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Química Analítica I
QUÍMICA BIOANÁLITICA
La Química Bioanálitica es una subdisciplina de la química analítica que abarca la
medición cuantitativa de bióticos (macromoléculas, proteínas, ADN, grandes moléculas de
fármacos y metabolitos) y xenobióticos (fármacos y sus metabolitos y moléculas biológicas en
lugares o concentraciones no naturales) en los sistemas biológicos. Esta subdiciplina, se ha
transformado, en los últimos años, en un área fundamental de la química analítica;
especialmente en el ámbito de la biotecnología, bioingeniería, farmacia y química clínica así
como en las investigaciones biológicas y bioquímicas.
SENSOR
Un sensor es un dispositivo capaz de detectar magnitudes físicas o químicas, llamadas
variables de instrumentación, y transformarlas en variables eléctricas. Podemos dividir a los
sensores es tres tipos: sensores físicos que miden distancia, masa, temperatura, presión, etc ,
sensores químicos que miden sustancias químicas mediante respuestas físicas o químicas y
biosensores que miden sustancias químicas empleando elementos biológicos de
reconocimiento. Es condición ineludible que estos dispositivos estén conectados a un
transductor que permita traducir la respuesta generada. El ser humano posee al menos cinco
de estos sensores: el oído, el olfato, el gusto, la vista y el tacto.
La nariz como un sensor
Uno podría considerar los oídos, los ojos, los dedos como sensores físicos ya que
detectan sensaciones físicas de sonido, luz y calor/frio respectivamente. En cambio nuestra
nariz detecta olores, es decir pequeñas cantidades de sustancias químicas. Desde el punto de
vista químico, el olor es una sensación, una noción de estímulo y percepción producida en el
olfato por la interacción de una sustancia orgánica con los receptores olfativos. La nariz es
un instrumento extremadamente sensible y selectivo muy difícil de simular artificialmente. La
misma puede distinguir 10.000 aromas distintos, es decir una cantidad inmensa de diversas
sustancias químicas y proporcionar una idea general de la cantidad de las mismas, incluso a
muy bajos límites. Estas sustancias pueden ser detectadas pasando a través de la membrana
olfativa, al bulbo olfativo, el cual contiene receptores biológicos que la perciben. La respuesta
es una señal eléctrica que se transmite al cerebro vía nervios olfatorios. Luego el cerebro
traduce esta respuesta en una sensación que nosotros conocemos como “olor “.
La Figura 1 muestra un esquema que compara el sistema olfativo con un sensor
generalizado. En dicha figura observamos que las fosas nasales recogen la “muestra de olor”,
que luego es detectada por la membrana olfatoria, es decir detecta el elemento. Las respuestas
de los receptores olfativos son luego convertidas por la célula nerviosa olfatoria, semejante al
transductor, en una señal eléctrica que pasa a largo de las fibras nerviosas hacia el cerebro
para ser interpretada. Por lo tanto el cerebro actúa como un microprocesador transformando
esa señal en una sensación que nosotros llamamos “olor”.
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Química Analítica I
Figura 1. (a) Representación
ón esque
esquemática de las partes de un sensor: analito, receptor
eceptor biológico, transductor y
dispositivo de medida. (b) Analogía
Analogí con la nariz como un sensor, donde la membrana
brana oolfatoria, es el elemento
de reconocimiento, la célulaa nerviosa
nervio es el transductor y el cerebro es el elementoo de medida.
me
SENSOR BIOANALÍTICO
NALÍTICO
Un sensorr bioanalítico se define como un dispositivoo analítico compuesto por: un
elemento de bioreconocimie
oreconocimiento o reconocimiento biológico (ácido nucleico, enzima,
anticuerpo, receptor,
tor, tejido, célula,
c
polímeros de impresión molecular ((PIMs), aptámeros,
ácidos nucleicos peptídicos (P
(PNAs), como fase sensorial, en íntimo contacto
conta
con un sistema
transductor adecuado
uado que permite
per
traducir la interacción entre
re el biomaterial
biomate
y el analito, en
una señal detectable (Figura
Figura 2).
2 La señal obtenida se relaciona con la concentración
conce
de analito
y debido a la especificidad
ecificidad dde la biomolécula, la detección se puede hacer directamente en
muestras complejas sin previo
prev tratamiento. Por lo tanto unn elemento de reconocimiento
altamente especifico
ico y sensible es primordial para el diseño de un biosensor
biosenso eficiente.
Figura
gura 2.
2 Representación esquemática de un sensor bioanalítico
ítico
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Química Analítica I
¿Cómo funciona un sensor b
bioanalítico?
La Figura 3 muestra el
e funcionamiento básico de un sensor bioanalítico.
bioan
En primer
lugar ocurre la etapa
apa sensorial donde se genera la señal primaria:
ria: aquí el analito
an
presente en la
muestra (a) es reconocido
conocido por
po el sistema bioreceptor ocasionando la modificación
mod
de una o
varias propiedades físico-quí
químicas (pH, transferencia de electrones,
lectrones, de calor, cambio de
potencial, de masa,
a, variación de
d las propiedades ópticas, etc). A continuación
continuac
en una segunda
etapa el transductor
tor la convierte
convie en una señal eléctrica secundaria, indicativa
indicat
de la presencia
del analito sometido
etido a est
estudio o proporcional a su concentración en la muestra.
Posteriormente enn la tercera etapa
e
la señal es amplificada, condicionada
dicionada y procesada, para ser
presentada en forma
rma de dato. En cambio cuando el analito no se encuentra
encue
presente en la
muestra (b) no hay señal.
Dicho transductor,
nsductor, por lo tanto, determina la eficacia en el procesado
proces
de la señal del
biosensor, mientras
as que su selectividad
sel
viene definida principalmente
almente por la particularidad de
la interacción dell componente biológico con el analito. Idealmente,
lmente, los dispositivos
d
de este
tipo deben responder
der continua y reversiblemente al analito de interés sin pperturbar la muestra,
eliminando así la necesidad
esidad de su pretratamiento e incluso de su recogida.
Figura 3.
3 Principio de operación de un biosensor.
El biosensor
sor es una he
herramienta analítica ideal para su utilización en distintas áreas
donde existe la necesidad
ecesidad de disponer de sistemas que proporcionen
orcionen información
info
selectiva,
rápida, automatizada
ada y en tiempo
tie
real acerca de la composición
ición químic
química de las muestras,
como son el control
ntrol de procesos
proc
biotecnológicos, fermentaciones,
aciones, con
control de calidad de
fármacos, controll medioambiental,
medioambi
control de calidad de alimentos,
limentos, se
seguridad y defensa.
Además de la necesidad
cesidad de detectar
d
niveles bajos de concentración
tración de ddiversos analitos en
aguas, alimentos, etc y en matrices
mat
de distinta naturaleza, tanto acuosas com
como no acuosas.
El primer biosensor fu
fue desarollado por Clark y Lyonss en 1962 para
pa la determinación
de glucosa y fue comercializa
comercializado a partir de 1975 por Yellow Springs Instrument
Ins
Company.
Este biosensor see denominó “enzyme electrode” y consistía en la enzima
enzim glucosa oxidasa
acoplada a un electrodo
ectrodo para oxígeno. La enzima oxida la glucosa
lucosa y como
com consecuencia se
produce un descenso
enso proporcional
proporc
de la concentración de oxígeno en la muestra, que es
detectado por el electrodo.
lectrodo. En los años siguientes se desarrollaron
ron electrodo
electrodos enzimáticos para
165
Química Analítica I
distintas sustancias de interés clínico mediante la unión de enzimas apropiadas a sensores
electroquímicos.
Características de un Biosensor
En las múltiples aplicaciones de los biosensores es deseable que estos dispositivos
cuenten con las siguientes características:
Sensibilidad y selectividad elevada. El dispositivo debe interaccionar
exclusivamente con el compuesto de interés y no con otros de propiedades similares.
Confiabilidad elevada. Los sistemas de transducción se diseñaron de manera que no
puedan ser alterados (o lo sean mínimamente) por la muestra.
Tiempo de utilidad prolongado. La estabilidad química, física y mecánica del
elemento de reconocimiento condiciona su duración.
Costo de producción bajo y tiempo de análisis pequeño que posibilite una
actuación rápida y sin necesidad de un período de espera prolongado hasta el
siguiente análisis.
Pretratamiento de la muestra innecesario, lo que supone un ahorro de tiempo,
materiales y reactivos.
Manipulación sencilla. Esta tecnología no requiere personal calificado.
Capaces de realizar análisis en tiempo real.
Portátiles, que posibilite realizar análisis in situ.
Automatizables. Prescindir del control manual de estas unidades facilita su
integración dentro de los sistemas que monitorizan los procesos industriales.
Miniaturizables. Gracias a los desarrollos en microelectrónica y nanotecnología se
han logrado reducir las dimensiones de estos dispositivos. Así, pueden ensamblarse
varios de ellos en un mismo sistema que realiza varias tareas a la vez y son aplicables
a ensayos donde el tamaño físico del dispositivo, el volumen de la muestra o la
localización de la medida son factores limitantes.
Pocos requerimientos operativos y de almacenamiento
Capacidad multi-análisis. Ciertos biosensores llevan a cabo la determinación de
diferentes analitos de forma simultánea.
CLASIFICACIÓN DE SENSORES
Los sensores bioanalíticos pueden clasificarse atendiendo a diferentes criterios, como
el modo en que interaccionan el elemento de reconocimiento y el analito, la metodología de
detección empleada para concretar dicha interacción, la naturaleza del elemento de
reconocimiento o del sistema de transducción.
Clasificación de los sensores bioanalíticos de acuerdo al tipo de interacción y al
elemento de reconocimiento
Esta clasificación se basa en la naturaleza del proceso biológico, donde podemos
distinguir dos grandes grupos (Figura 4).
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Química Analítica I
Figura 4. Clasificación dee los sensores
se
bioanalíticos según el elemento de reconocimiento
reconoci
y el sistema de
transducción empleado
♦
♦
Tipo de interacción
cción
· Biocatalítica
· Bioafinidad
Elemento de reconocim
econocimiento:
· Enzima
· Orgánulo,, tejido o célula
cél completa
· Receptor biológico
· Anticuerpo
· Ácidos nucleicos
· PIM, aptámero
♦
♦
Detección
ón de la interacción
· Directa
· Indirecta
Sistema de transducción
trans
· Electroquímico
ectroquímico
· Óptico
· Piezoeléctrico
zoeléctrico
· Termométrico
rmométrico
· Nanomecánico
nomecánico
Existen múltiples
últiples elementos
ele
de reconocimiento y sistemas de transducción.
Teóricamente estos
os componentes
componen admiten diversas combinaciones.
ones. En la práctica, la elección
del material biológico/biomim
ógico/biomimético depende de las características
ticas del com
compuesto a analizar.
Por ejemplo, cuando
ndo se trata de detectar una sustancia alérgena
ena se utilizan
utiliz anticuerpos. La
elección del transductor
ductor está ccondicionada por el tipo de elemento
ento de recon
reconocimiento elegido,
ya que éste determina
mina cuál será
se la variación en las propiedades
des físico
físico-químicas, que ocurra
como consecuencia
ia de la inter
interacción.
a) Sensores biocatalíticos
Se fundamentan
entan en el empleo
e
de biocatalizadores, los cuales
les son elementos
ele
capaces de
producir una reacción
ción química sin consumo del biocatalizador,, el cual se regenera
re
y puede ser
nuevamente utilizado.
Estos biocatalizadores
catalizadores pueden ser enzimas inmovilizadas
vilizadas aisladas
ais
o paquetes
multienzimáticos coinmovilizados,
coinmoviliz
que actúan de modo encadenado,
denado, orgánulos
orgá
subcelulares,
células completas y tejidos animales
ani
o vegetales.
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Química Analítica I
Se pueden emplear para
par detectar la presencia de algunoo de los sustr
sustratos que participan
en la reacción, mediante
ediante la det
detección de la desaparición de algúnn cosustrato conocido, distinto
de aquel que se quiere
uiere detectar o por la aparición de algún producto
ducto conoci
conocido.
También pueden emple
emplearse indirectamente para detectar
ar compuestos
compuesto que interfieren en
la reacción de manera
anera select
selectiva, inhibiendo las capacidades del biocatalizador,
biocata
como por
ejemplo determinados
nados insecticidas
insect
del tipo de los carbamatos,
atos, que inhiben
in
la actividad
enzimática de la acetilcolinesterasa
acetilcolinest
y cuya presencia puede cuantificarse
antificarse a través del grado de
inactivación de esta
sta enzima o los metales pesados que inhiben
iben la actividad
activ
de la enzima
fosfatasa alcalina,
a, presente en la membrana de la microalga Chlorella
Chlor
vulgaris, que
adecuadamente inmovilizada
movilizada en
e el extremo de una fibra óptica permiten su determinación.
Enzimas
Todas las enzimas son proteínas que catalizan diversas
sas reacciones
reaccion químicas en los
seres vivos. En laa reacción qu
que cataliza una enzima se produce
ce la unión del sustrato en una
región específica de la enzima denominada centro activo, que comprende un sitio de unión y
un sitio catalítico. Una
na vez que
qu se forman los productos de la reacción enzimática,
en
la enzima
se recupera pudiendo
endo comenzar
comen
un nuevo ciclo de reacción. El mecanismo
mecan
básico de la
catálisis enzimática
ca se muestra en la Figura 5:
Figura
igura 5.
5 Mecanismo básico de la catálisis enzimática
La actividad
ad enzimátic
enzimática está controlada normalmente por el pH, la fuerza iónica, la
temperatura y la presencia de cofactores. La estabilidad de lass enzimas es un factor limitante
para el tiempo de vida de un biosensor
b
de tipo enzimático y se utilizan
ilizan distintas
dis
técnicas para
aumentarla, comoo estabilización
estabilizac
química y/o inmovilización,
n, las cuale
cuales serán explicadas
posteriormente en forma detallada.
detal
En algunass ocasiones se
s utilizan sistemas multienzimáticos,
áticos, en los que la enzima que
actúa como elemento
to de reconocimiento
reco
no opera directamente
nte sobre el analito, sino sobre
algún producto derivado
erivado del mismo. Este sistema es muy utilizado
tilizado en el caso de algunos
azúcares en los que
ue se utilizan enzimas que actúan sobre los productos de la hidrólisis de los
mismos.
Entre las enzimas disp
disponibles comercialmente las más utilizadas suelen
su
ser las óxidoreductasas. Son enzimas estables
es
que catalizan fenómenos
os de oxida
oxidación o reducción
utilizando oxígenoo o cofactores.
cofactore El empleo de enzimas en el diseño de sensores
sen
bioanalíticos
presenta ventajas como elevada
eleva selectividad, respuesta rápida,
a, elevada va
variedad de enzimas
disponible, capacidad
cidad de autorregeneración
au
y maleabilidadd para la construcción
co
de los
dispositivos de unaa manera sencilla.
sen
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Química Analítica I
Células enteras
En determinados casos los elementos biológicos de reconocimiento pueden ser células
enteras: bacterianas, fúngicas, procedentes de organismos superiores, viables o no viables. En
este caso en lugar de purificar las enzimas se utiliza como elemento biológico una célula
completa, que posee en su interior múltiples sistemas enzimáticos en su medio natural. Se
pueden utilizar células modificadas genéticamente que expresen enzimas determinadas que no
se expresen normalmente o que posean una actividad mayor.
Orgánulos subcelulares
Una alternativa para el diseño de estos sensores es el empleo de organelas
subcelulares, que contienen determinados sistemas enzimáticos completos, pero no poseen
todos aquellos que presenta una célula completa, como ejemplos se presentan los cloroplastos
completos o mitocondrias. Ambas organelas de membrana doble, poseen sistemas
enzimáticos relacionados con la obtención de energía en la membrana interior. Dichos
sistemas pueden ser inhibidos por diferentes agentes tóxicos como plaguicidas, metales
pesados o detergentes, de modo que estos orgánulos o sus membranas internas pueden
utilizarse como biosensores para detectar este tipo de compuestos.
Tejidos
Existen determinados tejidos vegetales que debido a su función fisiológica en el
organismo son una fuente de determinadas enzimas o sistemas enzimáticos. Pueden utilizarse
distintos tejidos provenientes de hojas, raíces, frutas o semillas, en rodajas o bien en forma de
homogeneizados. Un ejemplo puede ser la utilización de rodajas de patata (ricas en la enzima
polifenol oxidasa) junto con electrodos de oxígeno para la determinación de mono y
polifenoles.
b). Sensores de bioafinidad
Se basan en la interacción del analito de interés con el elemento de reconocimiento,
sin que exista transformación catalítica, sino que se produce una reacción en la que se forma
un complejo analito-receptor. Para medir la interacción, ya que no existe consumo de
sustratos ni generación de productos, se suele utilizar un marcador del receptor o de un
elemento que compita con el analito por la unión al receptor, es habitual el uso de enzimas
como marcadores ya que permiten detectar mediante el sistema de transducción alguno de los
componentes de la reacción biocatalítica complementaria. El marcaje puede llevarse a cabo
también con sustancias fluorescentes.
Se encuentran disponibles distintos tipos de receptores de bioafinidad como
anticuerpos, lectinas, ácidos nucleicos, células completas, receptores, polímeros de impresión
molecular (PIMs), aptámeros y ácidos nucleicos peptídicos (ANPs).
Anticuerpos
Los anticuerpos (Acs) son glicoproteínas producidas por el sistema inmunitario que
pueden reconocer de manera selectiva a un antígeno (Ag). Los Acs contienen en su estructura
los denominados “sitios de reconocimiento/unión” frente a estructuras moleculares específicas
de los Ags. De acuerdo a este modelo, un Ac interacciona específica y reversiblemente con el
Ag que indujo su producción. Actualmente están siendo empleados, en variados ámbitos,
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Química Analítica I
sensores basados en Acs como elementos de reconocimiento (inmunosensores), entre ellos se
pueden destacar los aplicados a resolver problemas clínicos y de medioambie.
Lectinas
Son moléculas de naturaleza proteica y de origen no inmune que poseen la propiedad
de enlazarse de forma específica y reversible, a hidratos de carbono que se encuentren libres o
formando parte de estructuras más complejas. La aplicación de las mismas se fundamenta en
la capacidad que poseen de reconocer un determinado carbohidrato de manera específica,
uniéndose reversiblemente, sin alterar la estructura covalente de los ligandos glicosídicos
reconocidos. Estas, son moléculas de reconocimiento, fácilmente disponibles y económicas
que pueden asociarse a distintos transductores como piezoeléctricos o de resonancia de
plasmones superficiales.
Ácidos nucleicos
Los sensores bioanalíticos empleados para análisis de ADN se basan en procesos de
hibridación (unión de una cadena de ADN con su cadena complementaria). Estos sensores
también conocidos como “genosensores” se usan para el reconocimiento y cuantificación de
ADNs diana en muestras de interés. Una vez concluida la hibridación se utilizan marcajes
específicos que se unen a las secuencias hibridadas, como marcajes fluorescentes o
enzimáticos. Pueden acoplarse sistemas de transducción ópticos, gravimétricos o
electroquímicos. Dentro de las aplicaciones de los genosensores podemos mencionar la
detección de organismos genéticamente modificados en alimentos.
Células completas
Las células poseen diversos receptores moleculares de membrana que cuando se unen
con un determinado ligando disparan respuestas fisiológicas amplificadas, como la apertura
de canales iónicos, la activación de sistemas mensajeros secundarios y de enzimas, que
pueden ser monitoreados por distintos transductores. Sin embargo su acción puede ser
bloqueada cuando se unen a diversos compuestos tóxicos, impidiendo la unión del ligando
correspondiente, por lo que pueden emplearse para la determinación de dichos compuestos.
Un ejemplo son las toxinas marinas paralizantes (abundantes en las células que forman
la membrana de la vejiga de rana) que ejercen su acción bloqueando canales de sodio de
modo que puede utilizarse este tejido para la fabricación de biosensores. Pueden utilizarse
células que expresen los receptores de manera natural o bien pueden modificarse
genéticamente para que expresen receptores de interés.
Receptores
Diversos receptores moleculares y proteínas de unión se hallan en las membranas
celulares, los cuales pueden aislarse e inmovilizarse sobre diferentes superficies y utilizarse
como elementos de reconocimiento asociados a diversos transductores.
Existen proteínas transportadoras formando canales que pueden acoplarse a
membranas lipídicas sintetizadas artificialmente. La unión del analito a estos receptores
produce la formación de canales a través de los cuales se genera un flujo de iones que puede
ser monitoreado por transductores como los electroquímicos, por lo que estos tipos de
receptores no requieren un marcaje enzimático. Un ejemplo de su aplicación es la
determinación de compuestos tóxicos que ejercen su acción sobre los organismos mediante la
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Química Analítica I
unión a dianas específicas como es el caso de los gangliósidos que se utilizan para detectar la
toxina colérica.
Polimeros de impresión molecular (PIMs)
Los PIMs son estructuras moleculares sintéticas que poseen propiedades de
reconocimiento molecular selectivo, ya que los sitios de reconocimiento dentro de la matriz
del polímero son complementarios al analito en cuanto a la forma y posición de los grupos
funcionales. Algunas de estas moléculas biomiméticas poseen una selectividad y constante de
afinidad, comparable a la de los anticuerpos monoclonales o receptores (ambos sistemas de
reconocimiento naturales), lo que le otorga la posibilidad de emplearse como elemento de
reconocimiento en diversos dispositivos, sustituyendo a aquellas de origen biológico, por
ejemplo, para detección de plaguicidas, fármacos etc.
Aptámeros
Un aptámero es una secuencia de oligonucleótidos (ADN o ARN) de cadena sencilla
sintetizada artificialmente, capaz de reconocer diversas moléculas diana con elevada afinidad
y especificidad. Estas moléculas biomiméticas se asemejan a los anticuerpos. Se pliegan en el
espacio y adquieren una conformación con determinadas regiones a las que puede unirse el
analito. Estas moléculas presentan ventajas en comparación con los elementos biológicos, ya
que poseer mayor estabilidad, su inmovilización es sencilla y son de bajo costo de
producción. Pero tienen el inconveniente de presentar constantes de afinidad pequeñas.
Ácidos nucleicos peptídicos-ANPs
Los ANPs son moléculas sintéticas, sin pentosa, sin grupo fosfato y en su reemplazo
hay una molécula de N-2-aminoetilglicina, permitiendo mimetizar los ácidos nucleicos ADNARN. Estas moléculas biomiméticas comparadas con sus análogos naturales, poseen mayor
afinidad para establecer enlaces con cadenas de ADN, la falta de repulsión electrostática entre
ellas hace que estos enlaces sean más fuertes.
En el diseño de sensores bioanalíticos la elección del material biológico depende de
las características del compuesto a analizar, sin embargo la elección del transductor está
condicionada por el tipo de elemento de reconocimiento elegido, ya que este determina cual
será la variación que ocurra como consecuencia de la interacción, en las propiedades físicoquímicas. Dependiendo del tipo de interacción que se establece entre el receptor biológico y el
analito, los biosensores pueden considerarse como de medida directa, a partir de la medida de
las características del analito, o indirecta, empleándose un reactivo auxiliar que experimenta
un cambio en sus propiedades cuando el analito interacciona con el receptor.
Clasificación de los sensores bioanalíticos de acuerdo a al tipo de transductor
empleado
El transductor, en cuyas proximidades se encuentra inmovilizado o retenido el material
biológico, es el elemento que convierte las variaciones de las propiedades físicas o químicas
que se producen por la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito en una
señal que puede ser amplificada, almacenada y registrada. La señal generada por el
transductor en algunos casos no puede ser interpretada directamente y es necesario la
utilización de un software para su procesamiento. Dicha señal debe ser sensible, fácil de
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Química Analítica I
monitorear y con el mínimo de ruido. Existen distintos tipos de transductores y de acuerdo al
tipo de bioreceptor con el que se combina pueden formarse múltiples tipos de biosensores
(Figura 4). Atendiendo a este criterio, los biosensores pueden clasificarse en:
Ópticos
Los transductores ópticos se basan en la medición de las variaciones que se producen
en las propiedades de la radiación electromagnética (REM) como consecuencia de la
interacción física o química entre el analito y el elemento biológico. Las bases físicas de este
tipo de sensores son los cambios que ocurren en la absorción de REM, luminiscencia,
dispersión de REM o índice de refracción, cuando la radiación incide sobre las superficies de
reconocimiento. El sistema básico de medida consiste en una fuente de REM, el elemento
biológico (donde se encuentran las moléculas receptoras) y el detector.
Piezoeléctricos
Los sistemas de transducción piezoeléctricos, másicos, gravimétricos o acústicos
miden cambios directos de masa inducidos por la formación del complejo analito-elemento de
reconocimiento. Los materiales que se utilizan para el diseño de este tipo de biosensores son
materiales piezoeléctricos. Estos cristales se recubren con el elemento de reconocimiento que
suele ser de bioafinidad y se ponen en contacto con la muestra que contiene el analito. La
señal medida es la variación observada en la frecuencia de oscilación antes y después de que
se produzca la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito.
Dispositivos con este tipo de detección, utilizados en el sector alimenticio, han
permitido llevar a cabo el seguimiento de propiedades reológicas como la textura mediante la
detección de vibraciones por fractura de las muestras de interés.
Termométricos
Las reacciones enzimáticas son generalmente exotérmicas, y el calor producido
durante las mismas, está relacionado con la concentración del analito. Dichos cambios de
temperatura pueden ser percibidos por un termistor a la entrada y a la salida del dispositivo en
el que se encuentran inmovilizadas las enzimas. Debido a que el calor de reacción puede ser
medido por cualquier reacción catalizada enzimáticamente, esta propuesta es bastante general
y puede permitir el desarrollo de sensores para numerosos analitos.
Nanomecánicos
En este tipo de transductores, el elemento de reconocimiento biológico es
inmovilizado sobre la superficie de una micropalanca de silicio, que se sumerge en una
muestra líquida. Generalmente se utilizan anticuerpos como elementos de reconocimiento. La
interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito produce un cambio diferencial en
la tensión superficial del líquido y la micropalanca sufre una respuesta de tipo nanomecánico
que consiste en un cambio de la deflexión y/o de la frecuencia de resonancia, la magnitud de
este cambio está relacionada con la concentración de analito.
Electroquímicos
Los transductores electroquímicos transforman la señal que se produce por la
interacción entre el sistema de reconocimiento y el analito en una señal eléctrica. El elemento
de reconocimiento biológico y el elemento de transducción deben estar en contacto. Se
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Química Analítica I
diferencian tres tipos de biosensores electroquímicos: conductimétricos, potenciométricos y
amperométricos que detectan cambios en la conductividad, en el potencial y en la corriente
generada, respectivamente.
Transductor conductimétrico
Este tipo de transductores mide los cambios de conductividad u otra propiedad
asociada a esta, provocados por el analito.
Transductor potenciométrico
Estos transductores se basan en la medida de la diferencia de potencial entre un
electrodo de trabajo y uno de referencia. La diferencia de potencial está relacionada con la
concentración de analito en la muestra.
Transductor amperométrico
En las técnicas amperométricas se aplica un potencial fijo sobre un electrodo de
trabajo respecto a uno de referencia. En cuanto a su composición este tipo de detectores está
formado por tres electrodos: de trabajo, de referencia y auxiliar que miden, a diferencia de los
anteriores, la intensidad de corriente asociada al flujo de electrones que se genera en la
superficie del electrodo de trabajo cuando tiene lugar la oxidación o reducción de alguna de
las especies implicadas en la reacción enzimática, y la señal que se obtiene se puede
correlacionar con la concentración de sustrato. En estos detectores, ya sea el sustrato o el
producto deben ser especies electroactivas y la velocidad de la reacción enzimática se controla
por el registro directo de la corriente (transferencia de electrones) producida.
173
Química Analítica I
MINIATURIZACIÓN
Los biosensores pueden ser fabricados en dimensiones reducidas gracias a los
procedimientos de microfabricación, la nanotecnología y la microelectrónica así como los
constantes avances en el campo de los dispositivos microfluídicos comúnmente llamados
“lab-on-chip”. Estos chips incorporan funciones que los biosensores no abordan. Por ejemplo,
los “lab-on-a-chip” no sólo llevan a cabo el análisis sino también la preparación de la muestra.
Gracias a su menor tamaño se ha incrementado el número de posibles aplicaciones de
los biosensores, especialmente, entre aquellas en las que el espacio físico, el volumen de
muestra o la localización del análisis son limitados. Además, estructuras de dimensiones
reducidas pueden integrarse en sistemas más complejos que lleven a cabo diversas tareas a la
vez (sistemas multisensores) y permiten disponer de dispositivos analíticos portátiles para
ensayos in situ.
Muchos de estos dispositivos de dimensiones pequeñas se componen de un elemento de
reconocimiento biocatalítico combinado con un microtransductor (transistores de efecto de
campo ion selectivos o ISFET, microelectrodos de oxígeno y peróxido de hidrógeno,
electrodos de fibra de carbono, etc).
Tecnología Microfluídica
La Microfluídica es la ciencia y tecnología en la que se procesan o manipulan
pequeñas cantidades de fluidos que van desde los microlitros, los nanolitros y hasta los
picolitros (es decir cantidades menores a 10-6 litros), usando canales con dimensiones de
decenas a cientos de micrómetros. Estudia el comportamiento de los fluidos en la microescala,
comprendiendo el diseño de sistemas en los que se utilizaran diminutas cantidades de fluido.
El comportamiento de los fluidos a microescala difiere sustancialmente de lo
observado en la macroescala. El estudio de los microfluidos es un campo multidisciplinar que
comprende partes de la Física, la Química, la Ingeniería, la Biotecnología, la industria médica
y los sistemas microelectromecánicos (MEMS).
Estos dispositivos están formados por canales con dimensiones menores a 1 mm de
diámetro. En este caso el número de Reynolds es extremadamente bajo, de tan solo unas
décimas, por lo tanto, el flujo es siempre laminar y no ocurren turbulencias; sólo la difusión
interviene en la mezcla de fluidos. Un efecto importante es que la relación de superficie por
volumen es muy alta, por lo que cualquier reacción química en un microfluido se ve muy
acelerada (Fig 6).
Figura 6 Dispositivo microfluídico
174
Química Analítica I
Con el desarrollo
sarrollo de la microfluídica surgieron: los Micro
icro Sistema
Sistemas de Análisis Total
(µTAS, Micro Total
tal Analysis Systems), que expresan la capacidad
acidad de rea
realizar, en un mismo
dispositivo, una serie
erie de análisis
análi consecutivos que se complementan. En la actualidad existen
diversos dispositivos
ivos comerciales
comerci
que hacen uso de microfluidos,
idos, como los “lab-on-a-chip”
(LOC), laboratorios
ios en un chip
chip.
El concepto
to LOC al parecer
p
es una extensión del µTAS
TAS y mani
manifiesta el interés de
incorporar en un solo dispositivo
disposi
todos los componentes necesarioss para realizar la síntesis
química de compuestos,
uestos, o bi
bien el análisis (caracterización, identificación
identificació y separación) de
reacciones complejas,
lejas, es ddecir realizan las funciones de un equipo
equi
de laboratorio
convencional, conn las ventajas de: requerir cantidades de muestra
estra y reactivos
reacti
muy pequeñas,
monitoreo de los resultados en
e fracciones de segundo mediante
nte el empleo de computadoras,
además de la automatización
matización y portabilidad. Esto no se logra con
on los exper
experimentos clásicos en
un laboratorio tradicional
radicional (Figura
(F
7). Tales ventajas hacen
en de estos dispositivos una
herramienta valiosa
sa para la química
qu
analítica.
Además dee LOC, estos microdispositivos reciben los nombres de sistemas
s
bio-microeléctrico-mecánicos,
os, conocidos
conocido en inglés como “BioMEMS”. Los sistemas
sistem LOC han sido
utilizados eficazmente
ente en aplicaciones
aplic
biomédicas y de monitoreo
oreo ambient
ambiental, así como para la
detección de la presencia dde iones en fluidos orgánicos,, la identificación
identifi
forense de
explosivos, el seguimiento
uimiento de contaminantes en el agua y atmósfera,
ósfera, el control de la calidad
de alimentos, técnicas
nicas analíticas
analític o de preparación tales como separación, marcaje químico y
detección y otros procesos de la industria química.
Figura 7 Comparación
Compar
entre un laboratorio convencional y un Lab-on
on-a-chip.
A partir dee los sistem
sistemas microfluidos se pueden obtener
tener una vvariada cantidad de
medidas interesantes
ntes tales como:
com coeficientes moleculares de difusión, vi
viscosidad elocuente,
pH, coeficientes químicos y cinética de reacción enzimática.
ca. Otras apl
aplicaciones incluyen
electroforesis capilar,
pilar, immunoensayos,
immu
inyección de proteínas
oteínas para el análisis por
espectrometría de masa, amplificación
ampl
en cadena de la polimerasa
erasa (PCR),
(PCR) análisis de DNA,
etc., muchas de estas
stas aplicacio
aplicaciones tienen utilidad para diagnóstico
tico ambiental
ambienta y clínico.
La miniaturización
ización de lo
los inmunoensayos dentro de plataformas
taformas de microchip combina
el poder de los dispositivos
ispositivos microfluidos
m
con la elevada sensibilidad
sibilidad y eespecificidad de las
175
Química Analítica I
interacciones antígeno-anticuerpo (ver capítulo V). La reducción de las distancias difusionales
y el gran área de superficie por volumen incrementan las posibilidades de que antígenos y
anticuerpos reaccionen inmunológicamente dentro de los canales.
Para el desarrollo de los dispositivos microfluídicos, el sistema de detección
constituyó uno de los principales retos, ya que se requieren técnicas muy sensibles, como
consecuencia de los volúmenes de muestra ultra-pequeños utilizados en entornos de tamaño
micrométrico. La fluorescencia inducida por láser y las técnicas electroquímicas son las
técnicas de transducción preferidas. Estas últimas ocupan un rol muy importante entre las
técnicas de detección debido a la factibilidad de miniaturización y la elevada compatibilidad
con técnicas de microfabricación. Asimismo, poseen una elevada sensibilidad y sus respuestas
no dependen de la longitud del camino óptico o de la turbidéz de la muestra.
Fundamentos de la microfluídica
En los dispositivos microfluídicos el tamaño de los canales, como se dijo
anteriormente, es de dimensiones micrométricas, por lo que el fluido a través de los mismos
es caracterizado por un valor pequeño del número de Reynolds, el cual se define como:
ρ. .
µ
Donde ρ es la densidad del fluido, vs es la velocidad media del flujo, L es la distancia característica y µ
es la viscosidad.
Para números de Reynolds menores a 2000, el flujo es completamente laminar y no se
producen turbulencias. La transición a flujo turbulento ocurre generalmente en un rango de
número de Reynolds de 2000. Para muchos microcanales L es igual a 4 A/P, donde A es el
área transversal del canal y P es el perímetro del canal. Debido a las reducidas dimensiones de
los microcanales, Re es generalmente mucho menor a 100, a menudo inferior a 1,0. El flujo
laminar proporciona un medio por el cual las moléculas pueden ser transportadas de una
manera relativamente predecible a través de los microcanales.
La dificultad que se presenta al intentar controlar ínfimas cantidades de fluidos ha
impulsado el desarrollo de métodos novedosos de bombeo. Existen dos métodos comunes que
se emplean para conseguir que un fluido avance a lo largo de un microcanal, estos métodos
son: flujo por presión y flujo electroosmótico.
Flujo por presión: en este caso el fluido es impulsado a través del microdispositivo
mediante bombas de desplazamiento positivo, como las bombas de jeringa (Figura 8). El
empleo de este método para el bombeo de microfluidos produce un perfil de velocidad
parabólico dentro del microcanal y se considera que la velocidad del fluido cerca de las
paredes del mismo es cero y en su parte central es máxima.
El flujo por presión presenta las ventajas de ser relativamente económico y
reproducible para el bombeo de fluidos en microdispositivos, además esta opción es cada día
más accesible debido a los avances en el desarrollo de microbombas.
176
Química Analítica I
Figura 8. Representación esquem
esquemática de un dispositivo microfluídico: Sistemaa de jeringas
je
(SJ), Dispositivo
microfluídico (DM), Detector
tor (D), Registrador (R) y Perfil de velocidad (PF) en el microcanal
micro
bajo condiciones
de flujo a presión, la máxima
ma velocidad
veloc
se encuentra en el centro del canal y see consid
considera cero en las paredes
del mismo.
Flujo electroosmótico.
smótico. Existen numerosos materiales que al poner
ponerse en contacto con
una solución acuosa,
osa, generan una reacción química instantánea
nea y la superficie
sup
del material
adquiere carga eléctrica.
léctrica. Si uun material de este tipo se emplea
plea para la fabricación de un
dispositivo microfluídico,
fluídico, las paredes del microcanal adquirirán
rán carga elé
eléctrica, formándose
una doble capa eléctrica
rica de iones
io
sobre las mismas. Si a lo largo de este canal se aplica un
campo eléctrico, los iones de la doble capa se moverán hacia
ia el electro
electrodo de polaridad de
signo contrario. Esto creará uun movimiento del fluido que está cercano a las paredes y se
transferirá al restoo del fluido debido
d
a las fuerzas viscosas dentro
tro del mismo
mismo.
Ventajas de la microfluídica
fluídica
La aplicación de la microfluíd
microfluídica tiene como resultado:
Reducción en el consumo de reactivo y en la producción dee desechos.
Reducción de costos de operación
op
y análisis.
Reacciones y análisis químicos
quím
más rápidos (algunas en solo
lo algunos se
segundos).
Reacciones y análisis químicos
quím
más seguros.
Mejora en la calidad de la información obtenida.
Mejor control de los parámetros
parám
de una reacción o de un proceso.
Permite una mejor
ejor separac
separación de los productos a obtener.
sitivos de
d microfluidos
Fabricación de dispositivos
En el diseño
eño y fabric
fabricación de los dispositivos de microfluidos
icrofluidos se ha dado mayor
importancia a la simplicidad por encima de la complejidad, y otro tanto a la funcionalidad
sobre la miniaturización.
177
Química Analítica I
La construcción de dispositivos microfluídicos puede llevarse a cabo empleando
diversos materiales tales como: vidrio, silicona o polímeros. La mayoría de los dispositivos
son construidos con estos materiales, pero la elección de uno en particular dependerá de la
aplicación a la cual este designado.
Silicona: en los primeros trabajos acerca de tecnología microfluídica, se hizo uso de
este materia, ya que los procedimientos de grabado de patrones (patterning) y unión de
láminas de silicona ya se habían desarrollado en la industria electrónica de los microchips. La
silicona es estructuralmente fuerte, y puede ser grabada isotrópica y anisotrópicamente para
generar características precisas a escala nanométrica.
Vidrio: aunque más frágil que la silicona, es ópticamente transparente, puede ser
utilizado para transportar líquidos electroosmoticamente y es altamente resistente a los
solventes. Para aplicaciones en inmunoensayo, particularmente aquellos que implican
detección óptica, el vidrio es el material estándar. Dispositivos de vidrio y silicona poseen, sin
embargo, una serie de deficiencias en los procesos de grabado húmedo utilizados en la
fabricación.
Polímeros: pueden ser fácilmente producidos en masa, ya que los costosos
procedimientos de patterning son sólo requeridos para la construcción de los moldes. En la
actualidad existe una gran variedad de polímeros y plásticos, lo que ha originado una mayor
atracción por los mismos. Uno de los polímeros más estudiados es el polidimetilsiloxano, o
PDMS. Este es un polímero que puede ser fabricado rápidamente y con dimensiones tan
pequeñas como 10 nm.
Técnicas de fabricación
Las técnicas de fabricación usadas para construir dispositivos microfluidos, son
relativamente baratas y sencillas, aplicables para la producción en masa. Dentro de las mismas
podemos encontrar:
Fotolitografía (también litografía óptica) es un proceso usado en microfabricación que
utiliza la luz para transferir un patrón geométrico desde una fotoresina a un sustrato sensible
(oblea), posteriormente una serie de tratamientos graban el patrón de la resina en el sustrato.
La fotolitografía (también denominada "microlitografía" o "nanolitografía") trabaja de manera
análoga a la litografía empleada tradicionalmente en los trabajos de impresión.
Procedimiento fotolitográfico básico: La oblea o sustrato se calienta inicialmente a
una temperatura suficiente para eliminar la humedad, se limpia utilizando procedimientos
químicos. Posteriormente sobre la oblea se deposita una fotoresina, la cual cambia su
solubilidad al ser irradiada con luz ultravioleta. Luego se expone la oblea revestida a un
patrón de luz intensa generalmente luz ultravioleta. Tal exposición produce una imagen en la
oblea a través de la fotoresina. La capacidad de proyectar una imagen clara sobre la oblea está
gobernada principalmente por longitud de onda de la luz que se utiliza. Actualmente se hace
uso de ultravioleta profundo (DUV) con longitudes de onda de 248 y 193 nanómetros, que
permiten el grabado de diseños diminutos. Posteriormente, las zonas no protegidas por la
resina son atacadas por alguno de los procesos de grabado que se detallan a continuación.
Grabado: El grabado es el método a través del cual quedan definidas las estructuras de
los dispositivos, que previamente han sido traspasadas desde la resina a la oblea utilizando
178
Química Analítica I
técnicas fotolitográficas. La fotoresina colocada sobre la oblea actúa protegiendo ciertas
zonas, siendo el resto eliminado mediante alguna de las técnicas de grabado.
Sputtering: Este procedimiento se utiliza para depositar un material específico sobre la
superficie de un sustrato, por ejemplo para generar un electrodo de lámina de oro sobre la
superficie de un plancha polimérica, dicho electrodo formará parte posteriormente del sistema
de detección de un sensor electroquímico. En el proceso de sputtering los átomos del material
a depositar son extraídos mediante bombardeo con iones, generalmente de un gas inerte. Un
diodo situado entre dos electrodos produce una descarga que ioniza al gas presente en una
cámara, generando plasma. Los iones son acelerados a causa de la diferencia de potencial y
golpean al cátodo donde está situado el material a depositar, liberando los átomos que se
depositan seguidamente sobre el sustrato, situado en el ánodo.
Materiales y Técnicas Empleadas en el Diseño y Desarrollo de Sensores Bioanalíticos
Microfluídicos
Materiales Nanoestructurados
La nanotecnología se refiere a la ciencia aplicada al diseño, fabricación y
manipulación de la materia a escala atómica y molecular, en el rango de 1 a 100 nanometros
(1 metro=1.000mm=1.000.000 micras = 1.000.000.000 nanómetros). Si hablamos en términos
comparativos una hoja de papel tiene un grosor aproximado de 100.000 nanómetros, un
cabello humano y un leucocito tienen 80.000 y 10.000 nanómetros de diámetro
respectivamente.
La característica más importante de los nanomateriales es que cambian sus
propiedades de acuerdo a la reducción de su tamaño, es decir, algunos incrementan su
conductividad eléctrica y calórica mejorándola, otros incrementan su resistencia y ciertos
materiales pueden presentar diferentes propiedades magnéticas e incluso pueden cambiar de
color y reflejo de la luz cuando se reduce su tamaño a esta escala. Los nanomateriales además
presentan una mayor superficie en relación a su masa, propiedad que les confiere una mayor
capacidad de interacción con otros materiales y una mayor reactividad. Tales cambios
proveen diferentes usos como la inclusión de nanopartículas para reforzar materiales, el
perfeccionamiento de las propiedades de ciertos materiales diseñados para trabajar en
condiciones extremas, la investigación para detectar y neutralizar la presencia de
microorganismos o compuestos químicos contaminantes.
Clasificacion de nanomateriales
Nanopartículas Se trata de partículas muy pequeñas con cuando menos una dimensión
menor de los 100 nm. Las nanopartículas de silicato y las metálicas, se usan en los
nanocompuestos poliméricos.
Nanotubos Son estructuras tubulares con diámetro nanométrico. Aunque pueden ser de
distinto material, los más conocidos son los de silicio y principalmente, los de carbono. Son
tipo canuto o de tubos concéntricos (o multicapa) (Fig 9). Algunos están cerrados por media
179
Química Analítica I
esfera de fullereno,, una forma
form estable del carbono, del nivell siguiente al del diamante y el
grafito.
Figura 9 Nanotubos de carbono
Superficies nanomoduladas
uladas Son ordenadas o multicapa.
Materiales nanoporosos Principalmente
Prin
de sílica y alúmina.
na. Usados, por ejemplo, para
captura de elementos
ntos nocivos.
Nanocapas Se trata
rata de recubrimientos
recub
con espesores de nanoescala.. Son usados en barnices,
lubricantes o para endurecer compuestos
co
frágiles o como protección
cción ante la corrosión.
Nanoestructuras biológicas
lógicas Materiales biomiméticos a escalaa nanométrica.
nanométric Como polímeros
usados como basee para el crec
crecimiento de la piel, o gomas antimicrobianas.
icrobianas.
Nanocompuestos Se trata de materiales creados introduciendo,
uciendo, en bajo porcentaje,
nanopartículas en un material base llamado matriz. Con el resultado
ultado se obt
obtiene materiales con
propiedades distintas
intas a las de
d los materiales constituyentes. Por ejemplo
ejemp en propiedades
mecánicas (como la rigidez y la resistencia). Los nanopolímeros son usados
usad para relleno de
grietas, por ejemplo en estructuras
estruct
afectadas por sismos.
ENZIMO INMUNO-ANÁLIS
ANÁLISIS
Los sensores
res miniaturizados
miniatur
pueden incorporar el enzimo inmuno-analisis
inmu
(EIA),
proporcionando una
na herramie
herramienta muy valiosa para la determinación
inación de diversos
d
analitos insitu, con la ventaja
ja de hacerlo en un tiempo considerablemente
te corto, de fo
forma sencilla y con
la especificidad que
ue sus inmunorreactantes
inmun
ofrecen.
180
Química Analítica I
La técnica de EIA con
conocida como análisis por enzimass fijadas a inmunoabsorbentes
in
o
ELISA (Enzyme-Linked
Linked ImmunoSorbent
Immu
Assay) se basa en el uso de inmunorreactantes,
inmu
tales
como antígenos (Ags) y anti
anticuerpos (Acs), marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes
tantes retenga
retengan tanto la actividad inmunológica
ica como enzimática.
enz
El empleo
de estos marcadores
res inmunoqu
inmunoquímicos permite valorar las uniones Ag-Ac
Ac que
q se producen tras
un período de incubación,
ncubación, con
c
la adición posterior de un sustrato. Al
A estar uno de los
componentes (Agg o Ac) marcado
m
con una enzima e insolubilizado
solubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente)
te) el comp
complejo Ag-Ag formado quedaráá inmovilizado,
inmoviliza
facilitando la
separación de loss reactivos libres
li
y combinados. La formación
ión del complejo
comp
inmunológico
será fácilmente revelada mediante
med
la adición de un sustratoo específico. La sensibilidad y
especificidad de la interacció
interacción Ag-Ac es requisito fundamental
ntal para el desarrollo del EIA
sobre todo cuandoo se pretende determinar un analito presente en una matriz
mat compleja donde
se existen diversoss componentes.
component
Anticuerpos
Los anticuerpos
erpos (Acs) son componentes fundamentaless del sistema inmunológico pero
además se encuentran
tran formando
formand parte de reactivos biológicos empleados en
e análisis de rutina
tanto en el laboratorio
torio clínico como en investigación.
Se conocen
en cinco tipos
tipo de Igs: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cad
cada uno con ciertas
características distintivas,
tintivas, tale
tales como tamaño, carga, composición
ón de aminoácidos
aminoác
y contenido de
hidratos de carbono (Fig 10)..
Figura 10 Tipos de inmunoglobulinas
Los Acs presentan sitios de reconocimiento y unión con determinantes
determi
antigénicos,
que se denominann paratopes; todas las moléculas de Acs secretadas
retadas por uun plasmocito dado,
poseen la misma especificidad
idad antigénica, es decir, reconocen el mismo Ag.
La estructura básica que
qu posee una molécula de Ac, la cual se observa
obser en la Figura 11,
está constituida por
or cuatro cadenas
cad
polipeptídicas: dos cadenass pesadas de aproximadamente
50-70 kD, idénticas
icas entre sí, y dos cadenas livianas (L) dee aproximadamente
aproximad
23-25 kD,
iguales entre sí. Las dos cade
cadenas pesadas están unidas por enlaces
laces disulfuro
disulfu y a su vez cada
cadena liviana está
tá unida a una cadena pesada también por enlaces disulfuro.
disulfur
El término paratope
aratope hace referencia al sitio (región
gión pequeña
pequeñ de unos pocos
aminoácidos) de combinación del Ac con el Ag. Este, está determinado
erminado en forma conjunta por
la estructura espacial
acial de las regiones
r
VL y VH, por lo tanto, una molécula
molécu de Ac como la
mostrada en la figura 11 posee dos sitios de combinación, es decir,
ecir, es bival
bivalente.
181
Química Analítica I
Figura 11
1 Estructura básica de una molécula de anticuerpo
uerpo
Antígeno
Se denomina
ina Ag a toda
t
sustancia que introducida en un ind
individuo genera una
respuesta inmune.. Todos los microorganismos, virus, bacterias,
as, parásitos y hongos, generan
respuestas inmunes,
es, por lo que en el sentido más amplio todos se comporta
comportan como Ags.
Los Ags poseen
oseen determinadas
determ
propiedades, entre ellas:
Inmunogenisidad:
genisidad: ccapacidad para inducir una respuesta
esta inmune.
Antigenisidad:
nisidad: capacidad
capa
para combinarse con Acs y/o receptore
receptores de células T.
Alergenicidad:
nicidad: capacidad
capa
para inducir algún tipo de respuesta alérgica.
Tolerogenicidad:
genicidad: capacidad
ca
para inducir una falta de respues
respuesta especifica en la
rama celular
elular o en la humoral.
De acuerdo a la cantida
cantidad de epítopes que posea un Ag este será clasificado como
monovalente o polivalente
livalente (Fi
(Figura 12).
182
Química Analítica I
Figura 12 Clasificación
Clasif
de los antígenos de acuerdo al númeroo de epítope
epít s.
Unión antígeno-anticuerpo
anticuerpo
El acoplamiento
iento estruc
estructural entre las macromoléculas de Ag y Ac está dado por varias
fuerzas débiles que
ue disminuyen
disminuye con la distancia, como los puentes
entes de hidrógeno,
hid
las fuerzas
de Van Der Waals,
s, las interacc
interacciones electrostáticas y las hidrofóbicas.
Para que ell determinan
determinante antigénico (epítope) y el punto de unión de
del Ac (paratope) se
combinen es necesaria
saria la presencia
prese
de agrupaciones atómicas adecuadas
ecuadas en la
las regiones del Ag y
del Ac que establecen
cen la interac
interacción, además el punto de unión debe tener una
un forma en la que el
epítope encaje correctamente,
orrectamente, de tal manera que se puedan formar simultáneamente
simu
varios
enlaces no covalentes.
La reacción
ión se caracteriza
car
por su especificidad,
d, rapidez, espontaneidad y
reversibilidad.
CLASIFICACIÓN
N DE LOS INMUNOENSAYOS
En esta técnica
cnica hay tres
tre piezas constantes que deben tenerse
enerse en cue
cuenta y que originan
distintos tipos de EIA en funci
función de cómo se combinen; las mismas
ismas son: el
e analito (Ag o Ac),
el conjugado enzimático (de Ag o de Ac) y el sustrato. Los inmunoesayos
inmuno
pueden ser
clasificados entonces en:
1) Inmunoensayos Directos
rectos. Medida directa del complejo Ag-Ac.
2) Inmunoensayos con
on Reactivos
Reac
Marcados o Indirectos. Requieren eel uso de material
marcado para medir
dir la concentración
concen
de Ag o Ac presente. Estos
tos a su vez se
s diferencian según
el tipo de marcador,
or, el método de separación y el diseño del ensayo.
a) Según el tipo de marcador:
marc
Radioinmunoensayos
sayos La reacción Ag-Ac se pone de manifiesto
nifiesto por la competición entre
el Ag o ell Ac que estemos
es
estudiando y una concentración
entración co
conocida del mismo
compuesto marcado radi
radiactivamente.
183
Química Analítica I
Fluoroinmunoensayos
nsayos Para la realización de estas técnicas
cnicas el Ac se marca con un
fluorocromoo detectándo
detectándose la formación del complejo Ag-Ac
Ac por
po la fluorescencia
emitida.
Enzimoinmunoensayos
ensayos Utilizan una enzima como marcador
rcador para amplificar la señal
obtenida de la reacción entre un Ag y un Ac. Dentro de los enzimoi
enzimoinmunoensayos hay
que destacar los Quimioinmunoensayos,
Quimio
en los cuales la enzima cata
cataliza la oxidación de
un sustrato.
odo de separación:
s
b) Según el método
Heterogéneos. Aquí el inmunorreactante
i
(Ac o Ag) se encuentra
ncuentra inmovilizado
inm
sobre un
soporte sólido. El Ag o Ac marcado unido al inmunorreactante inmovilizado
inm
debe ser
físicamente separado del
de Ag o Ac marcado que permanece
anece libre een la disolución. El
procedimiento
nto de separa
separación puede llevarse a cabo por precipitación de los Acs o por la
adición de unn segundo A
Ac que atrapa y precipita el Ac original.
Homogéneos. Tienen lugar
lug íntegramente en solución y noo requieren lla separación que sí
se necesitabaa en el paso anterior.
c) Según el diseño
ño del ensayo
e
No competitivos o “san
“sandwich” En los ensayos no competitivos,
etitivos, la m
medición del analito
marcado (Ac o Ag) es directamente
di
proporcional a la concentración
ncentración dde analito (Ag o Ac
dependiendoo del inmunorreactante
inmun
inmovilizado en el soporte sóli
sólido) presente en la
muestra
Competitivos. Los EIA competitivos
c
(ya sea por inmovilización
ilización de Ag
A o Ac) tienen por
objeto la cuantificación
antificación de Ag o Ac. En los formatos competitivos,
mpetitivos, eel analito sin marcar
presente en la muestra, ppor ejemplo Ag, compite con un antígeno marcado
mar
(Ag*) por los
sitios de unión
ión de un Ac especifico. El Ag sin marcar bloquea
loquea la capacidad
ca
del Ag* de
unirse, puesto
to que ese pu
punto de unión en el Ac ya se encuentra
uentra ocupado.
ocupa
Cuanto más Ag
haya en la muestra, menos
men Ag* se unirá al Ac, por lo que
ue la concentración
concen
de Ag en la
muestra estáá inversamen
inversamente relacionada a la concentración
ón de marca que se mide en el
formato competitivo
En el formato
to competitiv
competitivo en un solo paso (Figura 13), tanto el Ag* como analito de la
muestra (Ag)
g) compiten por
p una cantidad limitada de Ac.
Figu 13 Inmunoensayo Competitivo en un paso.
Figura
184
Química Analítica I
En el formato
mato competitivo
compe
en dos pasos, la concentración
tración de A
Ac del reactivo se
encuentra presente
te en exceso comparada con la concentración
ión de Ag. El reactivo del Ac
primero se incubaa con una muestra
mu
que contenga Ags de interés,
és, luego en el segundo paso, se
agrega el Ag marcado
arcado (Figu
(Figura 14). Los formatos de ensayos
yos competitivos
competit
en dos pasos
proporcionan una mejor sensibilidad,
sens
comparados con los formatos
ormatos de ensayos
e
de un solo
paso.
Figur 14 Inmunoensayo Competitivo en dos pasos.
Figura
Para la etapa
apa del revel
revelado del EIA se emplean sustratos
tos cromogénicos
cromogén
o mezclas de
sustratos y compuestos
estos cromogénicos.
cromo
En todos loss EIA en fas
fase sólida, independiente de las numerosas
umerosas est
estrategias existentes,
se pueden distinguir
uir 3 etapas:
1. Inmovilización del inmunor
inmunorreactante (Ac o Ag) en la fase sólida.
2. Incubación con
on la muestra
mues
de modo que ésta reaccione
ione con el inmunorreactante
inmovilizado.
3. Amplificación o modulación
modulació por medio de la utilización dee un conjugado
conjugad enzimático (esta
etapa puede ser dee más de un ppaso).
En EIA, es importante la conjugación del Ag o Ac con la enzima. Las enzimas son usadas
como marcadoress efectivos para
pa los métodos del inmunoensayo
ayo puesto qque sus propiedades
catalíticas permiten
ten la detecc
detección y cuantificación de niveless muy bajos en las reacciones
inmunológicas.
Las enzimas
as consideradas
considera
hasta ahora como más satisfactorias
tisfactorias sson: Peroxidasa del
rábano picante, Horseradish
eradish Peroxidase (HRP), Glucosa oxidasa, Fosfatasa
Fosfat
alcalina y beta
galactosidasa. Estas
tas enzimas son fijadas al Ag o Ac generalmente
ente median
mediante glutaraldehído o
peryodato. Los conjugados
njugados obt
obtenidos de esta manera han mostrado
rado ser estables
estab durante meses e
incluso años.
185
Química Analítica I
Las enzimas pueden ser clasificadas en seis grupos dependiendo de su modo de
acción.
Clasificación
Especies sobre las que actúan
Óxido – Reductasas (reacciones de oxidoreducción)
–CH–OH; –C=O; –C=CH–; –CH–NH2;
–CH–NH–
Hidrolasas (reacciones de hidrólisis)
Esteres; enlaces glucosídicos; enlaces peptídicos; enlaces
C–N; anhídridos de ácido.
Transferasas
funcionales)
(transferencia
de
grupos
Grupos de un átomo de C; grupos aldehídos o cetónicos;
grupos acilos; glucosilos; fosfatos; grupos que contienen
azufre.
Liasas (adición a los dobles enlaces)
–C=C–; –C=O–; –C=N–
Isomerasas (reacción de isomerización)
Racemasas
Ligasas (Formación de enlaces con escisión
de ATP)
–C–O–; –C–N–; –C–S–; –C–C–
En forma general, la reacción enzimática se puede expresar de la siguiente manera:
E + S → ES; ES → E + P
Donde: E es la enzima, S el sustrato, ES el complejo enzima-sustrato y P el producto de reacción.
Enzimas Inmovilizadas
Las enzimas inmovilizadas como reactivos analíticos ofrecen tres ventajas muy
marcadas sobre las enzimas solubles, ellas son:
a) Utilización cíclica: muchas enzimas son muy costosas en comparación con otros
reactivos y, en los análisis de rutina, se requiere mucha cantidad de este material. Las enzimas
inmovilizadas proveen un reactivo que puede ser utilizado repetidamente, en algunos casos
hasta 10.000 veces, lo que representa una disminución en los costos.
b) Estabilidad: las enzimas inmovilizadas muestran una mayor resistencia y
generalmente son más estables que cuando están en su estado natural. Esto permite trabajar,
en ciertos casos, en rangos de pH más amplios como así también a mayores temperaturas.
c) Menor interferencia: Las enzimas inmovilizadas son menos sensibles a los
activadores e inhibidores que comúnmente afectan a las solubles, por lo tanto, un inhibidor
muy potente decrece la actividad y, sólo activadores fuertes, aumentan el poder catalítico. Por
lo que, en muestras analíticas complejas (sangre, fluidos biológicos, líquidos residuales, etc.),
el uso de enzimas inmovilizadas tiene más aplicaciones que las solubles como reactivos
analíticos.
Una desventaja de la inmovilización de enzimas es que su actividad específica es
usualmente menor que la que corresponde a la enzima soluble, debido a la inmovilización de
186
Química Analítica I
regiones de la enzima que podrían ser necesarias para la completa configuración enzimática
activa.
Técnicas de Inmovilización del material de reconocimiento biológico
El elemento biológico de cualquier biosensor debe ser incorporado en el dispositivo de
manera tal que garantice su actividad, ya sea si posee propiedades catalíticas o bien que, el
sitio de unión en el que se produce la interacción con el analito se encuentre accesible al
mismo. La inmovilización del material biológico es el proceso más importante en la
fabricación de un biosensor, ya que características tan importantes como el tiempo de vida o
la sensibilidad, dependen en gran medida de la metodología de inmovilización utilizada. Los
métodos de inmovilización que se utilizan en la fabricación de biosensores, se suelen
clasificar en general, en dos grandes categorías: Retención física y Unión química
Adsorción Física: Este método se basa en las fuerzas de atracción de van
der Waals entre la enzima y la superficie de un soporte sólido; es el más
antiguo y simple de los procedimientos de inmovilización. La desventaja
es que las fuerzas de unión entre la enzima y el soporte no pueden ser
controladas fácilmente y son tan débiles que parte de la enzima se pierde
por desorción, dependiendo de las condiciones experimentales tales
como pH, fuerza iónica, temperatura y tipo de solvente. Si la fuerza de
unión es muy fuerte puede causar desnaturalización de la proteína. Ejemplo de ésta, es la
adsorción sobre un electrodo de grafito.
Entrampado en una matriz: Esta metodología se basa en la inclusión de
la enzima en matrices tales como geles, polímeros o pastas. Este tipo de
inmovilización es tan simple como la adsorción, puesto que el material
biológico sólo necesita ser mezclado con la pasta o polímero; esta mezcla
se aplica directamente sobre el electrodo o sobre un soporte adicional tal
como una membrana. Es la técnica de elección en inmovilización de células.
Unión por afinidad: Es una forma especial de adsorción, de especial
importancia en aplicaciones inmunológicas.
Enlace covalente: un requisito indispensable en esta técnica es contar
con grupos funcionales en la proteína y el soporte. Dichos grupos, en las
proteínas, son provistos por los grupos aminoacídicos. Los más
importantes son los grupos amino de L-lisina y grupos carboxílicos de
L-aspartato y L-glutamato. Es la técnica más comúnmente usada,
generalmente para vidrio de porosidad controlada (CPG) debido a su
elevada capacidad de unión enzimática y la resistencia a los cambios
mecánicos. El vidrio de porosidad controlada, CPG, es un vidrio de sílica altamente
macroporoso y es uno de los soportes más ampliamente usados actualmente. El vidrio de
porosidad controlada consiste en virutas de vidrio rígido poroso con un gran número de poros
de tamaño controlado. Sus grupos silanoles proveen una superficie reactiva para introducir
diferentes funcionalidades. Una de las formas más comunes para funcionalizar un soporte es a
187
Química Analítica I
través de la silanización
ización con un derivado silano el cual reaccionará
ccionará con un grupo óxido o
hidróxido en la superficie del vidrio, cerámica u óxido metálico.
lico. Hay una
un gran variedad de
derivados del silano
ano para elegir
ele
entre ellos, pero la funcionalización
alización con
co aminopropilo ha
probado ser la forma
rma más ex
exitosa de soporte. La silanizaciónn es un paso
pas importante en la
unión de la enzima
ma al soporte.
sopor Con respecto a la activación
ón del sopor
soporte, el método más
comúnmente usado
do es el método
mét
de acoplamiento con glutaraldehido,
raldehido, po
por su simplicidad y
aplicabilidad en la inmoviliza
inmovilización de la mayoría de las enzimas,
mas, con buenos
bue
resultados. Al
tratar el soporte con glutarald
glutaraldehido, se introduce un residuo carbonilo, el cual es propenso a
reaccionar con ell grupo ácid
ácido amino nucleofílico en la enzima.
nzima. Primeramente
Prime
ocurre la
activación del soporte
porte funcionalizado,
funcion
posteriormente la uniónn a la enzima para la formación
de una base de Schiff
hiff (Figura 15).
1
Figura 15 Inmovilización
Inmo
de enzimas en vidrio de porosidad
idad controlada.
controla
La formación
ón de la base de Schiff es catalizada ácida y reversiblemente.
reversiblem
El pH óptimo
para éstas reacciones
nes de condensación
conde
será un compromiso entre
tre la estabilidad
estabili
de la enzima y
la condición catalítica
lítica preferida,
preferid que es la forma imina no protonada.
otonada. La reversibilidad de la
base de Schiff puede
ede ser suprimida
supr
reduciendo la forma iminaa a forma am
amina con un agente
reductor débil.
188
Química Analítica I
En el caso de realizar determinaciones en soluciones crudas, como por ejemplo el
análisis de sueros lipémicos en muestras clínicas, muestras de fermentación biológica o en
aguas residuales (en control de polución), se suele utilizar tubos de nylon como soporte
enzimático y generalmente un sistema de flujo con escasa tendencia a obturarse. La enzima
puede ser covalentemente unida usando glutaraldehido.
Entrecruzamiento
“Cross-linking”
de
proteínas:
La
inmovilización mediante unión con glutaraldehido provee un
"entrecruzamiento" inter e intramolecular de moléculas de
enzimas. Este método se fundamenta en la producción de
agregados tridimensionales por medio de este reactivo
(bifuncional) el cual es completamente insoluble en agua y puede
ser adsorbido sobre una superficie sólida. El empleo de
glutaraldehído resulta en principio atractivo por las siguientes
razones: a) su simplicidad y condiciones de trabajo suaves, b) el éxito con una variedad
amplia de enzimas y c) las buenas propiedades para el flujo que ofrece el vidrio como matriz
inerte.
Propiedades de la enzima Peroxidasa del Rábano Picante
La enzima HRP es una oxido reductasa del peróxido de hidrógeno. Es una enzima
vegetal extracelular que participa principalmente en la formación de radicales libres
intermediarios de la polimerización y entrecruzamiento de los componentes de la pared
celular, en la oxidación de metabolitos secundarios esenciales en ciertas reacciones de defensa
contra patógenos y en la regulación del crecimiento y diferenciación celular.
El ciclo catalítico de HRP (Figura 16) se inicia con una oxidación rápida de la enzima
(HRP es bivalentemente oxidada al Compuesto I) por el H2O2 (o un peróxido orgánico), lo
cual incluye la transferencia oxidativa de 2 e- de la enzima y un átomo de oxígeno del H2O2 a
la porfirina férrica (Fe III) de la peroxidasa para formar el estado intermedio (oxiferril-radical
catión del grupo hemo, ([FeIV=O]+) y agua. Este Compuesto I es reducido nuevamente a
HRP por dos interacciones sucesivas univalentes con dadores de hidrógeno.
En el segundo paso, el radical catión es reducido por un mediador enzimático para dar el
oxiferril, Compuesto II (hierro en estado de oxidación +IV) y el producto P. El Compuesto II
es una forma intermedia oxidada por un electrón. En el último paso, la enzima retorna a su
estado nativo inicial, debido a la reducción del Compuesto II (un electrón/dos protones) por
otra molécula de mediador enzimático.
La forma reducida del mediador, sirve como co-sustrato de la enzima. Algunos dadores
de hidrógeno como o-dianisina producen una transferencia directa de dos electrones para
llevar a la enzima a su estado nativo. Compuestos nitrogenados como piridina e imidazol
pueden estimular esta transferencia.
Un exceso de H2O2 u otro sustrato puede inactivar a la enzima transformándola en los
compuesto III y IV. La formación específica del Compuesto I puede ser obtenida solo con
189
Química Analítica I
ciertos peróxidos,, pero existen
existe un gran número de sustancias
as que sirven como dadores de
hidrógeno.
Figura 16 Ciclo catalítico de HRP
HRP es la enzima más utilizada en EIA ya que por suu alto contenido
conten
en hidratos de
carbono facilita la reacción de conjugación a Acs. Los inmunosensor
munosensores amperométricos
explotan la corriente
ente catalític
catalítica generada revelando la presencia
ncia de HRP,
HRP la cual se utiliza
como marcador enzimático.
nzimático.
Mediadores Enzimáticos
zimáticos
Un mediador
iador enzimático
enzimá
es una especie de bajo peso
so molecula
molecular la cual transfiere
rápidamente los electrones entre el centro rédox de la enzima
zima y el electrodo
el
de trabajo
(carbono, platinoo u oro). Dur
Durante la reacción catalítica, el mediador
diador reacciona
reacci
primero con la
enzima oxidada y luego exp
experimenta una rápida transferencia
cia de electrones
electro
a la superficie
del electrodo (Figura 17).
Figura 17 Esquema de reacción enzimática con mediador
iador
El mediador
dor debe ser estable en las condiciones dee trabajo requeridas,
re
no debe
participar en reacciones
cciones secundarias
secu
durante la transferenciaa electrónica y debe poseer un
potencial rédox menor
enor que los interferentes electroquímicos presentes
resentes en la muestra.
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