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Biosensores Amperométricos Basados en Polifenoloxidasas para
la Determinación de la Capacidad Antioxidante en Extractos de
Uvas
Ibarra Escutia Pedro1,2, Ramírez Silva María Teresa1, Calas-Blanchard Carole2, Marty Jean Louis2.
1 Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, Iztapalapa,
AP 55-534, México D.F. 09340.
2 Université de Perpignan, IMAGES EA 4218 Centre de Phytopharmacie, 52 Avenue Paul Alduy
66860 Perpignan CEDEX, France.
[email protected]
Abstract
Los polifenoles (PP) son compuestos que están ampliamente distribuidos en el mundo vegetal y son
importantes para la salud humana pues previenen la formación e inhiben la acción de radicales libres
generados “in vivo” que causan daño a ADN, lípidos, proteínas y otras biomoléculas. En la actualidad
es de un gran interés la estimación de la eficiencia de estas sustancias antioxidantes (Aox) y se han
desarrollado diversos métodos de análisis para evaluar esta propiedad. Distintos tipos de sensores
tales como electrodos de pasta de carbono, de carbón vítreo, composites o electrodos “impresos”
(SPE, Screen-Printed Electrodes) han sido modificados con enzimas polifenoxidasas (PPO) y
ampliamente usados en la determinación de la actividad antioxidante. Un sensor amperométrico
enzimático combina la especificidad de una enzima y las ventajas de la detección electroquímica. La
Tirosinasa (TIR) y La Lacasa (LAC) catalizan la oxidación de difenoles a sus correspondientes
quinonas cuya reducción electroquímica es empleada para monitorear la reacción.
El presente trabajo describe la construcción de biocaptores modificados con LAC (L-SPE) y
biocaptores modificados con TIR (T-SPE); en ambos casos la enzima es inmovilizada por
atrapamiento en PVA-AWP (Azide-unit pendant water-soluble photopolymer) sobre SPE
desechables. Se estudian las características analíticas para ambos biosensores ante soluciones
estándar así como su aplicación en la determinación amperométrica de la capacidad antioxidante
equivalente en uvas. Adicionalmente las muestras son evaluadas usando el método de FolinCiocalteu y se comparan los resultados obtenidos en ambos métodos.
Keywords: Biosensor, Screen-printed, Tirosinasa, Lacasa, Antioxidantes.
PP y de su actividad antioxidante no es una
tarea fácil debido a su amplia variedad y
complejidad química. Diferentes alimentos
contienen diferentes tipos y diferentes
cantidades de Aox los cuales pueden ser más
activos que otros y/o
adsorberse más
fácilmente; en este sentido existe un gran
interés no solo en la estimación del contenido
sino también de su eficiencia y estabilidad, y se
han desarrollado distintos métodos para evaluar
estas propiedades buscando optimizar su costo,
sensibilidad, selectividad, reproducibilidad y
sencillez. Esta herramienta permitiría determinar
la mejor especie, variedad, tiempo de
maduración, condiciones de cultivo etc.
Comúnmente los PP son cuantificados usando
métodos tales como espectrofotometría, HPLC
acoplada a un detector UV, cromatografía de
líquidos (CL), la CCF y CG acoplada con
espectrometría de masas [5-11]. También se
han empleado diferentes tipos de sensores
Introducción
Históricamente muchos beneficios en la
salud se han asociado al consumo de frutas,
verduras y algunas bebidas de origen natural
como tés o bebidas alcohólicas. Algunos
estudios reportan que el consumo moderado de
vino tinto reduce la incidencia de enfermedades
del corazón debido a su alto contenido en
compuestos fenólicos provenientes de las uvas
y del proceso de fabricación, sin embargo el
gran número de compuestos contenido en el
vino tinto hace imposible asociar tales efectos
benéficos a compuestos específicos [1].
En la actualidad es bien sabido que los PP
poseen potentes propiedades antioxidantes
debido a su habilidad para atrapar radicales
libres; substancias nefastas para el organismo
pues oxidan los diferentes elementos de la
célula conduciendo así a su envejecimiento
acelerado y destrucción [2-4]. La detección de
200
modificados con enzimas [12-16]. Los
biosensores amperométricos se basan en la
medida de la corriente generada en la reacción
enzimática sobre un electrodo mantenido a un
potencial apropiado. La posibilidad de poder
incorporar varias enzimas les confiere una gran
diversidad de uso. La mayor parte de estos
sensores
utilizan
enzimas
del
grupo
oxidoreductasas pues las especies consumidas
o producidas durante el proceso de óxidoreducción, suelen ser fácilmente leídos por el
transductor amperométrico [17-21]. Las PPO
son las enzimas de uso más frecuente en la
determinación de PP. La TIR muestra actividad
para la oxidación de o-benzenodiol mientras
que la LAC cataliza la oxidación de o-, m-, y pbenzenodiol a las correspondientes o-, m-, y pquinonas [22-24]. La reducción de las quinonas
generadas en la reacción enzimática es usada
para monitorear la reacción.
graficador Kip & Zonen en una celda
termoregulada bajo agitación constante. Los
SPE utilizados constan de tres pistas de
carbono con Ag/AgCl como referencia y son
fabricados en el laboratorio IMAGES EA 4218
de la Universidad de Perpignan, Francia (DEK
Printing Machines Ltd., England). Sobre el
electrodo de trabajo se depositan 4.0 µL de una
mezcla 50% v/v formada por la solución
enzimática (TIR 5.0 mg/mL ó LAC 10 mg/mL) y
PVA-AWP. Posteriormente se exponen a la luz
(300-400 nm) a 4°C durante 3 horas con el fin
de permitir la polimerización. Después de este
tiempo se almacenan a 4°C al vacío hasta su
uso. Siguiendo este procedimiento cada T-SPE
contiene 40 unidades y el L-SPE 2.4 unidades.
Mediante Voltamperometría cíclica se
determinó
realizar
las
mediciones
amperométricas aplicando un potencial de -300
mV (vs Ag/AgCl). Con el biosensor inmerso en
8.0 mL de amortiguador 0.1 M de fosfato pH 7.0
y 25°C, una vez aplicado el potencial elegido es
necesario esperar hasta que la corriente sea
estable. Cuando se alcanza esta línea de base
se adiciona una alícuota de 50 μL del extracto
de uvas al 20% y se mide el cambio en la
corriente la cual es interpolada sobre la curva
de calibración correspondiente. Para fines de
comparación se
obtuvieron
curvas
de
calibración usando ácido cafeico como sustrato
para ambos biocaptores. La capacidad
antioxidante equivalente (CAEAC) es expresada
en mg de ácido cafeico por gramo de uva.
Experimental
-1
-2
-3
y 10-4M de
Soluciones 10 ,10 , 10
catecol, hidroquinona y ácido cafeico en etanol
se preparan el mismo día de su uso y se
mantienen protegidas de la luz. Amortiguador
10-1 M de fosfato pH 7.0. Las soluciones
enzimáticas usadas en la preparación de las
mezclas con el polímero son TIR 5.0 mg/mL
(Tyrosinase from mushrooms, Sigma, EC
1.14.18.1, 3900 unit/mg sólido), LAC 10 mg/mL
(Laccase from Rhus vernificera, Sigma, EC
1.10.3.2, 120 unit/mg sólido), PVA-AWP (Toyo
Gosei Co., Ltd., Japan). Los extractos de uvas
se preparan el mismo día de su uso. Las
muestras (cosechadas en 2006 y 2007) son
licuadas y posteriormente centrifugadas. Con la
fase líquida se prepara una dilución al 20% v/v
en etanol.
Las mediciones amperométricas se realizan
usando el método de adiciones estándar con un
potenciostato Metrohm 641 VA conectado a un
Resultados
Una curva de calibración es un gráfico
[sustrato]celda vs Corriente (Itotal). La parte lineal
de la curva de calibración indica el intervalo de
respuesta lineal mientras que la pendiente
corresponde a la sensibilidad del sensor (Figura
1).
1000
800
I total (nA)
y = 0.6903x + 63.837
R² = 0.9963
600
400
200
0
0
300
600
900
1200
[Hidroquinona]celda (µM)
Figura 1. Curva de Calibración para L-SPE en Amortiguador 0.1 M de Fosfato pH 7.
201
Adicionalmente
se
evalúa
la
reproducibilidad de manufactura y la estabilidad
operacional del sensor realizando múltiples
inyecciones de la solución del sustrato y
registrando la respuesta en la corriente. Este
análisis muestra la estabilidad de la enzima en
el material de soporte, además de ser un
indicador de la eficiencia del atrapamiento
(Figura 2).
3500
3000
I total / nA
2500
2000
1500
1000
500
0
E1
E2
E3
E4
20 U
E5
E6
40 U
Figura 2. Reproducibilidad de manufactura de T-SPE´s con diferentes cantidades de enzima en 2.5x10-4 M de catecol en
amortiguador 0.1 M de fosfato pH 7.
El T-SPE empleado para la determinación
de la actividad antioxidante en extractos de
uvas contiene 40 unidades enzimáticas
mientras que el L-SPE contiene solo 2.4
unidades. Estas cantidades fueron elegidas
pues su intervalo de respuesta es similar y
permite el uso de alícuotas del mismo volumen.
Las características analíticas de ambos
dispositivos se muestran en la Tablas 1 y 2.
La capacidad antioxidante equivalente fue
determinada para cuantro diferentes cosechas
de uvas de cuatro variedades, los resultados se
muestran en la figuras 3-4.
Tabla 2 Características Analíticas de Biosensores L-SPE.
Sensibilidad
-3
10 A/M
0.69
0.50
Tabla 1 Características Analíticas de Biosensores T-SPE.
Sensibilidad
-3
10 A/M
38.1
2.83
Intervalo
de
linealidad
2
R
Intervalo
de
linealidad
2
R
Sustrato
-6
10 M
3.1-1100
2.0-1200
0.9963
0.9994
Hidroquinona
Ac. Cafeico
Sustrato
-6
10 M
0.125-200
0.2-500
0.9997
0.9996
Catecol
Ac. Cafeico
2.0
Caffeic Acid Equivalent (mg/g)
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
Syrah 1
Syrah 2
Tyrosinase
Syrah 3
Laccase
Syrah 4
Folin
Figura 3. CAEAC amperométrico (T-SPE y L-SPE) y espectrofotométrico (Folin-Ciocalteu) para uvas Syrah de diferentes
cosechas.
202
2.1
CAEAC by FCR (mg/g)
1.8
y = 3.4365x + 0.7303
R² = 0.9454
1.5
1.2
0.9
0.6
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
CAEAC by L-SPE(mg/g)
Figura 4. Comparación del CAEAC amperometrico (L-SPE) y espectrofotométrico (Folin-Ciocalteu). Los resultados mostrados
incluyen uvas de las 4 variedades seleccionadas.
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Conclusiones
Ambos sensores T-SPE y L-SPE muestran
buen desempeño; los resultados obtenidos son
similares con los reportados por otros métodos
e incluso otros biosensores enzimáticos aunque
la simplicidad del método de manufactura
propuesto le confiere cierta ventaja sobre
aquellos. El dispositivo analítico propuesto
permite la determinación de la capacidad
antioxidante equivalente en extracto de uvas
mediante la adición directa de pequeñas
alícuotas en la celda electroquímica. La
determinación amperométrica muestra algunas
ventajas sobre otros métodos tales como el
tiempo de respuesta reducido y la simplicidad
en la preparación de las muestras. Se concluye
que estos biosensores son útiles para un rápido
y sencillo monitoreo de la capacidad
antioxidante; Así mismo pueden ser aplicados a
otro tipo de muestras reales además es también
posible correlacionar los resultados obtenidos
con los reportados por otros métodos
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