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Producción de etanol a partir de jugos henequén (Agave fourcroydes
Lem.) y melaza por una mezcla de dos levaduras
Resumen
En el proceso de fermentación de henequén (Agave fourcroydes Lem.) Se estudió
el jugo de hojas, complementado con melaza industrial, el uso de un inóculo
compuesto de dos levaduras: Kluyveromyces marxianus (aislado de la planta de
henequén) y Saccharomyces cerevisiae (cepa comercial). Se obtuvo una
producción de etanol de 5,22 ± 1,087% v / v. Contrario a lo esperado, se observó
una disminución en la producción de etanol con el uso de la cepa K. marxianus.
Los mejores resultados se obtuvieron cuando una mezcla de 25% K. marxianus y
el 75% de S. cerevisiae o S. cerevisiae se usaron con una concentración del
inóculo
inicial
de
3 x 107 células mL-1. Además, fue posible detectar una concentración final de
aproximadamente
2
4 g L-1de azúcares reductores que no son metabolizados por las levaduras para la
producción de etanol. Estos resultados muestran que aunque el uso de una
mezcla de levaduras puede ser de interés para la producción de bebidas
alcohólicas, puede ser lo contrario en el caso de la producción de etanol para uso
industrial donde la manipulación de dos cepas puede elevar los costos de
producción.
1. Introducción
El etanol es uno de los combustibles más importantes de fuentes renovables que
se encuentran actualmente en la producción a precios competitivos. En Brasil, se
obtiene de la caña de azúcar y en los EE.UU. a partir del maíz. Sin embargo, la
producción actual no es suficiente para satisfacer la demanda de energía. Otra
estrategia consiste en el uso de residuos agrícolas con alto contenido de celulosa
y lignina (Olsson et al., 2001; Zacchi et al., 2006). Sin embargo, estos procesos
tienen una desventaja en que requieren un paso adicional que es la sacarificación
de los materiales lignocelulósicos, una etapa más difícil que la utilización directa
de la sacarosa, como en el caso de la caña de azúcar o la sacarificación del
almidón de maíz. Para la producción de etanol como una bebida alcohólica, varias
materias primas han sido explotadas durante siglos, incluyendo los agaves, que en
México se han utilizado para producir bebidas fermentadas y Tequila. En la región
de Yucatán, una especie de agave ya ha sido objeto de uso industrial y también se
puede utilizar para producir etanol. Henequén (Agave forucroydes Lem.) Es una
planta perteneciente a la familia Agavacea la cual pertenece a la región norte de la
península de Yucatán y ha sido utilizada desde la época maya, para obtener fibras
naturales de sus hojas. Este cultivo ha contribuido a la importancia económica de
la región a comienzos del siglo 20, pero su explotación industrial comenzó a
declinar en la década de 1980 con el advenimiento de las fibras sintéticas.
Todavía
se
cultivan hoy en día con una producción de 5000 toneladas de fibra en el año 2005.
Para lograr esta producción, se procesaron aproximadamente 250 millones de
hojas, produciendo casi 75 millones de litros de un jugo verde esmeralda irritante
que contiene metabolitos comunes a los Agavaceas (Blunden et al., 1986; Ding et
al., 1989; Sánchez-Marroquín y Hope, 1953). Este jugo ha sido objeto de
anteriores estudios debido a su contenido de saponina esteroideos (principalmente
heconin y tigonin) y azúcares (producción de alcohol). Su composición química
se muestra en la Tabla 1. Los azúcares que pueden ser convertidos en etanol de
henequén provienen de polímeros de fructosa con una molécula de glucosa
terminal conocida como la inulina y oligofructans y que han sido estudiadas en el
agave tequilero (López et al., 2003) y más recientemente en henequén (GarcíaAlbornoz, 2006). Larqué et al. (2004) patentó un proceso de obtención de etanol a
partir del jugo del tallo y de las hojas de esta planta, en la que se determinaron los
parámetros del proceso de fermentación. En su investigación, sólo se utilizó una
levadura (Saccharomyces cerevisiae). Otras levaduras se han aislado de la planta
y estudiado para determinar la producción de alcohol de cada una (datos no
publicados). Entre estas levaduras, una cepa de Kluyveromyces marxianus
(denominada CICY-Ki) dio mayores rendimientos (1,45 g L-1 h-1; Tzec-Gamboa, M.
Sc., Tesis, 2006). Esta levadura es conocida por su resistencia a las altas
temperaturas y su producción de alcohol (Gough et al., 1996; Kourkoutas et al.,
2002) además de ser una fuente importante de proteínas (Ala et al., 2003).
TABLA 1
Composición química del jugo de hojas de henequén
Se han comunicado casos en la literatura sobre el uso de co-cultivos para mejorar
la fermentación y llevar a cabo dos o más transformaciones en un solo paso
(Abouzied
y
Reddy,
1987).
En la industria de las bebidas alcohólicas, el uso de levaduras autóctonas se
considera más deseable ya que se adaptan a los sustratos y por lo general
producen metabolitos secundarios que son responsables del aroma y el sabor de
la bebida, aunque los rendimientos suelen ser muy bajos (Fleet, 2003; Cedeño-
Cruz, 1995). Con henequén, aunque la producción de alcohol a partir de los tallos
para derivar en una bebida es comercialmente explotable, sin embargo, esto no es
el caso para la producción de etanol como combustible. En investigaciones
anteriores llevadas a cabo por nuestro grupo, se encontró que la producción de
etanol obtenida a partir de jugo de las hojas fue relativamente baja, 2,72% v / v
(Volumen de etanol por volumen de caldo de fermentación) cuando la
fermentación se realizó con CICY-Ki, en comparación con 6-8% obtenidos en la
industria azucarera mexicana, donde las fermentaciones se llevan a cabo con la
levadura
S.
cerevisiae
y
melaza
como
sustrato.
Cuando S. cerevisiae se utilizó para fermentar el jugo de hoja de henequén, se
obtuvo una producción de etanol de 4-5% v / v. Con estos datos preliminares se
propuso una mezcla de estas levaduras para mejorar los rendimientos. También
fue posible determinar que el jugo de las hojas de henequén contiene azúcares
que pueden ser metabolizadas para producir alcohol, pero sin la concentración
suficiente para obtener rendimientos aceptables, por lo tanto, se añadieron
melazas industriales. Por lo tanto, las materias primas para la producción de
etanol como combustible son dos residuos industriales: jugo de la hoja de
henequén producida por la industria de fibras naturales y la melaza producida por
la
industria
azucarera.
2. Métodos
2.1. Extracción del jugo de henequén
Para obtener el jugo, las hojas de henequén se recolectaron de las instalaciones
de producción en el municipio de Baca, en el estado de Yucatán. En el laboratorio,
las hojas se lavaron y se extrajo el jugo haciéndolos pasar por un molino de tres
masas en el que las hojas se prensan. Se obtuvo un jugo verde esmeralda el cual
después se filtró para eliminar los sólidos en suspensión. Se midió la cantidad de
sólidos solubles y azúcares reductores. Posteriormente, el jugo se esterilizó a 121
º C durante 1 hora a una presión de 1 atm para hidrolizar parcialmente la inulina.
2.2. Cepas de levadura
La levadura CICY-Ki fue aislada de la base de la hoja de henequén siguiendo los
procedimientos clásicos microbiológicos y fue después caracterizada por pruebas
fenotípicas y moleculares (Pérez-Brito et al., 2007). La levadura S. cerevisiae se
obtuvo en un almacén comercial (marca Safoeno Safmex SA de CV, México).
Ambas levaduras se cultivaron en placas de Petri, en YPGA medio que contiene:
glucosa (20 g L-1), extracto de levadura (5 g L-1), peptina (10 g L-1) y agar (20 g L-1)
y se incubaron a 35 ± 2 º C en la oscuridad. Los cultivos se recolectaron en agua
estéril y se mantuvieron a 4 º C hasta su uso. Se midieron la concentración y la
viabilidad de las suspensiones celulares (Por tinción (teñir) con azul de metileno).
2.3. Preparación del inóculo
Con el uso de inóculos mezclados, los porcentajes de la proporción CicyKi/Saccharomyces se ajustaron a 0 / 100, 25/75, 50/50, 75/25 y 100 / 0 de cada
cepa, manteniendo la misma concentración inicial de 3x 107 ml de células mL-1 en
cada caso. El volumen de inóculo fue de 200 ml, y el medio se preparó de la
misma forma que los sustratos de las fermentaciones correspondientes. Los
inóculos se incubaron a 35 ± 2 º C en la oscuridad y a 200 rpm durante 24 h.
2.4. Condiciones de fermentación
Las fermentaciones se realizaron en frascos de vidrio con un volumen de trabajo
de 2 L (incluido el inóculo). El sustrato compuesto por el jugo de las hojas de
henequén hidrolizado diluido al 6, 8 y 10 grados Brix (ºBx) con agua destilada. La
escala Brix se utiliza en la industria del azúcar y de elaboración de vino para
indicar el porcentaje de azúcar en peso en una solución, en nuestro caso los
sólidos solubles presentes en el jugo de henequén no eran sólo azúcares, sino
también otros compuestos aún no identificados (Ácidos orgánicos, saponinas,
entre otros). Era necesario diluir el jugo a medida que la concentración de sólidos
solubles varía entre 6 y 12 ºBx aproximadamente según la época del año.
(En experimentos preliminares se encontró que 12 ºBx tiene el máximo de sólidos
solubles obtenidos en el jugo de henequén de la hoja.) Con el fin de establecer
una concentración constante inicial de sólidos solubles, las tres diluciones se
complementaron con melaza industrial hasta que se alcanzó 12 ºBx en todos los
casos. Se agregó sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a una
concentración de 1,5 g L-1. El pH no se ajustó pero se midió como el jugo de
henequén siempre tiene un valor de pH de 4,7 ± 0,2. Después de la inoculación,
las fermentaciones se incubaron a 35 ± 2 º C en la oscuridad, sin agitación, y se
tomaron
muestras
cada 12 h para vigilar la evolución del proceso de fermentación.
La concentración de sólidos solubles de las muestras se midió cada 12 h, y los
azúcares reductores se analizaron tanto en el inicio como en la finalización de la
fermentación. Los experimentos anteriores confirmaron que la concentración de
sólidos
solubles
se
estabiliza
en
su
punto
más
bajo
entre 46 y 48 h, y la formación de espuma también cesa en este punto.
Nuestras fermentaciones se realizaron durante un período de 48 h.
2.5. Destilación fraccionada
Este proceso se realizó a presión atmosférica usando una columna Vigreux. Tres
fracciones fueron recogidas. La primera correspondiente a los compuestos
obtenidos a temperaturas comprendidas entre 45 y 77 º C, esto se llamó la
cabeza. La segunda fracción se llamó cuerpo y se recogió a temperaturas entre 78
y 85 º C. Por último, la tercera fracción se llamaba cola y se recogió entre 89 y 95 º
C. Los volúmenes de cada fracción se registraron.
2.6. Los métodos de análisis
La concentración de sólidos solubles (ºBx) se determinó con un refractómetro
portátil (Cole-Palmer). Los azúcares reductores fueron analizados por el método
DNS (Miller, 1959). Este método colorimétrico prueba para detectar la presencia
del grupo carbonilo libre (C=O) en la molécula de carbohidratos. Esto implica la
oxidación del aldehído o un grupo funcional de cetona y el ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS) se reduce a 3-amino, 5 nitrosalicylic bajo condiciones
alcalinas. Las concentraciones de azúcares reductores se calcularon utilizando
una curva de calibración y leyendo la absorbancia de las muestras a 550 nm. La
concentración de etanol se determinó para todas las fracciones recogidas de la
destilación por el método del dicromato (Williams y Reese, 1950). Este método de
oxidación química está basado en la oxidación completa del etanol por dicromato
en la presencia de ácido sulfúrico con la formación de ácido acético. Dicromato
(Cr2O7-2) es de color amarillento y el producto crómico reducido (Cr + + +) es de
color verde intenso. Se hizo una curva de calibración con etanol puro a diferentes
concentraciones
y
la
absorbancia
de
las muestras se leyó a 490 nm. La producción (rendimiento) de etanol se calculó
como el porcentaje (v / v) de etanol presente en el cuerpo fracción por volumen de
caldo
de
fermentación.
2.7. Análisis estadístico
Todas las fermentaciones se realizaron por triplicado y los resultados se
expresaron como media ± desviación estándar. El programa estadístico SAS (SAS
Institute, 1985, SAS guía de usuario: Estadísticas, versión 5 ed. Gary, NC) fue
utilizado para analizar los datos experimentales. Los valores con la misma letra no
son significativamente diferentes (p <0,05) de acuerdo a la prueba de rango
múltiple de Duncan.
3. Resultados y discusiones
3.1 Preparación del sustrato
De una cosecha realizada en enero, se obtuvo un jugo de hoja de henequén pura
con un contenido de sólidos solubles, de 9 ºBx y pH 4.5. Después de la
esterilización, el jugo se diluyó a 6-8 ºBx con agua destilada. Cada una de las
diluciones se complementó con melaza industrial hasta 12 ºBx. Para la tercera
serie de experimentos, se usó el jugo de hojas de henequén recolectadas en
septiembre; se obtuvo un jugo puro con un contenido de sólidos solubles de 12
ºBx y pH 4,5. Después de la esterilización, esta se diluyó a 10 ºBx con agua
destilada
y
se
completó
con
melaza
hasta 12 ºBx.
3.2. Consumo de azúcar
Las diluciones a 6-8 ºBx, suplementado con melaza hasta 12 ºBx, no mostró
diferencias significativas en el consumo de azúcar, por lo tanto, sólo se presentan
los
resultados
de
la
dilución
de
8-10
ºBx.
La reducción de azúcares y sólidos solubles, antes y después de la fermentación
de los jugos diluidos a 8-10 ºBx se muestran en la tabla 2. Las concentraciones
iniciales de azúcares reductoras variaron entre experimentos debido a las
diluciones hechas al jugo de henequén. Estos se realizaron con el fin de simular la
influencia de las variaciones climáticas (Épocas de lluvia o en seco) en el jugo
extraído de las hojas durante el año. Las hojas se cortan de la planta para la
obtención de fibras naturales como el principal producto tres veces al año. La
cosecha se realiza a intervalos regulares pero en diferentes campos de cultivo
para lograr una producción constante de fibra durante el año. En estudios
anteriores, se pudo confirmar que el jugo procedente del proceso se diluyó durante
la estación de lluvias y se concentró más durante la estación seca. Después de
48 h, al término de la fermentación en ambas series de experimentos, las bajas
concentraciones de azúcares reductores se mantuvieron, las cuales no fueron
metabolizadas por las levaduras. Los demás azúcares presentes en el jugo de
henequén son xilosa, rafinosa y arabinosa (datos no publicados).
En el jugo diluido a 10 °Brix se determinó una mayor producción de etanol con los
inóculos con safoeno.
TABLA 2
Cambios en sólidos solubles y azúcares reductoras durante la fermentación de jugo de henequén
Las fermentaciones se llevaron a cabo a 4,7 ± 0,2 pH inicial; 35 ± 2 ° C de temperatura durante 48
h. A: jugo diluido a 8 ºBx y completada con melaza hasta 12 ºBx. B: El jugo diluido a 10 ºBx y
complementado con melaza de hasta 12 ºBx. Los sólidos solubles y azúcares reductores son los
valores medios ± DE (n = 3). El símbolo “ indica el mismo valor en la columna.
TABLA 3
Datos del etanol para las tres fracciones recogidas después de la destilación y la
producción de etanol a partir de los resultados de la fracción del cuerpo
A: jugo diluido a 8 ºBx y complementado con la melaza hasta 12 ºBx. B: El jugo diluido a 10 ºBx y
complementado con la melaza hasta 12 ºBx. Se recogieron fracciones cabeza a temperaturas que
oscilan entre 45 y 77ºC, las fracciones cuerpo a 78-85 ºC y fracciones de cola a 89-95 ºC. El
volumen y concentración de etanol son los valores medios ± DE (n = 3).
1 La producción de etanol se calculó como mililitro de etanol producido por cada 100 ml de caldo de
fermentación.
2 En la columna de producción de etanol, los medios con la misma letra no son significativamente
diferentes.
3.3. Producción de etanol
El volumen y la concentración de etanol de las fracciones recogidas
durante la destilación de los caldos fermentados se muestran en la Tabla
3. Como era de esperar, las fracciones del cuerpo presentan los mayores
volúmenes entre las tres fracciones. Las concentraciones de etanol fueron
mayores para las fracciones de la cabeza del cuerpo. La producción de etanol
para la serie de experimentos con jugo diluido a 8-10º Bx y complementada
con melaza hasta 12º Bx se muestran en la Tabla 3. En el caso de
jugo diluido al 8º Bx y se complementado con melaza hasta
12º Bx, las fermentaciones con diferentes tasas de levaduras no mostraron
diferencias significativas. Con el jugo diluido a 10º Bx, fue posible
observar un efecto positivo en la producción de etanol mediante el uso
de Saccharomyces en la mezcla de la levadura o solo. El análisis estadístico
resultó en dos grupos. Un grupo con mayor producción de etanol
se obtuvo mediante la utilización de un 25% CICY-Ki y 75% de Saccharomyces o
Saccharomyces solo. El otro grupo fue una baja producción de etanol
formado por los tratamientos con proporciones de 50% de cerevisiae
o
inferior
y
CICY-Ki.
Esto
indica
que
el
uso
de
CICY-Ki no es necesario para mejorar la producción de etanol. Cuando
la levadura Saccharomyces se utiliza sola, el consumo de azúcar era
lento al principio, sin embargo, después de 24 h de fermentación, el consumo
fue rápido, lo que indica que cerevisiae tiene una dase de adaptación más larga
que el CICY-Ki, cuando se utiliza para fermentar el jugo de henequén. Este
comportamiento también se observó en estudios llevados a cabo durante el
aislamiento de diferentes levaduras de la planta de henequén (Tzec-Gamboa,
2006). CICY-Ki tiene una fase de adaptación más corta, ya que es autóctono
a la planta de henequén y ya está adaptado al ambiente
.
Al término de todas las fermentaciones con jugo de henequén y
melaza, los contenidos de residuos sólidos solubles fueron similares en el
final de las fermentaciones lo que indica que la contribución de los
azúcares es menos importante para esta variable que otra materia soluble
presente en el jugo. Para azúcares reductores, se observó un fenómeno
interesante. Como se muestra en las tablas 2 y 3, cuando el jugo de henequén
era
más
concentrado
(10º
Bx
complementado
con
melaza
hasta 12º Bx), la presencia de 50% o más de la levadura CICY-Ki
causó una caída en la producción de etanol, aunque el consumo
de
azúcares
reductores
fue
el
mismo.
Esto
sugeriría
que
los azúcares son utilizados por el CICY-Ki en otras vías metabólicas
que la producción de etanol.
4. Conclusiones
La medición del contenido de sólidos solubles demostró ser una técnica rápida y
fiable para determinar el progreso y la realización del proceso de fermentación.
Aunque el jugo de la hoja de henequén debe ser complementado con otras
fuentes de carbohidratos, la cantidad de jugo producido por la industria de la fibra
podría justificar su uso en la producción de etanol para la industria. Esto es tanto
más si se toma en cuenta que la industria del tequila produce cantidades aún
mayores de hojas A. tequilana, que en la actualidad, no se procesan
sino que representan una fuente potencial del etanol. Lo mismo
podría aplicarse a otros países como Brasil y Tanzania que producen fibras
naturales de agaves. Se requieren más estudios para determinar que azúcares
están presentes en la mezcla de jugo de henequén - melaza y cómo son
metabolizados en forma individual, así como un análisis de la composición de
fracciones destiladas con el fin de determinar la producción de otros compuestos y
caracterizar en más detalle todo el proceso. Se necesitan más experimentos para
mejorar la producción de etanol, tales como el uso de sustratos más concentrados,
el aislamiento de levaduras nuevas de henequén, hidrólisis enzimática de la
inulina y el uso del jugo de la hoja directamente de las fábricas en lugar de obtener
el jugo a escala de laboratorio.