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Introducción a la Espectrometría de Masa Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en biología y biomedicina Espectrometría de Masa • La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z). • La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa. • Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z). • La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia…… Bioespectrometría • Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones. • Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa. Espectrometr ía de masa y Biolog ía Espectrometría Biología Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa: • Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas • Ionización por “Electrospray” (ESI) para muestras líquidas Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems Voyager DE-PRO) (Applied Biosystems 4800 Analizer) ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF plate Extraction grids Laser Reflector Timed ion detector selector Reflector Beam guide Camera Pumping Pumping Linear detector 4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training Analizador de masa TOF Aceleración post-irradiación láser Detector Región de deriva (Tubo de vuelo) +20 kV Iones de masas diferentes L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración . Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa. 7 © 2007 Applera Corporation and MDS Inc. Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina “in gel” de una proteína de membrana de 91 kDa. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81 Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 12.0000 98.90 13C 13.0034 1.10 14N 14.0031 99.634 15N 15.0001 0.366 16O 15.9949 99.762 17O 16.9991 0.038 18O 17.9992 0.200 31P 30.9738 100.00 32S 31.9721 95.02 33S 32.9715 0.75 34S 33.9679 4.21 36S 35.9671 0.02 79Br 78.9183 50.69 81Br 80.9163 49.31 Resolución en MALDI-TOF Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222] 1672.917 1672.92 100 3222.3 90 80 % Intensity 70 60 50 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) 40 30 20 10 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 0 1691.0 Mass (m/z) Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255] 1672.918 100 1.6E+4 90 80 % Intensity 70 60 Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) 50 40 30 20 10 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 Mass (m/z) 1683.8 0 1691.0 Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] 2xC13 100 90 2093 C13 80 % Intensity 70 60 50 40 C12 30 20 10 0 5725 5729 5733 Mass (m/z) 5737 5741 5745 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 µl de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM) 0 Algunas aplicaciones............ CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA • Identificación de proteínas – comparación correlativa en una base de datos de secuencias • Control de calidad – proteínas recombinantes, reacciones de modificación • Modificaciones postraduccionales – fosforilación, glicosilación, metilación, etc. • Identificación de dominios – dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima • Niveles de expresión – métodos cuantitativos Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367] 12366.46 100 6.0E+4 90 80 6187.17 70 12583.58 % Intensity 60 50 12326.17 40 30 20 6292.68 12784.48 10 0 5000 7000 9000 11000 Mass (m/z) 13000 0 15000 Mapeo peptídico por EM (Peptide Mass Fingerprinting/MS) proteína intacta péptidos enzima proteolítica MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido α-ciano hidroxicinámico Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883] 2.0E+4 1633.82 100 1168.61 90 80 % Intensity 70 60 50 1190.54 40 1212.53 30 20 1046.18 10 0 1000 1170.181213.53 1152.36 1124.52 1230.50 1160 1433.76 1655.59 1296.68 1350.70 1320 1478.82 1480 1631.62 1640 0 1800 Mass (m/z) Masa Teorica (Da) 1168.61 1296.71 1350.72 1433.77 1470.68 1478.82 1478.82 1633.81 Masa Medida (Da) 1168.61 1296.68 1350.69 1433.76 1470.67 1478.82 1478.82 1633.82 Error (Da) Residuos Secuencia 0.00 0.03 0.03 0.01 0.01 0.00 0.00 0.01 28-38 28-39 89-99 26-38 40-53 89-100 88-99 9-22 TGPNLHGLFGR TGPNLHGLFGRK TEREDLIAYLK HKTGPMLHGGLFGR TGQAPGFTYTDANK TEREDLIAYLKK KTEREDLIAYLK IFVQKCAQCHTVEK RESUMEN: Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS. • medida de masa de una molécula entera • medidas de masas en mapeo peptídico • secuenciado de péptidos por MS/MS 1 valor experimental 5-20 valores experimentales más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información El Proteoma es dinámico Estado metabólico Drogas Condiciones ambientales Interacciones Proteína-Proteína Proteoma Estadío de Desarrollo ADN Genoma Control transcripcional Estrés Control traduccional y post-traduccional mARN Análisis por electroforesis 2D Identificación de proteínas 1000 m/z Mass (m/z) 1500 2000 Extracción de péptidos y análisis de masas Separación en gel 2D Selección de la muestra Tratamiento con una enzima proteolítica Búsqueda en banco de datos Protein Prospector Homepage MS-Fit Search ProFound Search for Protein Identification Set Kingdom Enzyme used for digestion Cys Modificatition (reduced, alkylated) Set Charge state Search Result after Peptide Mass Fingerprinting The result showed that in fact the spot contained 2 proteins. Both were identified, Vimentin and Tubulin. Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified. Note that the genome of CHO-cells (hamster) is not sequenced. Therefore the most homologues proteins of related species are scored. Detailed Search Results View Identificación de una proteína regulada por hierro en membrana externa de Sinorhizobium meliloti Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81 FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µM FeCl3 (lanes 1 and 2), 500 µM EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µM EDDHA and 4 µM hemoglobin (lanes 5 and 6), or 500 µM EDDHA and 16 µM hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81 FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81 Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81 Identificación de proteínas por MALDI-TOF • Proteína aislada • Proteína identificada por la masa de los péptidos (PMF), generados por un método específico: – Enzimático o químico • Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos • La identificación es probabilística: según criterios estadísticos Caracterización de proteínas por espectrometría de masa • Identificación de proteínas – comparación correlativa en una base de datos de secuencias • Control de calidad – proteínas recombinantes, reacciones de modificación • Modificaciones postraduccionales – fosforilación, glicosilación, metilación, etc. • Identificación de dominios – dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima • Niveles de expresión – métodos cuantitativos Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Pureza/SDS-PAGE/ GCSF 36 29 24 Pureza/HPLC/GCSF A 20 B 14 B A Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF 28.952 Da muestra A A B Electroforesis 2D de la materia prima Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D). Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Voyager Spec #1=>BC[BP = 1286.8, 20135] 0 867.0 2021.94 1414.87 1297.67 10 1242.66 20 1086.56 30 1029.53 50 40 1740.84 60 988.45 % Intensity 70 1191.6 1516.2 1840.8 2178.06 80 2083.09 90 2.0E+4 1783.87 100 1351.78 1286.77 Digestión tríptica: muestra A 2165.4 Mass (m/z) #/13( Mea %) Data % MOW % n Mass Tol Co SE TIC Err es Da v Score Da Matc hed 4.709e 13 60. 100. 0.03 1 0.011 +06 (100) 0 0 58 2 0.03 4.709e 13 60. 100. 0.011 2 58 +06 (100) 0 0 2 0.03 3.603e 13 55. 100. 0.011 3 58 +06 (100) 0 0 2 MSDigest Index # Protein Accessi MW on # (Da)/pI 93727 28949/5.5 377118 28950/5.3 590830 Species Protein Name 999812 UNREADABL gi|999812|pdb|1BTL| Beta-Lactamase Tem1 (E.C.3.5.2.6) M E gi|9257166|pdb|1CK3|A Chain A, N276d 925716 UNREADABL Mutant Of Escherichia Coli Tem-1 Beta6 E Lactamase EXPRESSION 299595 VECTOR beta-lactamase 31530/5.7 9M PPK113 Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN 0 2490.0 Caracterización de proteínas por espectrometría de masa • Identificación de proteínas – comparación correlativa en una base de datos de secuencias • Control de calidad – proteínas recombinantes, reacciones de modificación • Modificaciones postraduccionales – fosforilación, glicosilación, metilación, etc. • Identificación de dominios – dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima • Niveles de expresión – métodos cuantitativos Identificación de Modificaciones Postraduccionales Fosforilación? NO2? Common Protein Post-Translational Modifications ∆ (monoisotopic) -17 -2 -0.98 0.98 2 14 16 28 42 43 44 71 79.9568 79.9663 modification pyrrolidone carboxylic acid disulfide formation (thiol oxidation) amidation Some modifications are natural. deamidation Many are the result of handling. disulfide reduction (thiol formation) methylation oxidation (e.g. sulfoxide formation) formylation acetylation disulfide vs. two thiols carbamylation phosphate group vs. sulfate group γ-carboxyglutamic acid good mass spectrometer needed Cys-propionamide especially with large molecules sulfation phosphorylation M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: 645-657 (1999). Delta Mass at http://www.abrf.org Identificación de sitios de fosforilación PknB de Mycobaterium tuberculosis 1 51 101 151 201 251 301 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR 1 51 101 151 201 251 301 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR Caracterización de proteínas por espectrometría de masa • Identificación de proteínas – comparación correlativa en una base de datos de secuencias • Control de calidad – proteínas recombinantes, reacciones de modificación • Modificaciones postraduccionales – fosforilación, glicosilación, metilación, etc. • Identificación de dominios – dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima • Niveles de expresión – métodos cuantitativos 2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES A) pH 3 10 B) pH 3 10 Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Proteína Enzima Mezcla de péptidos Espectrómetro de masa Masa de los péptidos Búsqueda en bancos de datos; Identificación de la proteína Alternativamente, secuenciación de cada péptido Verificación de secuencia y detección de modificaciones postraduccionales .…MS/MS MS/MS Mezcla de péptidos 1 péptido seleccionado para MS/MS + MS/MS + + + + + Espectro MS Espectro MS/MS: masa de los fragmentos b ions y ions Del Genoma al Proteoma Secuencia ADN mARN Control Transcripcional Proteínas Control Traduccional Proteínas Funcionales Control post-traduccional Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN Proyectos de Proteoma Humano ~40,000 Proteinas ~>1,000,000 Proteinas Variantes ~>5,000,000 Complejos? APLICACIONES DE LA PROTEOMICA Estudios de la funcion y organización Molecular de la celula Descubrimiento de nuevas actividades Biologicas y drogas Investigaciones en Fisiopatologia Predecir respuestas individuales a drogas Marcadores para diagnostico de enfermedades Estudio de modo de accion de drogas y toxicidad Descubrimiento de nuevas moleculas blanco de drogas Linear Detector 4800 MALDI TOF/TOF™ Analyzer Schematic 2-Stage Mirror Lens 3 Mirror Deflectors Metastable Suppressor Collision Cell Source 2 CID Lens (Lens 2) Decel Stack Lens 1 Camera Laser Decel Deflectors Lamp TIS X2,Y2 Deflectors Attenuator Reflector Detector X1,Y1 Deflectors Sample Loading Chamber Mirrors Source 1 Source 1 Lens Sample Plate and Stage Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración. Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa. Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer) Time-of-Flight Mass Analyzer Source Acceleration Detector Drift Region (Flight Tube) +20 kV Ions will separate according to their mass-to-charge ratios: light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions. The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio. • Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA). • Datos técnicos: • Posibilidades de operación: - Modo lineal - Laser de nitrógeno (λ 337 nm) - Modo reflector - Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kV - "Delay extraction" (DE) - Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector) - Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr) - "Post Source Decay“ (PSD) - "Collision-Induced Dissociation“ (CID) - Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm) - Sensibilidad (péptidos): subpicomolar