Download DOSIFICACIONA ADENOSIN DEAMINASA (ADA)

CUANTIFICACIÓN DE ADENOSIN DESAMINASA (ADA)
PROTOCOLO ADA
FUNDAMENTO DEL METODO:
La adenosindesaminasa (ADA) es una enzima del catabolismo de las purinas que
cataliza la conversión de la adenosina en inosina liberando amoníaco en el proceso.
Se distribuye en todo el organismo, principalmente en el tejido linfoide y aumenta
según el grado de diferenciación de los linfocitos, es por eso que en los derrames
serosos de etiología tuberculosa la actividad de la ADA se encuentra elevada.
Definición de 1 unidad de ADA:
1 unidad de ADA corresponde a 3 mmoles de amonio, liberada en la mezcla de la
reacción incubada a 37°C por una hora.
1U ADA---------------3 mmol amonio
50U--------------------150 mmol.
Técnica colorimétrica de Guisti para cuantificación de ADA.
El fundamento de la reacción consiste en incubar el líquido pleural problema con una
solución de adenosina, luego de 60 minutos de incubación se hace reaccionar el
amoníaco formado con el hipoclorito sódico y el fenol en medio alcalino para formar
indofenol compuesto de color azul cuya densidad óptica se mide a 628nm.
El catalizador de la reacción es el nitroprusiato sódico. Una solución de fenol
nitroprusiato es utilizada para detener la reacción que cataliza el ADA (método de
Berthelot modificado).
ADENOSINA + AGUA
ADA
AMONIACO + OCL- + FENOL
INOSINA + AMONIACO
OH
INDOFENOL
Na2[Fe(CN)5NO]
MUESTRA
El líquido debe ser límpido, transportado lo más pronto posible al laboratorio.
Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm, para la determinación enzimática usar el
sobrenadante. Si no se va a realizar la determinación de la enzima ese mismo día
conservarlo entre 2 y 8 º C.
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NO congelar el líquido sin centrifugar, ya que los leucocitos poseen ADA, que una vez
liberada en el líquido por congelación y descongelación pueden producir resultados
falsamente altos.
No deben procesarse muestras hemolizadas, turbias u opalescentes.Es posible
centrifugar las muestras y si se obtiene sobrenadante límpido puede procesarse, si
continúa turbio el sobrenadante no debe realizarse la cuantificación de ADA.
MATERIALES
 tubos de 15 ml
 tubos de 50 ml
 balanza de precisión
 espectrofotómetro digital
 pipeta automática 25 ul
 pipeta automática 500 ul
 3 pipetas de 1, 2 y 10 ml
 punteros 25ul y 500 ul

matraces

probetas
 agua destilada 200ml
 buffer fosfato 1x
 standard de reacción
 adenosina
 nitroprusiato de sodio (Reactivo A)
 hipoclorito alcalino (Reactivo B)
 pescadera
 marcador
 reloj o timer
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PREPARACION DE REACTIVOS
Estos reactivos se pueden preparar y guardar
 BUFFER FOSFATO 50 Nm PH 6.5
PO4 H2 Na . 2 H2O ------------- 2,365 g
PO4 H Na2 . 1 2 H2O ----------- 2,810 g
Autoclavar 120°C 15
minutos
H2O DESTILADA --------------- 500 ml
Prepara 5 x (100 ml de agua) para conservar mejor.
Guardar en heladera.
 SOLUCION STANDARD DE SULFATO DE AMONIO 15mM (madre)
SO4 (NH4)2 ----------------------- 1,982 g
H2O DESTILADA --------------- 1000 ml
Estable en heladera por 2 años.
 SOLUCION DE TRABAJO DE SULFATO DE AMONIO (STANDARD DE REACCIÓN)
SO4 (NH4)2
0,075 Nm
(0,15 Nm) = 50 UI
 0,5 ml de la solución madre en 100 ml de buffer fosfato 1 X
Estable en heladera por 2 meses.
Reactivos que se preparan en el momento de procesar las muestras
 SOLUCIÓN DE ADENOSINA
Preparar en el momento, la cantidad necesaria de acuerdo al número de muestras
que va a procesar.
Pese la cantidad de adenosina indicada, en un tubo coloque la cantidad de buffer
necesario y agregue la adenosina.
Homogeinize bien, ponerla unos minutos en el baño de agua a 37ºC para que la
disolución sea completa.
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Nro. De muestras
ADENOSINA mg
Buffer fosfato ml
1
11.2
2
2
16.8
3
3
22.4
4
4
28.0
5
5
33.6
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PROCEDIMIENTO

Usar siempre tubos nuevos y procesar cada muestra por duplicado

Rotular los tubos blanco de reactivo (BR), standard (STD), blanco de adenosina
(BA), muestra 1 (M1), muestra 1 duplicado (M1d), blanco de muestra 1 (BM1), M2,
M2d, BM2, etc.

Agregar a los tubos M y Md 500 ul de la solución de adenosina, luego agregar 25 ul de
muestra y ponerlos en el baño de agua a 37º C durante 60 minutos.
Blanco de
reactivo
Buffer
fosfato 1x
Standard
Blanco de
muestra
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Muestra

Muestra
0.5 ml
Solución de
adenosina
Standard
Blanco de
adenosina
25 ul
25 ul
Prender el espectrofotómetro para estabilizar el equipo.
 REACTIVOS DE “UREA COLOR ” (nitroprusiato de sodio , hipoclorito de sodio )
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
Prepare la solución A y B del reactivo colorimétrico de urea (método ureasa)
diluídos al 1/5, 1 parte de reactivo A de “Urea color 2 R” concentrado + 4 partes de
agua destilada y 1 parte de reactivo B de “Urea color 2 R” + 4 partes de agua
destilada.

Retire los tubos del baño y agregue para Interrumpir la reacción a cada tubo 500 ul
de la solución de reactivo A y 500 ul de la solución de reactivo B.
Blanco de
reactivo
SoluciónA
nitroprusiato
de sodio
Solución B
hipoclorito
alcalino
Standard
Blanco de
adenosina
Blanco de
muestra
Muestra
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml

Homogeneizar y poner los tubos en el baño de agua a37º C durante 10 minutos,

Medir la absorbancia de todos los tubos a 628 nm de longitud de onda.

Es conveniente medir la absorbancia en el siguiente orden: blanco de adenosina, blanco de
reactivo, standard, blanco de control negativo, control negativo, blanco de control
positivo, control positivo y luego las muestras.
CÁLCULOS
B = DO blanco adenosina – DO blanco reactivo
C = DO stdandard – DO blanco reactivo
Actividad ADA (U/l a 37°C) = (A – B) / C X 50
Realizar los cálculos con la absorbancia de la muestra y también con la
absorbancia del duplicado.
Se acepta un coeficiente de variación de hasta un 7 % entre la muestra y su
duplicado expresado en U/l.
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En el caso que la absorbancia de alguna muestra exceda el rango de linealidad al
cuantificarla con el espectrofotómetro, repetir la determinación diluyendo la
muestra 1:2 en buffer.
RESULTADOS ESPERADOS
Blanco de adenosina: 0,015-0,035
Blanco de reactivo: 0,020-0,040
Standard: 0,450- 0,520
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
TIPO DE MUESTRA
Líquido Pleural
Líquido Pericárdico
Líquido peritoneal
LCR
PUNTO DE CORTE
Positivo>40 UI/l
Positivo>40 UI/l
Positivo>40 UI/l
Positivo >9,6UI/l
Informe de los resultados :
Liquídos pleural, pericárdico y peritoneal < 40 UI/l: Negativo
Liquídos pleural, pericárdico y peritoneal > 40 UI /l Positivo. Entrecruzamiento con
otras patologías linfomas, mesoteliomas.etc
Liquídos pleural, pericárdico y peritoneal > 70 UI /l Positivo .Altamente sugestivo
de etiología tuberculosa.
Liquido cefálorraquídeo > 9, 6 UI/l Positivo
Liquido cefálorraquídeo < 9, 6 UI/l Negativo
CONTROLES DE LA TÉCNICA
 CONTROL POSITIVO: Se usan muestras de: un líquido pleural con un resultado
mayor de 70 U/l de ADA, un líquido pleural con un resultado mayor de 40 U/l
de ADA.
Alicuotarlo en tubos eppendorf, mantenerlos congelados a – 20 ºC y el día
antes de su uso guardarlos en heladera entre 2 – 8 °C.
 CONTROL NEGATIVO: usar un líquido que haya dado menor a 20 U/l de ADA
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Identificarlos como control CP y CN, es conveniente también agregar el valor en
unidades de ADA de cada control para saber si el coeficiente de variación está
dentro del rango aceptable.
CALIBRACIÓN DE LA TÉCNICA
A partir de una concentración conocida se realizan diluciones para obtener:
Tubo 1
150 UI/l
10 ml de buffer fosfato + 150 ul sol madre.
Tubo 2
75 UI/l
Tubo 3
37,5 UI/l
Tubo 4
18.75 UI/l
Tubo 5
9.3 UI/l
Tubo 6
4.6 UI/l
Rotular los tubos, colocar en el tubo 1: 10 ml de buffer fosfato + 150 ul sol madre.
Homogeneizar bien.
Colocar en el resto de los tubos 5 ml de buffer fosfato y realizar diluciones al ½ a partir
del primer tubo. Transferir 5 ml del tubo 1 al 2, homogenizar, y así sucesivamente
hasta el tubo 6 y descartar 5 ml finales.
De cada tubo extraer 500ul , poner en un tubo rotulado 1,2 .......6 y poner en baño de
agua a 37ºC durante 1 hora.
Agregar a cada tubo 500 ul de reactivo A y 500 ul de reactivo B (diluídos al 1/5 con
agua destilada, preparado en el momento)
Incubar a 37ºC durante 10 minutos.
Leer la absorbancia en espectrofotómetro a 628nm y luego se grafica DO y UI/l para
ver la linealidad de la técnica y corroborar que la DO de Standard de reacción
corresponda a 50 U/l de ADA.
Graficar los resultados, densidad óptica en función de unidades de ADA.
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