Download TESIS DE MAESTRIA PARTE 1 FINAL CORRGIDA BERNAL JOSE
Document related concepts
no text concepts found
Transcript
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO EFECTOS DE LA EXPOSICIÓN A NAPROXENO EN CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO CULTIVADAS IN VITRO. Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología y Química Clínica para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología BERNAL GERARDO GARRO MORA Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2012 DEDICATORIA Dedicado a María Aurora Arguedas Bermúdez (1928-1989). ii AGRADECIMIENTOS Agradezco sincera y eternamente a las siguientes personas e instituciones: Dres. José Bonilla Cecilia Díaz y Walter Marín, por su apoyo, guía, consejo y valiosa asesoría a lo largo de este proyecto de investigación. Dr. Isaac Waserstein, Presidente de Laboratorios Stein, por su invaluable colaboración y su altruismo al estimular la investigación en pro de la salud humana. Dr. Jorge Nieto, formulador del excipiente del Pronol D, por sus invaluables comentarios, interés y ayuda en el proceso. Licda. Ethel Sánchez, investigadora del CIEMIC, por su consejo y guía en los estudios de microscopia electrónica de transmisión. Al Concejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT), por honrarme al elegirme su becario para cursar el posgrado. Al personal del Departamento de Bioquímica de la Escuela de Medicina de la Universidad de Costa Rica, por su apoyo en este proceso. iii "Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Microbiología, Parasitología y Química Clínica de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Microbiología." ____________________________ Dr. Rodrigo Mora Rodríguez Representante de la Decana Sistema de Estudios de Postgrado ____________________________ Dr. José Bonilla Vargas Director de Tesis ____________________________ Dra. Cecilia Díaz Oreiro Asesora ____________________________ Dr. Walter Marín Méndez Asesor ____________________________ MSc. Laya Hun Opfer Directora Programa de Postgrado en Microbiología _____________________________ Bernal Gerardo Garro Mora Candidato iv CONTENIDO DEDICATORIA ii AGRADECIMIENTOS iii APROBACION DEL COMITÉ ASESOR iv RESUMEN viii ABSTRACT ix LISTA DE FIGURAS x LISTA DE ABREVIATURAS xiv 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER EN COSTA RICA 1.2. NAPROXENO: CARACTERÍSTICAS ESTUDIOS PREVIOS 1.2.1. Naproxeno 1.2.2. Estudios previos in vivo 1.3. JUSTIFICACIÓN 2 5 5 7 13 2. OBJETIVOS 15 2.1. 2.2. 15 15 OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 16 3.1. CÁNCER Y QUIMIOPREVENCIÓN 3.2. MELANOMA Y LÍNEA SK MEL-2 3.2.1. Melanoma 3.2.2. Melanoma de la línea SK MEL-2 3.3. ENZIMAS DE FASE I Y II 16 20 20 22 23 3.4. EL ELEMENTO ARE Y LA VIA DEL NRF2 24 3.5. NAD(P)H: QUINONA OXIDOREDUCTASA 30 3.6. INDUCCIÓN DE MUERTE CELULAR: CITOTOXICIDAD 31 3.7. PAPEL BIOLÓGICO DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA 32 4. MATERIALES Y MÉTODOS 39 4.1. LÍNEAS CELULARES 40 4.1.1. Melanoma humano (línea SK MEL-2) 40 4.1.2. Leucemia mieloidea crónica humana (línea K562) 40 4.2. TÉCNICA DE CULTIVO DE CÉLULAS TUMORALES 41 4.3. INDUCCIÓN DE LA ENZIMA NAD(P)H. QUINONA 42 4.3.1. Cultivo y exposición a naproxeno 42 4.3.2. Lisis y evaluación de la actividad de la QR 42 4.4. EVALUACIÓN DE LAS ALTERACIONES ULTRESTRUCTURALES MEDIANTE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 43 4.5. EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR EN PRESENCIA DE NAPROXENO Y TNF HUMANO 43 4.6. ANALISIS DE LA INDUCCIÓN DE MUERTE CELULAR Y EFECTOS SOBRE LA PROLIFERACIÓN MELANÓMICA IN VITRO 44 4.6.1. Citotoxicidad de células tumorales expuestas a naproxeno 44 4.6.2. Evaluación del efecto del naproxeno en la proliferación de células de melanoma humano 45 4.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 45 5. RESULTADOS 47 5.1. EL NAPROXENO INDUCE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA NAD(P)H: QUINONA OXIDOREDUCTASA EN CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO CULTIVADAS IN VITRO 47 5.2. EL NAPROXENO INDUCE ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALES EN CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA HUMANA CULTIVADAS IN VITRO 52 5.3. EL NAPROXENO INDUCE ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALES EN CÉLULAS DE MELANOMA MALIGNO HUMANO CULTIVADAS IN VITRO 58 5.4. EL NAPROXENO REDUCE LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA EN CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO CULTIVADAS IN VITRO 69 5.5. EL NAPROXENO INDUCE MUERTE CELULAR IN VITRO EN LAS LÍNEAS SK MEL-2 Y K562. ESTA ACTIVIDAD NO ES AUMENTADA POR LA PRESENCIA DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA HUMANO. EL TNF HUMANO INDUCE CITOTOXICIDAD EN LAS CÉLULAS MELANÓMICAS CULTIVADAS IN VITRO 76 6. DISCUSIÓN 82 vi 7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 106 7.1. 7.2. 106 107 CONCLUSIONES RECOMENDACIONES 8. BIBLIOGRAFÍA 109 vii RESUMEN Células de líneas humanas SKMEL-2 y K562 fueron expuestas in vitro a diferentes concentraciones de naproxeno, para determinar los efectos del antinflamatorio sobre las mismas. El fármaco fue disuelto en dimetil-sulfóxido (y en un vehículo acuoso de uso tópico utilizado en estudios previos, desarrollado por Laboratorios Stein, Costa Rica). Estudios preliminares in vivo utilizaron un modelo murino y demostraron que el naproxeno posee propiedades terapéuticas en el tratamiento y prevención de lesiones cutáneas y tumores causados por exposición a luz ultravioleta y que es capaz de inhibir procesos inflamatorios regulados por la transcripción de genes promotores de dicha respuesta. Estos resultados, unidos al reconocimiento de que muchos tipos de cáncer están asociados a la inflamación, constituyeron el interés por determinar si existe potencial quimioprotector en el naproxeno, ensayando sus efectos en líneas celulares malignas humanas. Bajo las condiciones experimentales empleadas, el naproxeno fue capaz de inducir un aumento en los niveles de expresión de la enzima NADP(H): quinona oxidoreductasa (NQO-1), en células de melanoma, un marcador bioquímico de la activación de genes regulados por el factor Nrf2 (el cual reconoce las secuencias de consenso llamadas ARE). Dichos genes pueden estar inactivos o poseer una expresión basal disminuida en las células cancerosas y pre-cancerosas y su estimulación podría convertirse en una estrategia importante en la quimioprotección, para prevenir el cáncer de piel tipo melanoma. El antinflamatorio ocasionó alteraciones ultraestructurales en ambos tipos celulares ensayados, incluyendo condensación de cromatina bajo las envolturas nucleares, generación de vesículas compatibles con el proceso de autofagia, picnosis y otros cambios, coincidentes con procesos de muerte celular programada tipo I y II. Además, inhibió la proliferación de células de melanoma e indujo niveles altos de muerte en células de leucemia mieloidea crónica y en células de melanoma maligno. El naproxeno no mostró sinergia en la inducción de este tipo de citotoxicidad con el factor de necrosis tumoral alfa, pero la citoquina elevó los niveles de mortalidad en los cultivos de células melanómicas (no así en los de células leucémicas). viii ABSTRACT SKMEL-2 and K562 human tumour cell lines were exposed in vitro to different concentrations of naproxen, in order to determine the effects of the non-steroidal anti-inflammatory on the tumorigenic cells. The drug was dissolved in dimethylsulfoxide (and in a topical-use aqueous vehicle, used on previous studies and developed by Stein Laboratories, Costa Rica, for comparison purposes). The preliminary in vivo studies using a murine model demonstrated naproxen to have therapeutic properties for the treatment and prevention of skin lesions and tumours caused by exposition to ultraviolet light and that it is capable to inhibit inflammatory processes regulated by the transcription of the genes which promote such an answer. These results, along with the realization that many types of cancer are associated to inflammation, constitute the basis for the interest to determine naproxen’s potential as chemopreventor against human malignant cell lines in vitro. Under the experimental conditions used, naproxen was able to induce an increase on the expression levels of the enzyme NADP(H): quinone-oxidoreductase (NQO-1). This enzyme is used as a biochemical marker for the activation of genes regulated by the Nrf2 factor (which recognizes consensus sequences called ARE) these genes are either inactive or have a decreased basal level of expression in precancerous and cancer cells, and their stimulation could become a very important strategy for chemoprevention, to prevent melanoma skin cancer and other kinds of tumours. The anti-inflammatory caused ultra-structural alterations on both cell types used, including chromatin condensation under the nuclear envelope, generation of vesicles compatible with an autophagy process, pyknosis and other changes, coinciding with programmed cell death processes type I and II. Furthermore, it inhibited the proliferation of melanoma cells and induced high levels of cell death on human chronic myeloid leukaemia (line K562) and on human malignant melanoma cells (line SK-MEL2). Naproxen did not show synergism on the induction of this kind of cytotoxicity with human tumour necrosis factor alpha, but the cytokine raised the mortality levels in the melanoma cell cultures (not so on those of leukaemic cells). ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estructura molecular del ácido S-6-metoxi-α-metil-2-naftaleneacético o naproxeno ................................................................................................................... 7 Figura 2. Efectos del naproxeno sobre la estructura histológica y la respuesta inflamatoria en piel de ratones desnudos irradiados con luz ultravioleta. ......... 11 Figura 3. Efecto protector del naproxeno contra lesiones cutáneas causadas por irradiación crónica de ratones SKH-1 con UVB (50 mJ/cm2) ............................. 12 Figura 4. Panorama molecular de la inducción de la respuesta apoptótica o de prosobrevivencia celular, estimulada por la unión del TNF a su receptor TNFR-1 .34 Figura 5. Diseño experimental para la determinación de la actividad del ácido S-6metoxi-α-metil-2-naftaleneacético en células de melanoma humano .................. 39 Figura 6. Células de melanoma humano (SK-MEL 2) cultivadas in vitro . ....... 40 Figura 7. Células leucémicas de la línea humana K562 ....................................... 41 Figura 8. Inducción lineal de la NADP(H): quinona oxidoreductasa mediada por naproxeno medida a lo largo de 5 minutos . .......................................................... 48 Figura 9. Inducción de la NAD(P)H: quinona oxidoreductasa por exposición a naproxeno en células de melanoma humano (línea SK-MEL 2) tratadas durante 48 horas .......................................................................................................................... 49 x Figura 10. Inducción de la NAD(P)H: quinona oxidoreductasa por exposición a naproxeno en formulación tópica (E.T.), en células de melanoma humano (línea SK-MEL 2) tratadas durante 48 horas .................................................................. 50 Figura 11. Morfología de células control de leucemia mieloidea crónica humana (línea K562) y células alteradas ultra estructuralmente por exposición a naproxeno.. ............................................................................................................... 54 Figura 12. Fotomicrografías electrónicas de transmisión que muestran los cambios morfológicos inducidos por naproxeno 434 mM, en células de leucemia mieloidea crónica humana.. ...................................................................................................... 55 Figura 13 . Fotomicrografías electrónicas de transmisión de cuerpos separados y degradados y de restos celulares............................................................................. 56 Figura 14. Alteraciones estructurales inducidas por naproxeno 434 mM en células de leucemia mieloidea crónica humana tras 24 horas de exposición al fármaco..57 Figura 15. Fotomicrografías electrónicas de transmisión, mostrando la morfología de células de melanoma maligno humano (SK.MEL 2) intactas (control). ........ 60 Figura 16. Detalles morfológicos de células control de melanoma humano. ...... 61 Figura 17. Fotomicrografía electrónica de transmisión de la superficie apical de una célula de melanoma humano (control)... ........................................................ 62 Figura 18. Alteraciones en la estructura celular inducidas por naproxeno disuelto en DMSO al 1%, en células de melanoma maligno expuestas por 24 horas ...... 63 xi Figura 19. Etapas tardías en el proceso de degradación celular inducido por naproxeno- DMSO 10%, en células de melanoma maligno humano expuestas al fármaco por 24 horas. .............................................................................................. 66 Figura 20. Fotomicrografías electrónicas de transmisión de células de melanoma humano expuestas a naproxeno en excipiente tópico al 1%, durante 24 horas ..67 Figura 21. Daños ultraestructurales y muerte celular inducidos por naproxeno al 10% en vehículo tópico, en células de melanoma expuestas por 24 horas ........ 68 Figura 22. Proliferación clonogénica de células de melanoma humano de la línea SK-MEL 2..................................................................................................................70 Figura 23. Prueba de proliferación clonogénica para células SK-MEL 2.. .... …71 Figura 24. Prueba de proliferación clonogénica para células en cultivo de monocapa ................................................................................................................. 72 Figura 25. Aspecto de las colonias……………………………………………….. 73 Figura 26. Proliferación clonogénica de células de melanoma humano luego de ser expuestas a naproxeno en solvente topico.............................................................. 75 Figura 27. Muerte celular inducida en células de leucemia mieloide crónica humana (línea K562) por naproxeno 434 mM, en presencia y ausencia del factor de necrosis tumoral alfa humano.. .............................................................................. 77 Figura 28. Muerte celular inducida en células de leucemia mieloide crónica humana (línea K562) por naproxeno disuelto en excipiente de uso tópico......... 79 xii Figura 29. Porcentaje de inducción de muerte celular por exposición a naproxenoDMSO 434 mM, en células de melanoma maligno humano.. .............................. 80 Figura 30. Porcentaje de inducción de muerte celular en células de melanoma maligno humano expuestas a naproxeno disuelto en excipiente tópico .............. 81 xiii LISTA DE ABREVIATURAS AINE (inglés NSAID): fármaco anti-inflamatorio no esteroideo. ARE: secuencia reguladora de los genes de las enzimas de fase II conocida como elemento de respuesta antioxidativo. ATCC: Colección Americana de Tipos de Cultivos celulares (American Type Culture Collection). BSA: albúmina de suero bovino. COXs: ciclooxigenasas. DMEM: medio de cultivo celular modificado de Dulbecco. DMSO: dimetil-sulfóxido. ELISA: análisis in situ ligado a enzima. Entiéndase lector para tal análisis. EMT6: línea celular de cáncer de seno murino. FAD: dinucleótido de flavina adenina. FAS: proteína receptora de la membrana celular, denominada CD95, miembro 6 de la superfamilia de receptores del TNF. FASL: ligando de FAS. GHS: glutatión. GSTP: glutatión-transferasa. IkB-α: proteína kappa B, polipéptido de unión al NFkB que lo mantiene secuestrado en el citosol. IKK-α: proteína quinasa alfa del complejo inhibidor de la IkB. IKK-β: proteína quinasa beta del complejo inhibidor de la IkB. K562: línea celular de leucemia mieloide crónica humana. kDa: kilodalton. Keap1: proteína tipo 1 Kelch, factor de unión al factor Nrf2, asociada a microfilamentos de actina. MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos. xiv MET: microscopia electrónica de transmisión. NF-E2: factor nuclear de transcripción E2, regulador de los genes de la globina en células hematopoyéticas. NFkB: factor de transcripción nuclear kappa B. Estimulador de la transcripción de los genes de escape apoptótico y de la respuesta inflamatoria. NQO-1: siglas con las que se denomina a la enzima de fase II NAD(P)H: quinona oxidoreductasa, también conocida como QR. Nrf2: factor eritroide 2p45, proteína que da nombre a la vía de señalización celular, responsable de la activación de la transcripción de los genes de las enzimas de fase II o enzimas anti estrés oxidativo. PBS: tampón de fosfatos. Solución amortiguadora para cultivo celular. PGs: prostaglandinas. PKC: proteína quinasa C. QR: véase NQO-1. SFB: suero fetal bovino. SK-MEL2: línea celular de melanoma humano. TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa. TNFR: receptor del factor de necrosis tumoral. Puede ser tipo I o II. TRAIL: ligando inductor de apoptosis relacionado al TNF. UDP: uridil-difosfato. xv If we knew what we were doing, we would not have called it research, would we? Albert Einstein The outcome of any serious research can only be to make two questions grow where only one grew before. Thorstein Veblen xvi