(Agrios, 1998).
En la mayoría de las regiones la ausencia de un estadio conídico y las
limitaciones ambientales para la formación de apotecios reducen a un ciclo único
anual de infección (Smith, 2002).
2.5.3.5 Control
El control químico se ha dirigido tanto a inhibir el desarrollo de los esclerocios
como a proteger las plantas contra la infección por ascosporas; lo primero se ha
intentado con distintos esterilizantes de suelo y con fungicidas de amplio
espectro (Smith, 2002).
El control biológico con antagonistas microbianos que colonizan los esclerocios
parece que pueda resultar prometedor en el futuro. Los métodos culturales de
control deben utilizarse con cuidado: el realizar labores profundas en dos años
sucesivos puede reexponer esclerocios viables enterrados, y la rotación de
30
cultivos tiene un valor limitado, dado la amplia gama de huéspedes (Adams,
1999).
2.6 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
Las plantas poseen una variedad de mezclas de compuestos bioactivos tales
como lípidos, grasas, fotoquímicos, fragancias, pigmentos y sabores que son
ampliamente utilizados en la agroindustria alimentaría y no alimentaría, en la
industria Farmacéutica y en la industria cosmética. Para separar estos
compuestos (solutos) de la fase sólida, ésta se pone en contacto con una fase
líquida, ambas fases entran en contacto íntimo y el (los) soluto(s) se difunde(n)
desde el sólido a la fase líquida, lo que permite una separación de los
componentes de su estructura natural original.
Este proceso se conoce como lixiviación y para realizarlo existen varios
métodos. Un proceso importante es la lixiviación de azúcar de las remolachas
con agua caliente. Otros procesos muy utilizados consisten en la extracción de
aceites vegetales, en los cuales se emplean disolventes orgánicos como hexano,
acetona y éter, para extraer aceites de maní, soja, semillas de lino, ricino, girasol
o algodón (Geankoplis, 1999).
Los métodos tradicionales de extracción requieren altos tiempos de residencia y
grandes cantidades de solvente. Estos métodos se basan en la selección del
solvente asociado con el uso de calor y/o agitación e incluyen el soxhlet, la
hidrodestilación y maceración mezclada con agua, alcohol o grasa caliente. El
soxhlet es una técnica estándar y la principal referencia para evaluar el
rendimiento de otros métodos de extracción sólido – líquido (Luque de Castro y
García-Ayuso, 1998).
De un tiempo a esta parte se han desarrollado varias técnicas nuevas para la
extracción de solutos de matrices sólidas, entre ellas se tiene: la extracción
asistida con ultrasonido (Vinatoru, 2001), la extracción asistida con microondas
(Kaufmann y Christen, 2002), la extracción con solvente acelerado (Kaufmann y
Christen, 2002; Smith, 2002) y la extracción con fluidos supercríticos (Brunner,
2005; Rozzi y Singh, 2002), con el objeto de acortar el tiempo de extracción,
31
disminuir el consumo de solvente, aumentar el rendimiento de extracción y
mejorar la calidad del extracto.
Se empezará describiendo los métodos de extracción con soxhlet y con fluidos
supercríticos, también se citaran algunos resultados comparativos entre estos
dos métodos y finalmente se mostrarán algunas de las aplicaciones
agroindustriales con fluidos supercríticos FSC, con el objeto de continuar la
divulgación que ya se viene haciendo de éste método y de sus bondades entre
los académicos e industriales de nuestros países latinoamericanos.
2.6.1 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
2.6.1.1 EXTRACCION CON SOXHLET
Para la extracción con soxhlet se deben tener en cuenta: la selección del
solvente, la matriz sólida y las condiciones de operación.
2.6.1.1.1 Selección del solvente
Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que ofrezca el mejor
balance de varias características deseables: alto límite de saturación y
selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para producir el material
extraído con una calidad no alterada por el disolvente, estabilidad química en las
condiciones del proceso, baja viscosidad, baja presión de vapor, baja toxicidad e
inflamabilidad, baja densidad, baja tensión superficial, facilidad y economía de
recuperación de la corriente de extracto y bajo costo (Dahlstrom et al., 1999).
Cada solvente diferente produce extractos y composiciones específicos
(Zarnowski y Suzuki, 2004). El solvente más ampliamente utilizado para extraer
aceites comestibles de las plantas es el hexano. El hexano tiene un rango en el
punto de ebullición bastante estrecho, de aproximadamente 63–69 0C y es un
excelente solvente de los aceites en lo que se refiere a su solubilidad y facilidad
de recuperación. Sin embargo, el n-hexano, el elemento principal del hexano
comercial, está ubicado como el número uno en la lista de los 189 contaminantes
del aire más riesgosos por la Agencia Americana de Protección del ambiente
(Mamidipally y Liu, 2004).
32
El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol, hidrocarburos, e
incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos del medioambiente, la
salud, y a preocupaciones de seguridad. Se usó d-cineno y hexano en la
extracción de aceite a partir del salvado de arroz y se observó que el d-cineno
extrajo una cantidad significativamente superior de aceite que el hexano bajo
cualquier serie dada de condiciones (Mamidipally y Liu, 2004). También se ha
utilizado agua para extraer el aceite del salvado de arroz a un valor del pH de 12.
El aceite extraído con agua tuvo un volumen más bajo de ácido graso libre y un
color más claro que el obtenido con hexano (Hanmoungjai et al., 2000).
Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos recuperación
debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el soluto. Los
costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces se agrega
un co-solvente para aumentar la polaridad de la fase líquida. Además, se han
reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para aumentar el
rendimiento y la cinética de extracción (Li et al., 2004).
2.6.1.1.2 Características de la matriz
La extracción con Soxhlet depende fuertemente de las características de la
matriz y de las dimensiones de las partículas puesto que la difusión interna
puede ser el paso limitante durante la extracción. Para la extracción total de las
grasas de las semillas oleaginosas, se realizó una extracción de 2-h obteniendo
un rendimiento del 99% cuando la dimensión de las partículas era 0.4 mm,
mientras que fue necesaria una extracción de 12-h para obtener una eficacia
similar si la dimensión de las partículas era 2.0 mm (Luque-Garcia y Luque de
Castro, 2004).
2.6.1.1.3 Condiciones de operación:
Durante la extracción con Soxhlet, el solvente se recupera normalmente por
evaporación. Las temperaturas de extracción y evaporación tienen un efecto
significativo en la calidad final de los productos. Además, se ha encontrado que
el aceite del salvado de arroz extraído con d-cineno era ligeramente más oscuro
comparado con el aceite extraído con hexano, probablemente debido a las
mayores temperaturas de extracción y evaporación al usar d-cineno como
solvente. Las altas temperatura de ebullición para la recuperación del solvente
33
pueden disminuirse usando evaporación flash o separación por membrana para
recuperar el solvente (Mamidipally y Liu, 2004).
2.6.1.1.4 Comparación Soxhlet y CO2 SC
La extracción con Soxhlet es una técnica bien establecida. Entre sus ventajas,
por encima de otros nuevos métodos como la extracción ayudada con
ultrasonido, la ayudada con microondas y la extracción con fluidos supercríticos
está la de tener bastantes aplicaciones industriales, buena reproduci-bilidad y
eficacia, y menor manipulación del extracto. Sin embargo, comparada con
CO2SC, el método Soxhlet es una técnica anticuada y consumidora de tiempo y
de solvente. En la extracción de aceites de rosa silvestre (Rosa canina L),
utilizando n-hexano con soxhlet se consumieron 180 minutos para extraer 48.5
g/kg, mientras que con CO2SC a 35 ºC y 250 bar, se consumieron 35 minutos
para extraer 57.2 g/kg, cuando se le agrego propano (cosolvente) al CO2SC a
28O ºC y 100 bar se consumieron 35 minutos para obtener 66.8 g/kg
(Szentmihalyi et al., 2002).
Algunos solventes usados con el Soxhlet convencional se han cuestionado
recientemente debido a su toxicidad (n-hexano). El uso de solventes no tóxicos
como el CO2 supercrítico y el agua están en el orden del día.
2.6.1.2 EXTRACCION CON FSC
Un fluido supercrítico es cualquier sustancia a una temperatura y presión por
encima de su punto crítico termodinámico. Tiene la propiedad de difundirse a
través de los sólidos como un gas, y de disolver los materiales como un líquido.
Adicionalmente, puede cambiar rápidamente la densidad con pequeños cambios
en la temperatura o presión. Estas propiedades lo hacen conveniente como un
sustituto de los solventes orgánicos en los procesos de extracción.
Los fluidos supercríticos (FSC) tienen la capacidad de extraer ciertos
compuestos químicos con el uso de determinados solventes específicos bajo la
combinación de temperatura y presión (Brunner, 2005; Rozzi y Singh, 2002).
El CO2 es el fluido supercrítico más utilizado debido a que es no tóxico, no
inflamable, no corrosivo, incoloro, no es costoso, se elimina fácilmente, no deja
34
residuos, sus condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar y se
consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura
y por tanto, se pueden separar compuestos termolábiles, se puede obtener a
partir de procesos de fermentación alcohólica y ayuda a prevenir la degradación
térmica de ciertos componentes químicos del alimento cuando son extraídos
(Brunner, 2005; Hurtado, 2002; Rosa y Meireles, 2005).
Las ventajas de los fluidos supercríticos son: (Bruner, 2005; Hurtado, 2002;
Sánchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Zkal et al., 2005).
1. Poseen alto coeficiente de difusión y viscosidad más baja que los líquidos; 2.
Ausencia de tensión superficial, la cual aumenta la operación de extracción dada
la rápida penetración de estos al interior de los poros de la matriz heterogénea;
3. La selectividad durante la extracción puede ser manipulada dada la variación
de las diferentes condiciones de operación temperatura y presión afectando la
solubilidad de varios componentes en el fluido supercrítico; 4. La extracción con
fluidos supercríticos no deja residuos químicos; 5. La extracción con CO2
supercrítico permite su fácil recuperación por procesos de reciclaje. El CO2
supercrítico también ha sido usado en innumerables aplicaciones industriales
que incluyen diferentes campos como: alimentos, agricultura, acuicultura,
pesticidas, procesos microbianos, petroquímica y farmacéutica (Brunner, 2005;
Sánchez et al., 2005; Tonthubthimthong et al., 2001; Vagi et al., 2005).
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Existe una gran incidencia de hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los cultivos de Albahaca
(Ocimum basilicum) tipo exportación, en los invernaderos de la Facultad de
Agronomía de la Universidad nacional de Colombia, sede Bogotá.
La enfermedades producidas por estos hongos fitopatógenos han ocasionado
pérdidas en la producción hasta de un 60%, debido a una considerable baja de
la calidad del producto, la disminución de la productividad del cultivo y llegando
incluso la pérdida total de las plantas.
Para evitar el control químico de estos hongos se propone un manejo natural
integrado del extracto acuoso de Tomillo (Thymus vulgaris), que es conocido por
tener propiedades antifúngicas, pero no ha sido evaluado sobre estos hongos
de gran importancia en el cultivo de la Albahaca.
3.2 JUSTIFICACIÓN
El control de patógenos con aceites esenciales y extractos de plantas aromáticas
es un campo poco explorado en nuestro país, aunque por muchos años haya
habido evidencia del conocimiento de las propiedades de las plantas aromáticas
y sus múltiples usos. El empleo de estas plantas y sus componentes han sido de
una forma artesanal.
Aprovechando la problemática generada en cultivos de Albahaca (Ocimum
basilicum) tipo exportación, por hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum en los invernaderos de la
Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá;
nos lleva a pensar que esta problemática también afecta a los productores de
plantas aromáticas en nuestro país.
La necesidad de buscar alternativas que sean viables para productores nos da la
pauta para evaluar la acción antifúngica del extracto de de la planta aromática
de Tomillo (Thymus vulgaris), que beneficiaría en el futuro a un gran número de
36
productores y comercializadores, ya que se daría a conocer un método para
combatir los agentes causales de las enfermedades de la Albahaca (Ocimum
basilicum), y esto a su vez contribuiría al estudio del manejo biológico de las
enfermedades fitopatológicas
La importancia de esta investigación va encaminada a la búsqueda de nuevos
productos biológicos que se pueden generar a un menor costo, y lo más
importante es que tienen un efecto menos agresivo que los productos químicos
en el medio ambiente.
37
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) sobre
los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y Sclerotinia
sclerotiorum causantes de enfermedades en Albahaca (Ocimum basilicum).
5.2 Objetivos Específicos
•
Obtener extractos acuosos de Tomillo (Thymus vulgaris).
•
Probar las propiedades antifúngicas del extracto de Tomillo (Thymus
vulgaris) sobre los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium
oxysporum y Sclerotinia sclerotiorum in vitro aislados de albahaca
(Ocimum basilicum).
•
Evaluar la actividad antifúngica del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
sobre plantas de Albahaca
(Ocimum basilicum) inoculadas con
Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum en
pruebas de invernadero.
38
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Diseño de la investigación
El proyecto se realizó dentro de las instalaciones de los Laboratorios de Biología
del Suelo y en los Invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad
Nacional de Colombia, sede Bogotá.
Este procedimiento se realizó con extracto de Menta (Mentha spicata) pero no
hubo ninguna inhibición de crecimiento para los hongos, por eso se realizó con
tomillo, ya que no todos las plantas tienen los mismos principios activos.
Los extractos acuosos se realizaron con concentraciones de 150, 250 y 500 g/L
de extracto Tomillo en agua, el tratamiento térmico se realizó con tiempos de 15
y 30 min de ebullición respectivamente, ya que en los tiempos 0, 45 y 60 min no
se observó inhibición de ningún tipo. La tasa de crecimiento se midió los días 2,
5 y 7.
5.1.1 Obtención de Extracto de Tomillo (Thymus vulgaris)
Se recolectaron plantas de Tomillo (Thymus vulgaris) de 10 semanas de edad
del Invernadero Nº 2 de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de
Colombia, sede Bogotá, las cuales se cortaron con tijeras de podar, dejando
ramas de 2 centímetros sobre el eje principal de la planta. Posteriormente se
pesaron y se procesaron en una picadora de cocina marca Oster.
Se utilizó 150 gramos, 250 gramos y 500 gramos respectivamente de material
vegetal fresco de Tomillo, pesados en Balanza analítica marca Petller P 5000, ya
molido se le practicó un prelavado con solución de hipoclorito de sodio al 0,2%
por 2 minutos y luego 4 lavados con agua destilada estéril; se agregaron 1000ml
de agua doblemente destilada y esterilizada y se licuaron por separado hasta
obtener una mezcla homogénea en licuadora industrial marca Oster por 5min.
Posteriormente se dispuso a ebullición cada concentración por 15, 30 y 45
minutos, se filtró utilizando cuatro capas de gasa estéril y luego se utilizó bomba
al vacío con papel de filtro estéril para la última filtración. El extracto obtenido se
dejo enfriar, se dispuso en frascos herméticos Schott y se llevó a refrigeración en
oscuridad a 4 ºC hasta su utilización (Bianchi et al. 1997).
39
5.1.2 Prueba in vitro
Las cepas de los hongos fitopatógenos Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum y
Sclerotinia sclerotiorum; fueron aisladas anteriormente de plantas de Albahaca
(Ocimum basilicum) enfermas en el Laboratorio de Biología del Suelo de la
Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede
Bogotá. Las cepas se conservaron en Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®).
5.1.2.1 Evaluación de la Inhibición del Crecimiento Radial
La evaluación de la actividad del extracto, contra hongos se hizo por medio de la
medición del halo del crecimiento del hongo respecto al control negativo. Se
preparó Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) como indica el fabricante, 39
gramos en 1000 mL de agua destilada estéril, se dispuso a esterilización en
autoclave de marca All American a 121 ºC por 15 minutos y luego se dispuso en
cajas de Petri estériles 50% de Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) y 50% de
las diferentes concentraciones del extracto con los diferentes tiempos de
ebullición, se dejó solidificar y se llevaron a refrigeración a 4 ºC hasta su
posterior utilización (Ramírez 1998).
Para la siembra se usaron rodajas de 3 mm de diámetro de colonias de los
hongos fitopatógenos de ocho días de edad que se cortaron con un
sacabocados. Para colocar la rodaja con el micelio en contacto con el medio de
cultivo en el centro de la caja se utilizaron palillos de madera de 10 centímetros
de largo y 2 milímetros de grosor puntiagudos esterilizados con calor seco. Las
cajas se sellaron y etiquetaron y se incubaron a 26 ºC.
Para la evaluación de los hongos fitopatógenos se utilizó el procedimiento de
crecimiento radial midiendo el diámetro de la colonia a los dos, cinco y siete días
después de la inoculación (Martínez 1999).
Como control positivo se utilizó un producto comercial que tiene como
componente activo Propamocarb-HCl, que se le adicionó al Agar Papa Dextrosa
(PDA OXOID ®) como indica la casa comercial y como control negativo se utilizó
Agar Papa Dextrosa (PDA OXOID ®) para todos los hongos fitopatógenos.
40
Para todas las concentraciones y los tiempos al igual que para los controles se
hizo 4 repeticiones para obtener datos representativos estadísticamente.
Se midió el diámetro en milímetros de la zona de crecimiento del hongo en
cuatro direcciones a intervalos de dos días tomando como resultado el valor
promedio de estas mediciones. Este ensayo se realizó cuatro veces por
duplicado determinándose el porcentaje de crecimiento y el porcentaje de
inhibición del crecimiento del hongo para el extracto acuoso:
Diámetro del crecimiento del hongo
En el extracto X 100
% de crecimiento = ------------------------------------------------------Diámetro del control negativo
% de inhibición = 100-% de crecimiento
Los resultados obtenidos se evaluaron considerándose activo los extractos que
presentaron un porcentaje de crecimiento menor o igual al 80 y un porcentaje de
inhibición mayor o igual al 20 (Márquez et al. 2007).
5.1.3 Prueba de Invernadero
Se sembraron en un banco de propagación en los invernaderos de la Facultad
de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; 200
semillas de plantas de Albahaca (Ocimum basilicum), las semillas se obtuvieron
en Semicol Ltda. Estas semillas se dispusieron en bandejas plásticas con turba
estéril sin nutrientes, se les proporcionó riego con aspersor cada dos días y al
paso de 30 días se realizaron los dos ensayos simultáneos:
La inoculación de la turba con Fusarium oxysporum se realizó tomando 1000
gramos de turba por el hongo fitopatógeno, esta turba se esterilizó en autoclave
a 121ºC por 15 min. Se tomaron cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA
OXOID ®) con este hongos con 10 días de edad, se dispusieron perlas de vidrio
estériles con 20 ml de tween 80, se hicieron movimientos circulares para
desprender las esporas por 3 min, se realizaron conteos
de esporas (del
41
inóculo) en cámara de Neubauer antes de iniciar el proceso para obtener una
concentración inicial, este inóculo se mezcló con 500 ml de agua destilada estéril
y se llevó a una concentración de 1 x 107 esporas / ml. Para inocular la turba con
Fusarium oxysporum, se tomó 1000 gramos de turba estéril en empaques
individuales y flexibles en polietileno con cierre hermético y se incubó durante 7
días a 26ºC, se realizaron 4 repeticiones (Rodríguez 2004).
El inóculo de Sclerotinia sclerotiorum y
Botrytis cinerea, se realizó tomando
esclerocios de los hongos con 10 días de edad en medio PDA, se dispusieron 50
esclerocios en dos porciones de 1000 gramos de turba estéril en empaques
flexibles en polietileno con cierre hermético y se incubó durante 7 días a 26ºC.
Se realizaron 4 repeticiones (Rodríguez 2004).
Se tomó 2000 gramos adicionales de turba estéril para los controles, sin
patógenos.
Al cabo de 7 días de la inoculación de la turba, las plantas de Albahaca (Ocimum
basilicum) de 30 días de edad se transplantaron a recipientes de poliestireno
expandible de 4 onzas.
Se le proporcionó 100 gramos de turba inoculada con los tres hongos
fitopatógenos respectivamente a cada recipiente, y la turba estéril se dispuso 4
recipientes para el control positivo y 4 para el negativo.
A las plantas se les dispuso una bolsa de plástico para crear un micro ambiente
húmedo por 72 horas. Después de la siembra se regaron con aspersor cada dos
días por 15 días. Cuando se evidenció crecimiento micelial sobre la turba, se les
proporcionó
a
cada
planta
por
aspersión
20
mL
de
las
diferentes
concentraciones utilizadas en el ensayo in vitro tendrían efecto antifúngico, cada
dos días por 15 días más.
A cada una de las plantas restantes se aplicó 20 mL por aspersión de las
diferentes concentraciones del extracto de Tomillo (Thymus vulgaris) y a los 10
días se inóculo la turba con Sclerotinia sclerotiorum (5 esclerocios / 100 gramos
de turba). El riego fue cada dos días con aspersor por 15 días.
42
Se midió el porcentaje de la planta afectada. Como referencia se usó una tabla
de incidencia y severidad de la enfermedad. Como control se tomaron plantas
sin aplicación de los extractos. Se tomó por cada tratamiento 4 repeticiones.
Se realizó el análisis estadístico utilizando el programa SAS.
43
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 PRUEBA IN VITRO
6.1.2 EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO RADIAL
Muchas plantas han sido aceptadas para su uso antifúngico porque en su
análisis químico y evaluación farmacológica han demostrado que contienen un
principio especial, (Zapata et al., 2003) la búsqueda es muy intensa en casi todo
el mundo y se basa en explorar el parentesco sistemático con plantas curativas
ya reconocidas que han servido para hallar otras nuevas; o bien se han
descubierto por casualidad o por validación sistémica de la flora de una región
(Romero et al., 2006).
Las concentraciones a las cuales se produjo la inhibición son altas con respecto
a otros estudios hechos con diferentes tipos de plantas; sin embargo, se debe
tener en cuenta que se está trabajando con extractos crudos que contienen otros
metabolitos o impurezas sin actividad antifúngica.
Dada la extensa variedad de la flora y los numerosos principios activos que en
ella se encuentran, es muy probable que de esta fuente puedan aislarse
moléculas novedosas y eficaces para ser usadas como antimicóticos; dado que
en la literatura revisada no se encontraron reportes de estudios fitoquímicos que
aislaran o implicaran una sustancia química en particular con efectos
antifúngicos, no es posible, por el momento, definir la naturaleza química de los
compuestos bioactivos de esta especie. A partir de tomillo fresco se han aislado
Carvacrol (2-hidroxi -p. cimeno) y P- cimenol (Isopropil-tolueno) a las cuales se
les ha encontrado actividad antifúngicas (Espitia, 2004).
En nuestra población existe una amplia tradición en el uso empírico de plantas
con fines medicinales (Marín et al., 2006); es por tanto, muy importante validar a
través de la experimentación, la eficacia y seguridad de las múltiples especies
vegetales utilizadas.
44
Los extractos acuosos de tomillo en las concentraciones empleadas tienen
efecto inhibitorio sobre las tres cepas evaluadas. Mediante la prueba de
comparar el comportamiento en conjunto de todos los
tratamientos se
encuentran diferencias significativas entre todos los tratamientos.
Según lo descrito por Vokou et al. (1993) y Daferera et al. (2003), tomillos de
diferentes orígenes geográficos mostraron que los componentes mayoritarios
son el carvacrol, en la mayoría de las muestras estudiadas, el timol, en un
número menor de casos, o una sumatoria de estos dos compuestos fenólicos
conformando entre el 50 y 90% del total. Como componentes secundarios están
descriptos en estos trabajos, el p-cimeno y al terpineno en todas las muestras
analizadas.
La capacidad antifúngica podría ser atribuida a la presencia de los compuestos
monoterpénicos fenólicos, principalmente timol y carvacrol. Se ha informado la
reactividad de los grupos hidroxilofenólicos, formando enlaces puentes de
hidrógenos con sitios activos de ciertas enzimas (Farag et al., 1989). Además
estos compuestos atacan la membrana citoplasmática del microorganismo
destruyendo la capacidad selectiva y permitiendo el escape de componentes
intracelulares (Nychas, 1995) lo que sumado a su capacidad de inactivar
enzimas, explicaría la actividad contra el desarrollo fúngico.
Un ejemplo de este comportamiento son los datos obtenidos de la administración
del extracto acuoso de tomillo, en estos ensayos, donde se encontró correlación
entre los días de administración y la acción inhibitoria.
En las siguientes figuras los resultados de la evaluación de la actividad
antifúngica del extracto acuoso, se aprecia el crecimiento de los hongos
patógenos y se evidencia la respuesta de inhibición de los extractos junto con los
controles ensayados
45
%
Porcentaje de Crecim iento según concentración
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
5
7
Día
Conc. 150
Conc. 250
Conc. 500
Desv. Std.
FIG.1. Porcentaje de Crecimiento según concentración
En la Figura 1 se observa que la concentración de extracto acuoso de 500g/L
fuel el que obtuvo menor crecimiento (60%) en los días de evaluación, en los
días 5 y 7 se mantuvo el porcentaje de crecimiento de los hongos, esto
comparado con la concentración de 150 g/L que obtuvo un crecimiento del 90%
en el día 5.
%
Porcentaje de Crecim iento según Tiem po
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
5
7
Día
15 min.
30 min.
Desv. Std.
FIG.2.Porcentaje de crecimiento según tiempo.
El extracto con el tratamiento térmico de 30 min fue el que obtuvo un menor
porcentaje de crecimiento de los hongos 63% el día 5 y el día 7 un 58 % de
crecimiento; el tratamiento térmico de 15 min obtuvo un crecimiento de los
hongos más alto 80% en el día 5 y 72% el día 5 respectivamente (Figura2).
46
Porcentaje de Crecimiento según Especie
120
100
%
80
60
40
20
0
2
5
Día
Fusarium oxysporum
Sclerotinia sclerotiorum
7
Botrytis cinerea
Desv. Std.
FIG.3. Porcentaje de Crecimiento según especie.
B. cinerea tuvo un mayor crecimiento en los tres días evaluados, F. oxysporum
en el día 5, tuvo un porcentaje de crecimiento del 52%, mientras que B. cinerea
tuvo uno de 107%, S. sclerotiorum tuvo un porcentaje de 46%. El día 7 se obtuvo
una disminución del porcentaje de crecimiento de F. oxysporum (27%) y B.
cinerea (81%), mientras S. sclerotiorum tuvo aumento en el porcentaje de
crecimiento de 35% (Figura 3)
%
Porcentaje de inhibición según concentración
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
5
7
Día
Conc. 150
Conc. 250
Conc. 500
FIG.4. Porcentaje de Inhibición según concentración.
Desv. Std.
47
El porcentaje de inhibición de la concentración de 500g/L fue el que obtuvo un
mayor valor (48%) en el día 5 y en el día 7 fue 44%, esta concentración fue la
que alcanzo un menor porcentaje de crecimiento y un mayor porcentaje de
inhibición de los tres hongos (Figura 4)
Por el valor del porcentaje de inhibición de los días 5 y 7 en la concentración
500g/L se presume que la acción antifúngica del extracto permanece durante
estos días; ya que su poder de inhibición disminuye en un 2% durante estos dos
días, el porcentaje de inhibición del extracto de 250g/L, aunque es menor el
comparado con el de la contracción de 500g/L, en el día 5 fue de 41% y aumento
en un 3% el día 7. El porcentaje de inhibición de la concentración 150g/L fue la
menor, aumento un 4% del día 5 al 7 (Figura 4).
%
Porcentaje de inhibición según tiem po
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
5
Día
15 min.
30 min.
7
Desv. Std.
FIG.5.Porcentaje de inhibición según tiempo.
El porcentaje de inhibición con tratamiento térmico de 30 min fue el que produjo
un mayor valor 42% el día 5 y 44% el día 7, El tratamiento con 15 min alcanzo
en el día 5 un porcentaje de
34% y disminuyo el día 7 hasta 31 %. El
tratamiento térmico de 30 min fue el que obtuvo un menor porcentaje de
crecimiento y un mayor porcentaje de inhibición de los hongos (Figura 5).
48
%
Porcentaje de Inhibición según especie
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
Fusarium oxysporum
5
Día
Sclerotinia sclerotiorum
7
Botrytis cinerea
Desv. Std.
FIG. 6. Porcentaje de Inhibición según especie.
F. oxysporum tuvo un porcentaje de inhibición el día 5 de 46% y el día 7 la
inhibición aumento en un 28%. Mientras que S. sclerotiorum el día 5 obtuvo una
inhibición de 53% y fue disminuyendo hasta llegar a 15 %. B. cinerea el día 5
alcanzo un porcentaje de inhibición del 19 y aumento el día 7 a 22% (Figura 6).
Teniendo en cuenta que el porcentaje de inhibición mayor al 20% es positivo
para evidenciar la inhibición del crecimiento de los hongos (Márquez et al. 2007),
la concentración del extracto acuoso con una concentración de 500g/L y un
tratamiento térmico de 30 min, es el que obtiene la propiedad antifúngica capaz
de disminuir el crecimiento de los hongos (Figura 6).
La inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum se observa en la figura 7
donde el control, es decir el medio de cultivo que no tiene adición de extracto
acuoso de tomillo se ve invadido completamente con el hongo patógeno,
mientras que con la adición del extracto inhibe su normal desarrollo.
49
15 min
30 min
Fusarium oxysporum
Día 7
150g/L
150g/L
Control
250g/L
250g/L
500g/L
500g/L
FIG. 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 7
B. cinerea tuvo un comportamiento en el crecimiento similar al de F. oxysporum
en el control; con la adición al medio de cultivo del extracto acuoso de tomillo se
observa una inhibición del crecimiento con los tratamientos utilizados (Figura 8).
15 min
Botrytis cinerea
30 min
Día 7
150g/L
150g/L
Control
250g/L
500g/L
FIG. 8. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 7.
250g/L
500g/L
50
En la figura 9 se observa que S. sclerotiorum tuvo un menor crecimiento en el
medio con el extracto en todas las concentraciones y con los tratamientos
térmicos comparados con el control.
15 min
Sclerotinia sclerotiorum
30 min
Día 7
150g/L
150g/L
Control
250g/L
500g/L
250g/L
500g/L
FIG. 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 7.
En las figuras anteriores (Figura 7, 8 y 9) se observa que el extracto de tomillo
logra inhibir el crecimiento normal de los hongos patógenos, los controles que no
están adicionados con el extracto confirma el comportamiento normal en el
crecimiento de los hongos patógenos.
6.2 PRUEBA DE INVERNADERO
Al evidenciarse la enfermedad, se aplicó el extracto que tuvo mayor valor en el
porcentaje de inhibición contra los fitopatógenos en la prueba in vitro, este
extracto fue el de concentración de 500g/L con un tiempo de ebullición de 30
min; se calculó el porcentaje de incidencia y severidad de la enfermedad con
cada planta inoculada con los diferentes hongos fitopatógenos, tomando como
referencia la siguiente escala.
51
ESCALA DE SEVERIDAD
NIVEL
PORCENTAJE
SÍNTOMAS
0
0
Planta sana
1
0 - 10
Leves
2
10 - 50
Severos
3
50 -75
Muy severos
4
≥ 75
Planta muerta
TABLA Nº 2. Escala de Severidad (Agrios, 1998)
FIG. 10. Escala de Severidad (Agrios, 1998)
6.2.1 FUNCIÓN CURATIVA
La dosis del extracto se le aplicó a las plantas cuando se observó el crecimiento
micelial por encima de la turba. En las figuras 11 y 12 se puede observar que S.
slcrerotiorum presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad con un
valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, este es uno de los hongos
fitopatógenos con alto grado de agresividad en el cultivo de albahaca, se
demuestra que tiene la capacidad de causar graves daños a los cultivos y tiene
una incidencia alta por encima de los otros hongos fitopatógenos utilizados para
este estudio.
% INCIDENCIA Nivel Curativo
80
%
70
60
50
40
30
32
39
F. oxysporum
Sclerotinia sclerotiorum
44
23
14
20
10
0
B. Cinerea
C+
C-
HONGOS FITOPATOGENOS
FIG. 11. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
de tomillo a nivel Curativo.
%
52
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
% SEVERIDAD Nivel Curativo
71,5
F. oxysporum
Sclerotinia
sclerotiorum
B. Cinerea
26,9
10
1
6
C+
C-
HONGOS FITOPATOGENOS
FIG. 12. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
de tomillo a nivel Curativo.
6.2.2 FUNCIÓN PREVENTIVA
El extracto acuoso de tomillo con tratamiento térmico se aplicó antes de la
inoculación durante 10 días. Al observar las figuras 13 y 14 se puede establecer
que S. sclerotiorum, presenta un porcentaje de incidencia y de severidad más
alto que los otros hongos (25% de incidencia y 18 % de severidad). Aunque
estos porcentajes comparados con los valores del función curativa de extracto
sean más bajos S. sclerotiorum sigue siendo la mayor amenaza en el cultivo de
albahaca.
B. cinerea es el segundo hongo con valores más altos de porcentajes de
incidencia y severidad, en la función preventiva se disminuyó el valor del
porcentaje de incidencia más de la mitad con respecto a la función curativa del
extracto,
44% a nivel curativo y 21% a nivel preventivo, por otro lado, los
resultados en el porcentaje de severidad de la enfermedad no son buenos,
26.9% de severidad en la función curativa y 17% en la función preventiva. Al
observar estos resultados se demuestra que la prevención es la mejor opción de
atacar enfermedades causadas por microorganismos (Figuras 13 y 14).
53
Siendo F. oxysporum uno de lo hongos más agresivos sobre muchos cultivos,
fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo con la función
curativa y preventiva del extracto (Figuras 13 y 14).
% INCIDENCIA Prevención
80
70
F. oxysporum
%
60
50
Sclerotinia sclerotiorum
40
30
20
10
B. Cinerea
25
16
C+
21
5
9
C-
0
HONGOS FITOPATOGENOS
FIG. 13. Porcentaje de Incidencia de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
de tomillo a nivel Preventivo.
% SEVERIDAD Prevención
80
%
70
60
50
F. oxysporum
40
B. Cinerea
Sclerotinia sclerotiorum
30
20
10
18
6
C+
17
C1
2
0
HONGOS FITOPATOGENOS
FIG.14. Porcentaje de Severidad de la enfermedad causada por hongos con aplicación de extracto
de tomillo a nivel Preventivo.
El carvacrol y el timol son los monoterpenos que caracterizan a algunas de las
especies de la familia Lamiaceae, principalmente en los oréganos (Origanum
spp.) y los tomillos (Thymus spp.). Estos compuestos son a los que se le
atribuyen propiedades antifúngicas. Las concentraciones en que estos
54
componentes son encontrados presentan una importante variabilidad debido a
numerosos parámetros significativos que afectan la composición química de esta
planta, principalmente la localización geográfica y las condiciones climáticas y
ambientales (Vokou et al., 1993).
La evaluación de extractos vegetales sobre organismos patógenos se realiza
usualmente in vitro, esto hace que no sean reconocidas las ventajas que estos
tienen sobre los productos químicos y a su vez sea complicado su utilización en
campo.
El insuficiente rendimiento mostrado por formulaciones químicas comerciales
demuestra la necesidad de crear métodos para la producción de compuestos
biológicos con una mayor eficacia y una vida útil prolongada. Este aspecto es
crucial para prácticas de control biológico para ganar credibilidad
y
competitividad (Rhodes, 1993).El uso de fungicidas químicos para su uso en el
cultivo de albahaca convierte a agentes de biocontrol en una alternativa
confiable contra las enfermedades causadas por hongos en el cultivo.
55
7. CONCLUSIONES
De los resultados de la presente investigación se puede concluir:
•
El extracto de tomillo (Thymus vulgaris) acuoso con tratamiento térmico
de 30 min inhibió 42% el día 5 y 44% en el día 7 el crecimiento de los
hongos fitopatógenos.
•
Se observó un mayor porcentaje de inhibición de crecimiento en el
extracto de 500g/L con tratamiento térmico en los hongos patógenos
utilizados.
•
El extracto de tomillo (Thymus vulgaris) inhibe el crecimiento en mayor
proporción a Fusarium oxysporum in vitro con un porcentaje de inhibición
en el día 7 de 74%.
•
Se puede observó en la prueba de invernadero que S. slcrerotiorum
presenta un mayor porcentaje de incidencia de enfermedad en la función
curativa con un valor de 44%, y un porcentaje de severidad de 71.5%, y
en la función preventiva presenta un porcentaje de incidencia y de
severidad más alto que los otros hongos, 25% de incidencia y 18 % de
severidad.
•
Siendo F. oxysporum uno de lo hongos más agresivos sobre muchos
cultivos, fue el que menor porcentaje de incidencia y severidad tuvo en la
función curativa y preventiva del extracto.
•
En la prueba de invernadero se observó que el extracto de tomillo tiene
un mejor resultado en prevención de enfermedades causadas por hongos
patógenos que en la curación de estas.
56
8. RECOMENDACIONES
•
Es necesario llevar el extracto de tomillo (Thymus vulgaris) a un análisis
cromatográfico y de espectrometría de masas para conocer la totalidad
de sus componentes y su concentración individual con el fin de conocer
cual es el componente con mayor proporción que posee la característica
antifúngica.
•
Determinar el mecanismo de inhibición de las sustancias en los hongos.
•
Para próximos estudios se recomienda utilizar concentraciones más altas
de extracto, para así observar un mayor porcentaje de inhibición, frente a
los hongos en estudio.
57
9. REFERENCIAS
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10. ANEXOS
64
ANEXO Nº 1. Crecimiento de F. Oxysporum con los tratamientos
Fusarium oxysporum
CONCENTRACION
DIA 2
DIA 5
DIA 7
TIEMPO (min)
(g/L)
(mm)
(mm)
(mm)
15
150
1
15
19
150
1
13
18
150
1
19
23
150
1
13
31
250
1
13
26
250
1
14
19
250
1
7
10
250
1
9
16
500
2
9
17
500
2
13
26
500
1
19
28
500
1
16
25
150
1
19
19
150
1
20
30
150
2
21
38
150
1
19
12
250
1
9
10
250
1
9
11
250
1
9
10
250
5
10
12
500
1
11
13
500
1
12
19
500
1
13
16
500
1
13
17
3
27
82
3
29
86
1
27
79
2
31
83
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
1
1
15
15
30
30
30
CONTROL +
CONTROL -
ANEXO Nº 2. Crecimiento de B. cinerea con los tratamientos
Botrytis cinerea
65
TIEMPO
(min)
15
15
15
30
30
30
CONTROL+
CONTROL -
CONCENTRACIÓN
DIA 2
DIA 5
DIA 7
(mm)
(mm)
(mm)
150
7
26
36
150
6
59
69
150
11
30
42
150
9
33
38
250
7
23
39
250
8
33
37
250
9
39
60
250
11
36
59
500
1
38
51
500
2
19
45
500
3
36
41
500
3
38
52
150
6
57
87
150
2
43
56
150
5
33
61
150
1
26
36
250
1
26
32
250
6
19
30
250
2
22
41
250
5
16
26
500
NC
1
31
500
1
13
25
500
1
2
6
500
2
12
21
9
70
87
7
82
86
9
75
87
8
72
87
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
1
(g/L)
ANEXO Nº 3. Crecimiento de S. Sclerotiorum con los tratamientos
Sclerotinia sclerotiorum
66
TIEMPO
(min)
CONCENTRACION
DIA 2
DIA 5
DIA 7
(mm)
(mm)
(mm)
150
1
7
21
150
1
10
16
150
1
11
21
150
1
12
21
250
5
11
21
250
6
12
24
250
5
12
22
250
6
13
21
500
6
16
31
500
6
11
29
500
NC
12
22
500
NC
16
25
150
6
17
23
150
5
13
19
150
3
19
21
150
5
15
22
250
3
10
21
250
5
11
20
250
4
10
26
250
7
12
23
500
NC
NC
NC
500
NC
3
7
500
1
12
20
500
1
6
11
11
74
87
10
72
87
9
69
85
9
70
86
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
(g/L)
15
15
15
30
30
30
CONTROL +
CONTROL -
ANEXO Nº 4. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 2.
67
15 min
Botrytis cinerea
30 min
Día 2
150g/L
150g/L
Control
250g/L
250g/L
500g/L
500g/L
ANEXO Nº 5. Crecimiento B. cinerea en extracto Albahaca día 5.
15 min
Botrytis cinerea
30 min
Día 5
150g/L
150g/L
Control
250g/L
250g/L
500g/L
500g/L
ANEXO Nº 6. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 2.
68
30 min
15 min
Fusarium oxysporum
Día 2
150g/L
150g/L
Control
250g/L
250g/L
500g/L
500g/L
ANEXO Nº 7. Crecimiento F. oxysporum en extracto Albahaca día 5
30 min
15 min
Fusarium oxysporum
Día 5
150g/L
150g/L
Control
250g/L
500g/L
250g/L
500g/L
69
ANEXO Nº 8. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 2.
30 min
15 min
Sclerotinia sclerotiorum
Día 2
150g/L
150g/L
Control
250g/L
250g/L
500g/L
500g/L
ANEXO Nº 9. Crecimiento S. sclerotiorum en extracto Albahaca día 5.
15 min
Sclerotinia sclerotiorum
30 min
Día 5
150g/L
150g/L
Control
250g/L
500g/L
ANEXO Nº 10. Prueba de Invernadero
250g/L
500g/L
70
Prueba a Nivel Curativo
Control +
S. sclerotiorum
B. cinerea
F. oxysporum
Prueba a Nivel Preventivo
Control -
71