Download estudio de la patogenicidad de aislados de fusarium spp

Centro de Biotecnología, Vol. 3 Nro. 1. 2014 61
ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE AISLADOS DE FUSARIUM SPP., ASOCIADOS
A LA MARCHITEZ VASCULAR DEL BABACO EN LOJA- ECUADOR
STUDY OF PATHOGENICITY OF FUSARIUM SPP. ISOLATES, ASSOCIATED WITH
VASCULAR WILT BABACO IN LOJA-ECUADor
Angel Robles Carrión1,
Richard Gómez Criollo ,
2
Fabián Macas Rojas2,
Aminael Sánchez
Rodríguez3 y
Roldán Torres-Gutiérrez4*
Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Ciudad Universitaria “La Argelia” - PBX:
072547252 - Casilla Letra “S”. Loja-Ecuador. [email protected]
2
Carrera de Ingeniería Agronómica. Universidad Nacional de Loja-Ecuador.
3
Centro de Biología Celular y Molecular. Universidad Técnica Particular de Loja-Ecuador aminael.
[email protected]
4
Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Proyecto “Prometeo Viejos Sabios”.
SENESCYT-Ecuador. [email protected]
*Autor para correspondencia
1
Resumen
La presente investigación tuvo como objetivos evaluar la patogenicidad de aislados fúngicos del género
Fusarium, causante de la marchitez vascular en Babaco (Vasconcellea heilbornii var. pentágona), en
condiciones de invernadero. Para ello se estableció un diseño experimental completamente al azar con doce
tratamientos y diez réplicas, resultantes de la inoculación de 11 aislados fúngicos y un control. Se utilizaron 300
plántulas de Babaco de tres meses de edad, sembradas en sustrato estéril. Se estudiaron tres métodos de
inoculación (por inmersión de raíces, inyección de inóculo a nivel de cuello de la raíz e inoculación al sustrato).
Para la evaluación de la patogenicidad se utilizó la escala de evaluación propuestas por Veintimilla (2000).
Los resultados obtenidos muestran que tres de los 11 aislados fueron capaces de producir un alto grado de
severidad de la enfermedad en el cultivo del Babaco (T3-Fox-CHA1- Fusarium oxysporum cepa 2T12JO1A,
T4-Fox-COC1 Fusarium oxysporum Ppf6 y T11-Fox-REY1 Fusarium oxysporum cepa 2T12JO1A), con
diferencias significativas al resto de los tratamientos evaluados en los tres métodos de inoculación, sin embargo,
la inoculación por inmersión de las raíces mostró mayor grado de severidad. El re-aislamiento del agente
causal en cada uno de los tratamientos corroboró los resultados obtenidos, determinándose en condiciones de
laboratorio estructuras fúngicas pertenecientes a los aislados: T3-CHA1-Fox, T4-COC1-Fox y T11-REY1-Fox.
Estos resultados son de vital importancia para la realización de ulteriores estudios de patogenicidad a nivel
molecular y de interacción de los aislados empleados con posibles controladores biológicos.
Palabras claves: Babaco, Fusarium oxysporum, métodos de inoculación, pruebas de
patogenicidad.
Abstract
The present study aims to evaluate the pathogenicity of fungal isolates of Fusarium, which causes vascular wilt
in Babaco (Vasconcellea heilbornii var. Pentagonal), under greenhouse conditions. A completely randomized
design with twelve treatments and ten replicas resulting from the inoculation of 11 fungal isolates and a control
was established. Three hundred Babaco seedlings from three months old, grown in sterile substrate was used.
Three methods of inoculation (root dip, injection inoculum at root collar level and inoculating the substrate)
were studied. Assessment scale proposed by Veintemilla (2000) was used for evaluation of pathogenicity.
The results show that three of the 11 isolates were able to produce a high degree of disease severity in
growing Babaco (T3-Fox-CHA1- strain 2T12JO1A Fusarium oxysporum, T4-Fox-COC1 Fusarium oxysporum
strain Ppf6 and T11-Fox-REY1 Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A), with statistical differences to all other
treatments evaluated in three different inoculation methods, however the dip inoculation root showed higher
degree of severity. The re-isolation of the fungus from the plants corroborated the results obtained, determining
fungal structures belonging to isolates: T3-CHA1-Fox, T4-COC1-Fox y T11-REY1-Fox. These results are of
vital importance for further study of pathogenicity at the molecular level and interaction of fungal isolates with
potential biological controls.
Keywords: Babaco, Fusarium oxysprum, inoculation methods, pathogenicity test.
Recibido: abril 14 de 2014
Aprobado: junio 25 de 2014
62 Centro de Biotecnología, Vol. 3 Nro. 1. 2014
Robles et al. (2014); ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE AISLADOS DE Fusarium spp., ASOCIADOS A
LA MARCHITEZ VASCULAR DEL BABACO EN LOJA- Ecuador
Introducción
En la actualidad en el Ecuador la actividad
agrícola tiene mucha importancia y
trascendencia, se ha convertido en una
actividad económica que se proyecta muy
fuertemente, marcando índices y pautas en
nuestra economía. En este contexto se ha
tomado en cuenta el nuevo auge que existe en
la producción de cultivos agrícolas exóticos y
no tradicionales, uno de éstos es el babaco,
considerado desde épocas pasadas como una
fruta de óptimas características ya que posee
ventajas como el no poseer semillas, tener
una cáscara delgada y el agradable sabor de
su pulpa (Uzcátegui, 2007). El Babaco es una
especie partenocarpia, su propagación se la
hace de manera asexual utilizando partes de
las plantas como: brotes tiernos, estacas o
por injertos, dando lugar a típicos problemas
fitopatológicos y a la degeneración de la
especie (Scheldeman, 2002; AAIC, 2003).
La producción de esta fruta ha decaído en
los últimos años debido a la presencia de
la Marchitez Vascular del Babaco (MVB),
enfermedad causada por el hongo Fusarium
oxysporum (reportada por primera vez por
Ochoa y Fonseca 2000), Quillay (2011),
menciona que la marchitez vascular puede
causar pérdidas del 50 a 100% en la producción
de plántulas y 50% en la producción de la fruta.
Desafortunadamente no existen medidas de
control para el manejo integrado de la MVB, por
lo que, en los últimos años esta enfermedad se
ha extendido por todas las zonas productoras
del Babaco.
Algunas especies del género Fusarium son
habitantes del suelo. Se reconocen por su
impacto económico negativo en la agricultura
mundial, ya que son agentes causales del
marchitamiento vascular y pudrición basal de
una gran variedad de plantas. F. oxysporum,
cumple dos fases importantes: una saprofítica
muy activa durante la que puede vivir en el
suelo y en los residuos vegetales por espacio
de 20 años y puede inhabilitar el uso del suelo
para nuevas cosechas; y, una fase parasítica
patógena de plantas (García, 2011; GonzálesCárdenas 2005). Este hongo es, sin duda,
una de las especies económicamente más
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importantes de todo el género Fusarium (Leslie
y Summerell 2006). Dadas sus características
como saprófito o como patógeno especializado,
este hongo puede asociarse con otros
microorganismos y formar un sinergismo,
por lo cual la determinación de patogenicidad
es fundamental en la identificación de los
microorganismos asociados con la MVB.
La patogenicidad ha sido definida como la
capacidad relativa que tiene un microorganismo
fitopatógeno para producir una enfermedad
(Agrios, 2005). Cuando se piensa que un
microorganismo puede ser la causa de una
enfermedad cualesquiera y no existen estudios
previos que los comprueben, por lo tanto hay
que seguir la metodología de los postulados
de Koch para verificar o no la hipótesis que el
o los microorganismos son la causa para que
se produzca la enfermedad, dichos postulados
se los puede resumir así: 1) Hay una relación
muy estrechamente entre la enfermedad con
el microorganismo fitopatógeno, es decir
el fitopatógeno debe estar asociado con la
enfermedad en todas las plantas enfermas que
se examinen. 2) Se debe aislarse y obtener un
cultivo axénico del microorganismo en estudio
y anotar sus características (morfológicas,
culturales, bioquímicas entre otras). 3) El
microorganismo en estudio y desarrollado en
cultivo axénico debe ser inoculado en plantas
sanas de la misma especie de donde se aisló.
Las plantas inoculadas deber reproducir los
mismos síntomas de la enfermedad. 4) El
microorganismo fitopatógeno debe ser reaislado otra vez en cultivos axénicos y sus
características deberán ser exactamente igual
a las del paso dos (Hernández, 2010). En este
contexto, la presente investigación se orientó
a evaluar la patogenicidad de once aislados
Fusarium spp., posibles causantes de la
Marchitez Vascular en Babaco (Vasconcellea
x. heilbornii var. pentagona), a nivel de
invernadero en la ciudad de Loja.
Materiales y Métodos
La presente investigación se desarrolló
en dos fases: la primera, se realizó en el
invernadero (estructura de hormigón armado,
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ventanales de vidrio y cubierta de fibra de
vidrio) de la Universidad Nacional de Loja; la
segunda fase se realizó en el laboratorio del
Centro de Biotecnología.
Material vegetal
Materiales biológicos
Diseño experimental.
Se utilizaron once aislados Fusarium sp.,
provenientes de los cantones de Loja y
Saraguro, caracterizados morfo-cultural y
molecularmente por Armijos y Serrano, 2014
(Cuadro 1).
Cuadro 1. Aislados de Fusarium
Se utilizaron 300 plántulas de Babaco
(Vasconcellea x. heilbornii var. pentagona)
de 90 días después de la siembra (dds).
Se
utilizó
el
diseño
experimental
completamente al azar (DCA), con 12
tratamientos (Cuadro 2).
sp., asociados a la Marchitez Vascular del Babaco (Armijos y Salinas, 2014).
Código de
Aislado
# Pares de
Bases
Accesión
Versión
Homología
(Blasn)
Organismo
AML 1
510 bp
FR822779
FR822779.1
99%
Fusarium sp. LF236
AML 2
522 bp
KC429789
KC429789.1
99%
Fusarium oxysporum
strain 2T12JO1A
CHA 1
522 bp
KC429789
KC429789.1
99%
Fusarium oxysporum
strain 2T12JO1A
COC 1
538 bp
EF495238
EF495238
99%
Fusarium oxysporum
strain Ppf6
COC 2
538 bp
EF495238
EF495238.1
99%
Fusarium oxysporum
strain Ppf6
COC 3
522 bp
KC429789
KC429789.1
99%
Fusarium oxysporum
strain 2T12JO1A
ECM 1
557 bp
KC428403
KC428403.1
99%
Fusarium oxysporum
isolate IBSD-F.O
ECM 2
546 bp
JN400714
JN400714.1
99%
Fusarium oxysporum f.
sp. ciceris
QUI 1
539 bp
EU910076
EU910076.1
98%
Fusarium oxysporum f.
sp. ciceris
QUI 2
522 bp
KC429789
KC429789.1
99%
Fusarium oxysporum
strain 2T12JO1A
REY 1
522 bp
KC429789
KC429789.1
99%
Fusarium oxysporum
strain 2T12JO1A
Leyenda: Amable María (AML), El Carmelo (ECM), Reymincha (REY), Chantaco (CHA), Cochapamba
(COC) y Quisquinchir (QUI).
Siembra y desinfección de plantas de Babaco.
Se utilizaron 300 plántulas de Babaco
(60 días después de la siembra [dds]). El
sustrato para la siembra estuvo compuesto
en una proporción 2-1-1 (turba-arena-tierra
agrícola) y desinfectado en vapor húmedo a
± 200°C por dos horas. Antes de realizar el
experimento a todas las plantas se las sometió
a un periodo de aislamiento preventivo de 60
días, es decir se llevó un estricto control de
plagas, enfermedades, fertilización y riego
(Ver apéndice 1), para que las plántulas
estén en óptimas condiciones y realizar
los experimentos por cada uno de los tres
métodos (Inmersión de raíces, inyección de
10 ml de solución fúngica a nivel del cuello
de la raíz, e inoculación al sustrato con 100
ml de solución fúngica).
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Cuadro 2. Especificación de los tratamientos utilizados en el estudio de la patogenicidad de once aislados de Fusarium spp.,
asociados a la MVB.
N°
Descripción
Código
Tratamiento
1
Testigo
-------------------
T0
2
Fusarium sp. (aislado Amable María)
Fusarium oxysporum (aislado Amable María)
Fusarium oxysporum (aislado Chantaco)
Fusarium oxysporum (aislado Cochapamba)
Fusarium oxysporum (aislado Cochapamba)
Fusarium oxysporum (aislado Cochapamba)
Fusarium oxysporum (aislado El Carmelo)
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (aislado El Carmelo)
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (aislado Quisquinchir)
Fusarium oxysporum (aislado Quisquinchir)
Fusarium oxysporum (aislado Reymincha)
F-AML1
T1
FOX-AML2
T2
FOX-CHA1
T3
FOX-COC1
T4
FOX-COC2
T5
FOX-COC3
T6
FOX-ECM1
T7
FOX-ECM2
T8
FOX-QUI1
T9
FOX-QUI2
T10
FOX-REY1
T11
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Método
de inoculación de plantas de
por inmersión de raíces.
Babaco
Se realizó un pre-inóculo en 10 cm3 de
medio de cultivo Caldo-Papa-Dextrosa
(CPD) en tubo de ensayo de 20 cm3, en
donde se inocularon los 11 aislados de
Fusarium sp., los cuales se incubaron por 5
días a ±30°C y a 300 rpm en una incubadora
tipo Shaker. Pasado el tiempo se transfirió
todo el contenido del tubo de ensayo a un
matraz de 500 cm3 que contenía el medio
de cultivo CPD y se las incubó igual que
el paso anterior. Transcurrido el tiempo se
filtró 2 ml de cada uno de los inóculos en
tubos eppendoff con el objetivo de realizar
el conteo de la cantidad de conidios de
cada uno de las muestras en la cámara de
Neubauer. Para ello se utilizó la siguiente
fórmula propuesta por Rojas-Triviño (2011):
CC=∑n (5 X 10 000)
CC = Concentración en la cámara
∑n = Sumatoria de células en los cinco
cuadrantes
(5 X 10 000) = Constante
Seguidamente se ajustaron todas las
concentraciones en una proporción de 1 X
106 por ml-1 UFC (Unidades Formadoras
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de Colonias), aplicando la siguiente fórmula
propuesta por Castellanos et. al. (2011)
V_incial X C_inicial= V_final X C_final
Vinicial = Volumen inicial del inóculo que
deseamos preparar
Cinicial= Concentración inicial del inóculo
Vfinal = Volumen final del inoculo que
deseamos preparar
Cfinal = Concentración final deseada del
inoculo (1 X 106)
Una vez montado el ensayo en el invernadero
se procedió a realizar la inoculación de la
siguiente forma: Se extrajo todas las plántulas
por tratamiento del sustrato tratando de hacer
el menor daño posible; con agua común se
lavaron las raíces, se procedieron a realizar
pequeños daños con la ayuda de tijeras a las
raíces para crear la vía de ingreso de cada una
de los aislados de Fusarium, seguidamente
las cinco plántulas se sumergieron por 5
minutos en la solución fúngica de 400 ml,
ajustada a una concentración de esporas
de 1 X 106. Este paso se realizó para los
11 aislados de Fusarium sp., posteriormente
se procedieron a sembrar las cinco plántulas
inoculadas en el mismo sustrato y maceta de
la que se extrajo (Ver apéndice 2).
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Se inocularon un total de 60 plantas de
Babaco (5 plántulas de Babaco por cada
cepa de Fusarium sp.), las plántulas del
tratamiento testigo (T0) se inocularon con
agua destilada estéril, esto se realizó bajo
un Diseño Completamente al Azar con 5
repeticiones (Ver cuadro 2 y 3), todas las
unidades experimentales se regaron con
400 ml de agua estéril al momento de la
inoculación y posterior a esta, al calendario
previamente establecido; bajo condiciones
de invernadero.
Método
con 10
de inoculación de plantas de
Babaco
ml de solución fúngica a nivel del
cuello de la raíz.
Para el desarrollo de este método de
inoculación se siguió exactamente la
misma metodología del primer método de
inoculación en lo referente a: preparación del
sustrato, cuarentena e inóculo – inoculación
(preparación del medio, siembra del patógeno
en medio líquido, pre-inóculo e inoculo final).
En cambio el proceso de inoculación se
describe a continuación:
Con la ayuda de una jeringuilla se inóculo 10
ml de la suspensión fúngica en el cuello de la
raíz. La suspensión se ajustó a 1 X 106 UFC X
ml-1 de cada uno de los aislados de Fusarium
sp., esto se realizó con cada plántula, de
cada tratamiento, con sus 5 repeticiones y
de acuerdo los 12 tratamientos en total se
inocularon 60 plántulas de Babaco.
Método de inoculación de plantas de Babaco
con 100 ml de solución fúngica al sustrato.
Igualmente se siguió la misma metodología del
primer método de inoculación en lo referente
a: preparación del sustrato, cuarentena e
inóculo – inoculación (preparación del medio,
siembra del patógeno en medio líquido, preinóculo e inoculo final). En cambio el proceso
de inoculación se describe a continuación:
A cada unidad experimental se inoculó 100
ml de solución fúngica ajustada a 1 X 106
UFC X ml-1 del aislado de Fusarium sp., paro
lo cual se utilizó un vaso milimetrado de 250
ml de capacidad. La inoculación se realizó a
cada planta de cada uno de los tratamientos,
con 5 repeticiones. En total se inocularon por
este método 60 plántulas de Babaco.
Cinética del progreso de la
MVB mediante los diferentes
inoculación.
enfermedad
métodos de
Se evaluó el nivel de patogenicidad de los
once aislados de Fusarium sp., para ello
se utilizó la escala de evaluación externa
propuestas por Ventimilla (2000) y citado por
Cueva (2007) (Cuadro 3). Esta escala se utilizó
para los tres métodos de inoculación, desde
Cuadro 3: Escala de evaluación de severidad externa para plantas de Babaco, Loja, junio del 2013.
Nivel
Síntomas
0
1
Planta sana
Clorosis inicial de las primeras hojas bajeras.
Clorosis intensa de aproximadamente el 50 % del follaje. Defoliación moderada.
Clorosis total del follaje. Defoliación severa. Bandas oliváceas longitudinales y deprimidas en el tallo.
Plantas completamente defoliadas. Necrosis descendente desde el ápice
del tallo (muerte de la planta).
2
3
4
Fuente: Cueva 2007
el segundo día después de la inoculación
(ddi) hasta los 40 ddi. Se evaluaron los 12
tratamientos y las 5 repeticiones.
Comprobación de los postulados de Koch.
Después de los 40 días de evaluación, se
seleccionaron las mejores muestras y se
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trasladaron al Laboratorio de Microbiología
del Centro de Biotecnología de la Universidad
Nacional de Loja, donde se realizó el
aislamiento, cultivo puro y descripción del
microorganismo, para comprobar si éste
corresponde al aislado de Fusarium sp.,
previamente inoculado de acuerdo a cada
uno de los tratamientos y así determinar el
causante de la sintomatología presentada en
el Babaco. El aislamiento del hongo del tejido
vegetal se realizó por siembra directa en
medio de cultivo PDA, según la metodología
propuesta por Ochoa y Fonseca (2000) y
Leslie y Summerell (2006). Esta evaluación
se la realizó con la escala de severidad
interna se la realizó cuando se extrajo la
planta para trasladarla al laboratorio para la
comprobación de los postulados de Koch.
Esto se realizó visualmente, realizando un
corte transversal del cuello de la raíz para
observar si existía una decoloración y la
necrosis de la misma y asignarle un grado
según la escala descrita a continuación
(Cuadro 4) (Cueva, 2007).
Cuadro 4: Escala de evaluación de severidad interna en la raíz de Babaco, Loja, junio del 2013.
Grado
Descripción
0
Raíces sanas, ausencia de lesiones. Sistema vascular sano sin coloración.
1
Lesiones leves en la corteza de la raíz y/o raicillas
1a
Lesiones pronunciadas en la corteza de la raíz/raicillas y cuello de la planta
patrón.
2
Colonización vascular limitada a la raíz.
3
Colonización vascular significativa de la raíz que progresa hasta el cuello
del patrón.
4
Colonización vascular de la raíz, cuello y parte del tallo del patrón.
5
Colonización vascular abundante de toda la planta, incluyendo el injerto.
Análisis de resultados
n = Número de plantas evaluadas
Los datos obtenidos con el uso de las
escalas de evaluación de la severidad
interna y externa, no representan el real
grado de severidad de la enfermedad, para
lo cual, todos los datos de las evaluaciones
fueron transformados mediante el uso de la
siguiente formula citada por Vázquez (2008):
k = Valor o grado mayor de la escala (en este
caso 5).
Dónde:
S = Severidad o grado de Ataque de la
enfermedad
∑ (a x b) = Sumatoria del número de plantas
u órganos enfermos o infectados según el
grado de afectación (0, 1, 2, 3, 4, 5)
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Con los datos trasformados de la severidad
interna y externa, se realizaron curvas de la
cinética de la enfermedad de cada tratamiento
y de los tres métodos de inoculación, para
esto se utilizó el programa Microsoft Office
Excel 2010.
Asimismo con los datos transformados y
registrados de las diversas evaluaciones
de los tres métodos de evaluación bajo un
diseño completamente al azar (DCA), se
procedió a realizar el análisis estadístico
correspondiente, antes de realizar el análisis
de la varianza todos los datos obtenidos
tenían que cumplir con las siguientes
condiciones necesarias para proceder a su
análisis: aleatorización, independencia de
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Robles et al. (2014); ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE AISLADOS DE Fusarium spp., ASOCIADOS A
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errores experimentales, homogeneidad de
varianza y normalidad de datos (Sigarroa,
2006).
Los datos de las evaluaciones de los doce
tratamientos y de las cinco repeticiones
después de la transformación de la severidad
están dados en porcentajes, para lo cual se
transformaron utilizando la siguiente formula
(Sigarroa, 2006):
x = dato de la investigación
0,5 =coeficiente para
cuando existen ceros.
la
Resultados
Durante el transcurso de la cuarentena
se identificaron que algunas plántulas
presentaban
sintomatología
de
enfermedades causadas por hongos y por
virus, por lo cual se procedió a separarlas
para evitar la propagación hacia las demás.
Las enfermedades detectadas no constaron
dentro de nuestro marco de investigación,
por lo cual no se las caracterizaron,
simplemente se realizó la exclusión de
las plántulas infectadas. En la presente
investigación se seleccionaron plántulas que
no tuvieran sintomatología de enfermedades
fitopatológicas, con un solo tallo, bien
formadas y con un promedio de 8 a 12 hojas.
trasformación
Método de inoculación de plantas de Babaco
por inmersión de raíces
Seguidamente se procedió a realizar el
análisis de la varianza (ANOVA) y se realizó
las pruebas de separación de medias de
Tukey al 5%, para ello se utilizó el software
STATGRAPHICS Centurión versión 15.2.14
(Armijos y Salinas, 2014).
Los mejores resultados estadísticos para
la severidad externa, corresponden a los
aislados FOX-CHA1, FOX-COC1 y FOXREY1, como se muestra en la Figura 1. Los
3 aislados antes indicados han expresado
el 100 % de severidad, es decir la planta de
Babaco llegó a un estado de necrosamiento
total causando la muerte en ellas.
Los análisis de la severidad externa e interna
se realizaron según los datos reportados a
los 40 días después de la inoculación.
Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba
(COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias
con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.
Figura 1: Curva de severidad de los 11 aislados de Fusarium sp., asociados a la MVB y nivel de significancia por tratamiento
según la prueba de TukeyHSD,
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Robles et al. (2014); ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE AISLADOS DE Fusarium spp., ASOCIADOS A
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Método de inoculación de plantas de Babaco con 10 ml de solución fúngica a nivel del cuello
de la raíz.
En la Figura 2, identificamos los tratamientos con respecto a los tratamientos restantes,
T3 (FOX-CHA1) y T4 (FOX-COC1) y el considerándolos estadísticamente como los
T11 (FOX-REY1) con mayor severidad, mejores aislados, al igual que en el método
presentando una diferencia bien marcada de inoculación antes descrito.
Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba
(COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias
con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.
Figura 2: Curva de severidad de los 11 aislados de Fusarium sp., asociados a la MVB y nivel de significancia por tratamiento
según la prueba de TukeyHSD.
Método de inoculación de plantas de Babaco
con 100 ml de solución fúngica al sustrato
Al igual que en los dos métodos de
inoculación anterior, los mejores aislados
luego de las pruebas estadísticas, fueron
los tratamientos T3 (FOX-CHA1), T4 (FOXCOC1) y T11 (FOX-REY1), como se puede
ver en la Figura 3, los cuales presentaron
mayor severidad de la enfermedad de la
MVB.
Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba
(COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias
con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.
Figura 3: Curva de severidad de los 11 aislados de Fusarium sp., asociados a la MVB y nivel de significancia por tratamiento
según la prueba de TukeyHSD
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Robles et al. (2014); ESTUDIO DE LA PATOGENICIDAD DE AISLADOS DE Fusarium spp., ASOCIADOS A
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Comprobación de los postulados de Koch.
Evaluación
Mediante los postulados de Koch, se
comprobó que el microorganismo reaislado de las plantas de Babaco después
del periodo de evaluación, correspondía al
aislado inoculado, esto se lo evidenció para
cada uno de los 11 aislados dentro de los
tres métodos utilizados para la inoculación.
Los
mejores
resultados
estadísticos
corresponden a los aislados FOX-CHA1,
FOX-COC1 y FOX-REY1, como se observa
en la Figura 4, donde se representa la
severidad interna identificada en cada uno
de los tratamientos.
de
la
inmersión de raíces.
severidad
interna
por
Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba
(COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias
con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.
Figura 5: Gráfico de medias de tratamientos para la severidad interna, según el método de inyección de una solución conidial
en el cuello de la raíz.
Evaluación
de
la
severidad
interna
por
10 ml de solución fúngica a nivel
del cuello de la raíz.
inyección de
En la Figura 5, se puede observar los
resultados de las pruebas estadísticas, las
cuales arrojaron que los mejores aislados
para la severidad interna de acuerdo al
método de inoculación son FOX-CHA1
y FOX-COC1, y FOX-REY1, los cuales
expresaron mayor severidad de la MVB en
plantas de Babaco.
Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba
(COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias
con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.
Figura 5: Gráfico de medias de tratamientos para la severidad interna, según el método de inyección de una solución conidial
en el cuello de la raíz.
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Evaluación
de
la
severidad
interna
por
inoculación al sustrato con 100 ml de solución
fúngica.
Al igual que en los dos métodos de inoculación
anterior, los mejores aislados luego de las
pruebas estadísticas, corresponden a FOX-
CHA1, FOX-REY1 y FOX-COC1, como se
observa en la Figura 6.
Leyenda: Fusarium sp. Amable María (FOX-AML1), Fusarium oxysporum Amable María (FOX-AML2), Fusarium oxysporum Chantaco (CHA1), Fusarium oxysporum Cochapamba
(COC1, COC2 Y COC3), Fusarium oxysporum El Carmelo (ECM1 Y ACM2), Fusarium oxysporum Quisquinchir (QUI1 Y QUI2) y Fusarium oxysporum Reymincha (REY1). Medias
con letras desiguales difieren estadísticamente para p< 0.05 según la prueba de Tukey HSD.
Figura 6: Gráfico de medias de tratamientos para la severidad interna, según el método de inoculación al sustrato.
Discusión
Durante la cuarentena se identificaron plántulas
que a pesar de estar sometidas a estrictos
controles fitosanitarios, manifestaban la
presencia de enfermedades patógenas, tales
como: decaimiento de las plantas, aclaramiento
de nervaduras y deformación de hojas. Esto
debido a que Babaco es una especie que se
propaga asexualmente utilizando brotes tiernos
o estacas, lo que predispone a esta especie a
problemas fitopatológicos (Scheldeman, 2002;
AAIC, 2003).
Al haber elegido un sustrato con proporción
2-1-1 (turba-arena-tierra agrícola) permitió que
el sistema radicular de las plantas de Babaco
tuviera un buen desarrollo, esto debido a las
propiedades físicas en cuanto a porosidad,
drenaje y retención de agua (Iskánder, 2010).
Para la desinfección del sustrato se pueden
utilizar métodos físicos, químicos y biológicos,
en el caso de los métodos químicos no son
recomendables para trabajar en investigaciones
como la nuestra, ya que los residuos del mismo
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afectarían el desarrollo del organismo inoculado
Fusarium sp. De igual manera con el método
biológico se afectaría al patógeno inoculado
Fusarium sp., con el microorganismo antagónico
utilizado en la desinfección del sustrato. Por
tales razones utilizamos el método físico, que
consiste en la desinfección de sustrato por
vapor de agua (Carrasco y Riquelme, 2006),
debido a que al someter al sustrato a vapor de
agua a una temperatura de 200°C se elimina
todo tipo de patógenos y semillas de otras
especies. Dejando listo el sustrato para realizar
las pruebas de patogenicidad con Fusarium sp.
La inoculación artificial del patógeno coincidió
con los signos y síntomas de Marchitez Vascular
en plantas de Babaco según las descripciones
realizadas por Agrios (2005), quien señala
que todos los Marchitamientos Vasculares
presentan características en común; la planta
infectada pierde turgencia, se debilitan,
adquiere una tonalidad que va del verde claro
al amarillo verdoso, decaen y finalmente se
marchita y muere. Como se puede ver en
las figuras 1, 2 y 3, el tiempo en el que se
expresaron los primeros signos de la MVB
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varió de acuerdo al método de inoculación. En
el método de inmersión de raíces, se observó
los signos de la enfermedad en menor tiempo,
debido a que en la inoculación hubo contacto
directo de Fusarium con el sistema radicular
de la planta, además de las heridas causadas
por la manipulación de las raíces. Caso que
coincide con lo mencionado por Agrios (2005),
que menciona que los patógenos se desarrollan
muy bien en tejidos lacerados o destruidos
antes de llegar a los tejidos sanos.
Ochoa y Fonseca (2000), mencionan
que Fusarium oxysporum es el causante
de la Marchitez Vascular del Babaco, sin
embargo en el proyecto se puede apreciar
que únicamente 3 de los 11 tratamientos
utilizados son los causantes de la Marchitez
Vascular del Babaco (T3 FOX-CHA1Fusarium
oxysporum strain 2T12JO1A, T4 FOX-COC1
Fusarium oxysporum strain Ppf6 Y T11 FOXREY1 Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A),
mientras que los otros tratamientos causan
un daño fisiológico pero no llegan a causar la
marchitez o muerte de la planta.
Mediante los postulados de Koch, se llegó a
determinar que los signos y la sintomatología
expresada por las plantas inoculadas
corresponden a la expresión patógena de los
aislados inoculados. Por lo tanto se comprueba
la patogenicidad de los 11 tratamientos.
Según la evaluación de la severidad, en el
caso de los tres métodos de inoculación,
los tratamientos T3 (FOX-CHA1) Fusarium
oxysporum strain 2T12JO1A, T4 (FOX-COC1)
Fusarium oxysporum strain Ppf6 Y T11 (FOXREY1) Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A,
expresaron la mayor severidad externa e interna
(figuras de la 1 a la 9). En el método de inmersión
de raíces y de inyección a nivel del cuello de
la raíz, estos tratamientos a los cuarenta días
de la inoculación causaron la muerte total de la
planta. A diferencia del método de inoculación
al sustrato en el que estos tratamientos no
causaron la muerte de la planta pero de igual
manera resultaron ser los tratamientos más
severos, esto se debe a que en la inoculación
no se provocó ninguna herida artificial a la
planta, por lo tanto el microorganismo no tuvo
una vía de ingreso para causar el mayor daño
en el tiempo de evaluación (Agrios, 2007).
HayquedestacarquetantoeltratamientoT3(FOXCHA1) Fusarium oxysporum strain 2T12JO1A,
T4 (FOX-COC1) Fusarium oxysporum strain
Ppf6 Y T11 (FOX-REY1) Fusarium oxysporum
strain 2T12JO1A corresponden a aislados de
Fusarium oxysporum, aunque esto no quiere
decir que este es el causante de la Marchitez
Vascular del Babaco, debido a que los demás
aislados también correspondían a Fusarium
oxysporum (a excepción del tratamiento T1
F-AML1 q fue un aislado de Fusarium sp.) y
estos no produjeron la enfermedad pero si se
observó amarillamiento de hojas bajeras de
las plantas de Babaco inoculadas. Se deben
seguir realizando investigaciones con Fusarium
oxysporum, para determinar por qué no todas
las cepas de este microorganismo llegan a
causar la marchitez vascular en Babaco.
Conclusiones
El sustrato compuesto por turba, arena y tierra
en una proporción de 2:1:1 y previamente
esterilizado a vapor de agua, fue ideal para
realizar las pruebas de patogenicidad.
Dentro de los 60 días de cuarentena, se puede
determinar con que planta se puede trabajar,
en este caso de Babaco, ya que este tiempo es
suficiente para evidenciar plantas con cualquier
sintomatología de alguna enfermedad.
Para que existe ataque de Fusarium sp. a
plantas de Babaco, debe haber una herida o
daño en las raíces o cuello de las plantas, para
que pueda expresarse directamente.
El mejor método de inoculación, es el método
por inmersión de raíces, ya que se da un
contacto directo del microorganismo patógeno
con el hospedero (planta), llegando a infectar de
una manera directa a la planta. Los tratamientos
que tuvieron mayor severidad de la enfermedad
de la MVB son T3 FOX-CHA1, T4 FOX-COC1
Y T11 FOX-REY1.
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Se considera un periodo de 40 días para la
evaluación de la enfermedad de la Marchitez
Vascular del Babaco, ya que en este tiempo se
llega a estabilizar la severidad de la enfermedad
causada por Fusarium sp. Los Postulados de
Koch, han permitido determinar con certeza que
las sintomatologías observadas corresponden
al patógeno inoculado
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad
Nacional de Loja y al Consejo de Universidades
Flamencas (VLIR) de Bélgica por el
financiamiento otorgado para la realización del
presente estudio. A Kléver Iván Granda Mora,
Roldan Torres Gutiérrez y Masao Nishikawa por
el aporte a la realización de las investigaciones.
Referencias bibliográficas
Agrios G. 2005. Plant Pathology. (5thed.) Published
Elsevier. United States of America. 948 p.
Armijos W., Salinas. Identificación taxonómica
y caracterización molecular de los agentes
causales de la Marchitez Vascular del Babaco
Vasconcellea heilbornii Badillo. var. pentagona,
en el cantón Loja y Saraguro. Tesis de Ingeniería
Agronómica. Área Agropecuaria y de Recursos
Naturales Renovables. Universidad Nacional de
Loja, Ecuador. 77 p.
Asociación de Agrónomos Indígenas de Cañar
(AAIC). 2003. El cultivo de babaco en invernadero.
Editorial Abya Yala. Quito, Ecuador. 45 p.
Castellanos, G., Jara, C. y Mosquera, G. (2011):
Guías prácticas de laboratorio para el manejo
de patógenos del frijol. Cali, Colombia. Editorial:
Centro Internacional de Agricultura Tropical
(CIAT). 242 p.
Cueva D. 2007. Producción de inoculantes a base de
Trichoderma spp. Para el control de Fusarium
oxysporum sp. caricae en injertos de babaco
(Vasconcellea heilbornii cv. babaco). Tesis de
ingeniería Agropecuaria. Escuela Politécnica del
Ejército-ESPE. Sangolquí-Quito-Ecuador. 114 p.
García P. 2011. Evaluación de la tolerancia de
cinco accesiones de Vasconcellea a Fusarium
sp. como posible porta injertos para babaco
(Vasconcellea x. heilbornii) bajo cubierta plástica
Centro de Biotecnología pp 61 – 72
en la Estación Experimental del Austro del INIAP.
Tesis de Magister en Gestión de la Producción
de Flores y Frutas Andinas para Exportación.
Facultad de Ingeniería Agronómica, Universidad
Técnica de Ambato. Ecuador. 74 p.
Gonzáles-Cárdenas J., Maruri-Garcia J. GonzálesAcosta A. 2005. Evaluación de diferentes
concentraciones de Trichoderma spp. contra
Fusarium oxysporum agente causal de la
pudrición de plántulas en papaya (Carica papaya
L.), en Tuxpan, Veracruz, México. Facultad
de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la
Universidad Veracruzana, Campus Tuxpan.
Revista UDO Agrícola 5 (1): 45-47 p.
Hernández O. 2010. Detención y caracterización del
agente causal del tizón foliar en Teca (Tectona
grandis L. F.) en Huimanguillo, Tabasco. Tesis
de Ingeniero Forestal. Universidad Autónoma
Chapingo. México. 63 p.
Leslie J. F., Summerell. B. 2006. The Fusarium
Laboratory Manual. Published, Blackwell.
Manhattan, United States of America. 387 p.
Ochoa J., Fonseca G. 2000. First Report of
Fusarium Wilt of Babaco (Carica × heilbornii var.
pentagona) in Ecuador. Revista Plant Disease.
84(2): 190.
Quillay N. 2011. Determinación de la capacidad
embriogénica de babaco (Vasconcellea x
heilbornii) a partir de óvulos y hojas multiplicadas
in vitro vía embriogénesis somática. Tesis de
Magister en Gestión de la Producción de Flores
y Frutas Andinas para Exportación. Facultad de
Ingeniería Agronómica, Universidad Técnica de
Ambato. Ecuador. 114 p.
Rojas-Triviño, A. 2011. Conceptos y Práctica de
Microbiología General. Editorial: Universidad
Nacional de Colombia Sede Palmira, Colombia.
161 p
Scheldeman X. 2002. Distribution and potential of
Cherimoya (Annona cherimola Mill.) and highland
papayas (Vasconcellea spp.) in Ecuador. Thesis
of Doctor in Applied Biological Sciences. Faculty
of Agricultural and Applied Biological Sciences.
Ghent University, Belgium. 190 p.
Sigarroa A. 2006. BIOMETRÍA Y DISEÑO
EXPERIMENTAL; Primera Parte.
Uzcátegui C. 2007. Estudio de factibilidad para la
implementación de una empresa dedicada a la
industrialización del babaco. Tesis de Ingeniería
Empresarial. Escuela Politécnica Nacional,
Ecuador. 185 p.