Download TESIS DE MAESTRIA PARTE 1 FINAL CORRGIDA BERNAL JOSE

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO
EFECTOS DE LA EXPOSICIÓN A NAPROXENO EN
CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO CULTIVADAS IN
VITRO.
Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa
de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología y Química
Clínica para optar al grado y título de Maestría Académica en
Microbiología
BERNAL GERARDO GARRO MORA
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica
2012
DEDICATORIA
Dedicado a María Aurora Arguedas Bermúdez (1928-1989).
ii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco sincera y eternamente a las siguientes personas e instituciones:
Dres. José Bonilla
Cecilia Díaz
y Walter Marín, por su apoyo, guía,
consejo y valiosa asesoría a lo largo de este proyecto de investigación.
Dr. Isaac Waserstein, Presidente de Laboratorios Stein, por su invaluable
colaboración y su altruismo al estimular la investigación en pro de la salud
humana.
Dr. Jorge Nieto, formulador del excipiente del Pronol D, por sus
invaluables comentarios, interés y ayuda en el proceso.
Licda. Ethel Sánchez, investigadora del CIEMIC, por su consejo y guía en
los estudios de microscopia electrónica de transmisión.
Al Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas
(CONICIT), por honrarme al elegirme su becario para cursar el posgrado.
Al personal del Departamento de Bioquímica de la Escuela de Medicina de
la Universidad de Costa Rica, por su apoyo en este proceso.
iii
"Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de
Posgrado en Microbiología, Parasitología y Química Clínica de la
Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y
título de Maestría Académica en Microbiología."
____________________________
Dr. Rodrigo Mora Rodríguez
Representante de la Decana
Sistema de Estudios de Postgrado
____________________________
Dr. José Bonilla Vargas
Director de Tesis
____________________________
Dra. Cecilia Díaz Oreiro
Asesora
____________________________
Dr. Walter Marín Méndez
Asesor
____________________________
MSc. Laya Hun Opfer
Directora
Programa de Postgrado en Microbiología
_____________________________
Bernal Gerardo Garro Mora
Candidato
iv
CONTENIDO
DEDICATORIA
ii
AGRADECIMIENTOS
iii
APROBACION DEL COMITÉ ASESOR
iv
RESUMEN
viii
ABSTRACT
ix
LISTA DE FIGURAS
x
LISTA DE ABREVIATURAS
xiv
1. INTRODUCCIÓN
1
1.1.
EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER EN COSTA RICA
1.2.
NAPROXENO: CARACTERÍSTICAS ESTUDIOS PREVIOS
1.2.1. Naproxeno
1.2.2. Estudios previos in vivo
1.3.
JUSTIFICACIÓN
2
5
5
7
13
2. OBJETIVOS
15
2.1.
2.2.
15
15
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
16
3.1.
CÁNCER Y QUIMIOPREVENCIÓN
3.2.
MELANOMA Y LÍNEA SK MEL-2
3.2.1. Melanoma
3.2.2. Melanoma de la línea SK MEL-2
3.3.
ENZIMAS DE FASE I Y II
16
20
20
22
23
3.4.
EL ELEMENTO ARE Y LA VIA DEL NRF2
24
3.5.
NAD(P)H: QUINONA OXIDOREDUCTASA
30
3.6.
INDUCCIÓN DE MUERTE CELULAR: CITOTOXICIDAD
31
3.7.
PAPEL BIOLÓGICO DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL
ALFA
32
4. MATERIALES Y MÉTODOS
39
4.1.
LÍNEAS CELULARES
40
4.1.1. Melanoma humano (línea SK MEL-2)
40
4.1.2. Leucemia mieloidea crónica humana (línea K562)
40
4.2.
TÉCNICA DE CULTIVO DE CÉLULAS TUMORALES
41
4.3.
INDUCCIÓN DE LA ENZIMA NAD(P)H. QUINONA
42
4.3.1. Cultivo y exposición a naproxeno
42
4.3.2. Lisis y evaluación de la actividad de la QR
42
4.4.
EVALUACIÓN DE LAS ALTERACIONES ULTRESTRUCTURALES
MEDIANTE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 43
4.5.
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR EN PRESENCIA DE
NAPROXENO Y TNF HUMANO
43
4.6.
ANALISIS DE LA INDUCCIÓN DE MUERTE CELULAR Y
EFECTOS SOBRE LA PROLIFERACIÓN MELANÓMICA IN VITRO 44
4.6.1. Citotoxicidad de células tumorales expuestas a naproxeno
44
4.6.2. Evaluación del efecto del naproxeno en la proliferación de células de
melanoma humano
45
4.7.
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
45
5. RESULTADOS
47
5.1.
EL NAPROXENO INDUCE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA
NAD(P)H: QUINONA OXIDOREDUCTASA EN CÉLULAS DE
MELANOMA HUMANO CULTIVADAS IN VITRO
47
5.2.
EL NAPROXENO INDUCE ALTERACIONES
ULTRAESTRUCTURALES EN CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELOIDE
CRÓNICA HUMANA CULTIVADAS IN VITRO
52
5.3.
EL NAPROXENO INDUCE ALTERACIONES
ULTRAESTRUCTURALES EN CÉLULAS DE MELANOMA MALIGNO
HUMANO CULTIVADAS IN VITRO
58
5.4.
EL NAPROXENO REDUCE LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA EN
CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO CULTIVADAS IN VITRO
69
5.5.
EL NAPROXENO INDUCE MUERTE CELULAR IN VITRO EN LAS
LÍNEAS SK MEL-2 Y K562. ESTA ACTIVIDAD NO ES AUMENTADA POR
LA PRESENCIA DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA
HUMANO. EL TNF HUMANO INDUCE CITOTOXICIDAD EN LAS
CÉLULAS MELANÓMICAS CULTIVADAS IN VITRO
76
6. DISCUSIÓN
82
vi
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
106
7.1.
7.2.
106
107
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
109
vii
RESUMEN
Células de líneas humanas SKMEL-2 y K562 fueron expuestas in vitro a diferentes
concentraciones de naproxeno, para determinar los efectos del antinflamatorio
sobre las mismas. El fármaco fue disuelto en dimetil-sulfóxido (y en un vehículo
acuoso de uso tópico utilizado en estudios previos, desarrollado por Laboratorios
Stein, Costa Rica). Estudios preliminares in vivo utilizaron un modelo murino y
demostraron que el naproxeno posee propiedades terapéuticas en el tratamiento y
prevención de lesiones cutáneas y tumores causados por exposición a luz
ultravioleta y que es capaz de inhibir procesos inflamatorios regulados por la
transcripción de genes promotores de dicha respuesta. Estos resultados, unidos al
reconocimiento de que muchos tipos de cáncer están asociados a la inflamación,
constituyeron el interés por determinar si existe potencial quimioprotector en el
naproxeno, ensayando sus efectos en líneas celulares malignas humanas. Bajo las
condiciones experimentales empleadas, el naproxeno fue capaz de inducir un
aumento en los niveles de expresión de la enzima NADP(H): quinona
oxidoreductasa (NQO-1), en células de melanoma, un marcador bioquímico de la
activación de genes regulados por el factor Nrf2 (el cual reconoce las secuencias de
consenso llamadas ARE). Dichos genes pueden estar inactivos o poseer una
expresión basal disminuida en las células cancerosas y pre-cancerosas y su
estimulación
podría
convertirse
en
una
estrategia
importante
en
la
quimioprotección, para prevenir el cáncer de piel tipo melanoma. El
antinflamatorio ocasionó alteraciones ultraestructurales en ambos tipos celulares
ensayados, incluyendo condensación de cromatina bajo las envolturas nucleares,
generación de vesículas compatibles con el proceso de autofagia, picnosis y otros
cambios, coincidentes con procesos de muerte celular programada tipo I y II.
Además, inhibió la proliferación de células de melanoma e indujo niveles altos de
muerte en células de leucemia mieloidea crónica y en células de melanoma maligno.
El naproxeno no mostró sinergia en la inducción de este tipo de citotoxicidad con el
factor de necrosis tumoral alfa, pero la citoquina elevó los niveles de mortalidad en
los cultivos de células melanómicas (no así en los de células leucémicas).
viii
ABSTRACT
SKMEL-2 and K562 human tumour cell lines were exposed in vitro to different
concentrations of naproxen, in order to determine the effects of the non-steroidal
anti-inflammatory on the tumorigenic cells. The drug was dissolved in dimethylsulfoxide (and in a topical-use aqueous vehicle, used on previous studies and
developed by Stein Laboratories, Costa Rica, for comparison purposes). The
preliminary in vivo studies using a murine model demonstrated naproxen to have
therapeutic properties for the treatment and prevention of skin lesions and
tumours caused by exposition to ultraviolet light and that it is capable to inhibit
inflammatory processes regulated by the transcription of the genes which promote
such an answer. These results, along with the realization that many types of cancer
are associated to inflammation, constitute the basis for the interest to determine
naproxen’s potential as chemopreventor against human malignant cell lines in
vitro. Under the experimental conditions used, naproxen was able to induce an
increase on the expression levels of the enzyme NADP(H): quinone-oxidoreductase
(NQO-1). This enzyme is used as a biochemical marker for the activation of genes
regulated by the Nrf2 factor (which recognizes consensus sequences called ARE)
these genes are either inactive or have a decreased basal level of expression in precancerous and cancer cells, and their stimulation could become a very important
strategy for chemoprevention, to prevent melanoma skin cancer and other kinds of
tumours. The anti-inflammatory caused ultra-structural alterations on both cell
types used, including chromatin condensation under the nuclear envelope,
generation of vesicles compatible with an autophagy process, pyknosis and other
changes, coinciding with programmed cell death processes type I and II.
Furthermore, it inhibited the proliferation of melanoma cells and induced high
levels of cell death on human chronic myeloid leukaemia (line K562) and on human
malignant melanoma cells (line SK-MEL2). Naproxen did not show synergism on
the induction of this kind of cytotoxicity with human tumour necrosis factor alpha,
but the cytokine raised the mortality levels in the melanoma cell cultures (not so on
those of leukaemic cells).
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura molecular del ácido S-6-metoxi-α-metil-2-naftaleneacético o
naproxeno ................................................................................................................... 7
Figura 2. Efectos del naproxeno sobre la estructura histológica y la respuesta
inflamatoria en piel de ratones desnudos irradiados con luz ultravioleta. ......... 11
Figura 3. Efecto protector del naproxeno contra lesiones cutáneas causadas por
irradiación crónica de ratones SKH-1 con UVB (50 mJ/cm2) ............................. 12
Figura 4. Panorama molecular de la inducción de la respuesta apoptótica o de prosobrevivencia celular, estimulada por la unión del TNF a su receptor TNFR-1 .34
Figura 5. Diseño experimental para la determinación de la actividad del ácido S-6metoxi-α-metil-2-naftaleneacético en células de melanoma humano .................. 39
Figura 6. Células de melanoma humano (SK-MEL 2) cultivadas in vitro . ....... 40
Figura 7. Células leucémicas de la línea humana K562 ....................................... 41
Figura 8. Inducción lineal de la NADP(H): quinona oxidoreductasa mediada por
naproxeno medida a lo largo de 5 minutos . .......................................................... 48
Figura 9. Inducción de la NAD(P)H: quinona oxidoreductasa por exposición a
naproxeno en células de melanoma humano (línea SK-MEL 2) tratadas durante 48
horas .......................................................................................................................... 49
x
Figura 10. Inducción de la NAD(P)H: quinona oxidoreductasa por exposición a
naproxeno en formulación tópica (E.T.), en células de melanoma humano (línea
SK-MEL 2) tratadas durante 48 horas .................................................................. 50
Figura 11. Morfología de células control de leucemia mieloidea crónica humana
(línea K562) y células alteradas ultra estructuralmente por exposición a
naproxeno.. ............................................................................................................... 54
Figura 12. Fotomicrografías electrónicas de transmisión que muestran los cambios
morfológicos inducidos por naproxeno 434 mM, en células de leucemia mieloidea
crónica humana.. ...................................................................................................... 55
Figura 13 . Fotomicrografías electrónicas de transmisión de cuerpos separados y
degradados y de restos celulares............................................................................. 56
Figura 14. Alteraciones estructurales inducidas por naproxeno 434 mM en células
de leucemia mieloidea crónica humana tras 24 horas de exposición al fármaco..57
Figura 15. Fotomicrografías electrónicas de transmisión, mostrando la morfología
de células de melanoma maligno humano (SK.MEL 2) intactas (control). ........ 60
Figura 16. Detalles morfológicos de células control de melanoma humano. ...... 61
Figura 17. Fotomicrografía electrónica de transmisión de la superficie apical de
una célula de melanoma humano (control)... ........................................................ 62
Figura 18. Alteraciones en la estructura celular inducidas por naproxeno disuelto
en DMSO al 1%, en células de melanoma maligno expuestas por 24 horas ...... 63
xi
Figura 19. Etapas tardías en el proceso de degradación celular inducido por
naproxeno- DMSO 10%, en células de melanoma maligno humano expuestas al
fármaco por 24 horas. .............................................................................................. 66
Figura 20. Fotomicrografías electrónicas de transmisión de células de melanoma
humano expuestas a naproxeno en excipiente tópico al 1%, durante 24 horas ..67
Figura 21. Daños ultraestructurales y muerte celular inducidos por naproxeno al
10% en vehículo tópico, en células de melanoma expuestas por 24 horas ........ 68
Figura 22. Proliferación clonogénica de células de melanoma humano de la línea
SK-MEL 2..................................................................................................................70
Figura 23. Prueba de proliferación clonogénica para células SK-MEL 2.. .... …71
Figura 24. Prueba de proliferación clonogénica para células en cultivo de
monocapa ................................................................................................................. 72
Figura 25. Aspecto de las colonias……………………………………………….. 73
Figura 26. Proliferación clonogénica de células de melanoma humano luego de ser
expuestas a naproxeno en solvente topico.............................................................. 75
Figura 27. Muerte celular inducida en células de leucemia mieloide crónica
humana (línea K562) por naproxeno 434 mM, en presencia y ausencia del factor de
necrosis tumoral alfa humano.. .............................................................................. 77
Figura 28. Muerte celular inducida en células de leucemia mieloide crónica
humana (línea K562) por naproxeno disuelto en excipiente de uso tópico......... 79
xii
Figura 29. Porcentaje de inducción de muerte celular por exposición a naproxenoDMSO 434 mM, en células de melanoma maligno humano.. .............................. 80
Figura 30. Porcentaje de inducción de muerte celular en células de melanoma
maligno humano expuestas a naproxeno disuelto en excipiente tópico .............. 81
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
AINE (inglés NSAID): fármaco anti-inflamatorio no esteroideo.
ARE: secuencia reguladora de los genes de las enzimas de fase II conocida como
elemento de respuesta antioxidativo.
ATCC: Colección Americana de Tipos de Cultivos celulares (American Type
Culture Collection).
BSA: albúmina de suero bovino.
COXs: ciclooxigenasas.
DMEM: medio de cultivo celular modificado de Dulbecco.
DMSO: dimetil-sulfóxido.
ELISA: análisis in situ ligado a enzima. Entiéndase lector para tal análisis.
EMT6: línea celular de cáncer de seno murino.
FAD: dinucleótido de flavina adenina.
FAS: proteína receptora de la membrana celular, denominada CD95, miembro 6
de la superfamilia de receptores del TNF.
FASL: ligando de FAS.
GHS: glutatión.
GSTP: glutatión-transferasa.
IkB-α: proteína kappa B, polipéptido de unión al NFkB que lo mantiene
secuestrado en el citosol.
IKK-α: proteína quinasa alfa del complejo inhibidor de la IkB.
IKK-β: proteína quinasa beta del complejo inhibidor de la IkB.
K562: línea celular de leucemia mieloide crónica humana.
kDa: kilodalton.
Keap1: proteína tipo 1 Kelch, factor de unión al factor Nrf2, asociada a
microfilamentos de actina.
MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos.
xiv
MET: microscopia electrónica de transmisión.
NF-E2: factor nuclear de transcripción E2, regulador de los genes de la globina en
células hematopoyéticas.
NFkB: factor de transcripción nuclear kappa B. Estimulador de la transcripción de
los genes de escape apoptótico y de la respuesta inflamatoria.
NQO-1: siglas con las que se denomina a la enzima de fase II NAD(P)H: quinona
oxidoreductasa, también conocida como QR.
Nrf2: factor eritroide 2p45, proteína que da nombre a la vía de señalización celular,
responsable de la activación de la transcripción de los genes de las enzimas de fase
II o enzimas anti estrés oxidativo.
PBS: tampón de fosfatos. Solución amortiguadora para cultivo celular.
PGs: prostaglandinas.
PKC: proteína quinasa C.
QR: véase NQO-1.
SFB: suero fetal bovino.
SK-MEL2: línea celular de melanoma humano.
TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa.
TNFR: receptor del factor de necrosis tumoral. Puede ser tipo I o II.
TRAIL: ligando inductor de apoptosis relacionado al TNF.
UDP: uridil-difosfato.
xv
If we knew what we were doing, we would not have called it research, would we?
Albert Einstein
The outcome of any serious research can only be to make two questions grow where
only one grew before.
Thorstein Veblen
xvi