Download 2ª. Clase: • Inmunoanálisis • Métodos electroanalíticos

Inmunoanálisis.
Son técnicas que permiten cuantificar
antígenos o anticuerpos, aprovechando la
especificidad y sensibilidad de la unión
antígeno/anticuerpo.
2ª. Clase:
• Inmunoanálisis
• Métodos electroanalíticos
Inmunoanálisis.
Ejemplos
Inmunoanálisis.
Immunoprecipitación
• Residuos de drogas veterinarias (antibióticos: gentamicina,
neomicina, cloramfenicol, sulfonamidas, hormonas). Tilosina
en miel (a partir de 2005).
• Cloramfenicol en langostinos (su límite impuesto por FDA y
la UE bajaron de 5 ppb a 0.3 ppb).
• Micotoxinas y otros contaminantes tóxicos: pesticidas,
herbicidas.
• Además: detección de carnes de distintas especies o
adulterantes no cárnicos (AOAC: proteína de soja en
hamburguesas)
• Autenticidad de jugos de fruta
• Adulteración de manteca (girasol)
• Detección de proteínas de gluten en alimentos para celíacos.
• Detección de residuos de enzimas de uso tecnológico:
papaína en cerveza.
• Organismos genéticamente modificados (GMO)
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Marcación de los anticuerpos o antígenos
Los antígenos (hormonas, proteínas, pesticidas,
etc.) pueden determinarse mediante técnicas que
involucran anticuerpos marcados para que la
Análisis mediante ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays)
unión antígeno-anticuerpo se haga evidente.
Marcación isotópica
Fluorescencia
Enzimas
Marcación con enzimas.
Elementos para desarrollar un ensayo
ELISA
S
Ab2/E
Hay varias alternativas:
Alternativa 1
P
muestra
Ab1
• Soporte
• Anticuerpo para unir al soporte (Ab1)
La cantidad de color generado por actividad de la
• Segundo anticuerpo marcado con la enzima
enzima sobre un determinado sustrato es
• Sustrato de la enzima
proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo
presente.
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Ejemplo: determinación de papaína en cerveza o de
glutenina en productos para celíacos (AOAC).
Alternativa 2
• Soporte
• Antígeno para unir al soporte
• Anticuerpo marcado con la enzima
• Sustrato de la enzima
Curva de calibración positiva
Este evalúa
la cantidad
de anticuerpo
Ejemplo:
determinación de
proteínas de
soja en
hamburguesas
(AOAC)
remanente luego
de reaccionar
con la muestra
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1. La muestra reacciona con un
anticuerpo titulado
4. Luego del lavado queda unido
el Ab en exceso
Muestra/Ag
Muestra/Ag
Ab1
Ab1
5. se agrega un 2do anticuerpo marcado con una enzima
2. se preparan microplacas con
el antígeno unido
3. El exceso de Ab se
une al soporte
lavado
lavado
6. Luego del lavado se agrega el
sustrato
Muestra/Ag
Ab1
Ab2/E
Otras alternativas
En los ensayos competitivos compiten anticuerpos
o antígenos libres con aquellos unidos a soporte o
enzimas. Siempre reaccionan de preferencia las
moléculas libres.
Sustrato
producto
7. El producto se determina por medición de
absorbancia a 405 nm
4
Esquema ELISA competitivo.
Factores clave en el desarrollo
de ELISA:
Adsorción
Unión
Lavados
Enzimas
Anticuerpos
Curva de calibración negativa
Adsorción
Como soporte sólido se emplean microplacas de
poliestireno o derivados obtenidos por modificación
química o irradiación de la superficie. También pueden
ser de PVC
El tiempo y la temperatura son los factores críticos
que determinan el éxito de la adsorción.
Lavados: Se emplean buffers fosfato, Tris o
imidazol a pH neutro.
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Actualmente existen en el mercado “kits”
para la realización de ensayos ELISA.
• Vit B1
• Salmonella
6
7
GMO
Para la detección de GMO se puede
emplear técnicas tales como análisis
inmunológicos (detección de la
proteína producida por el gen insertado)
o PCR (reacción de la polimerasa en
cadena), para la detección de los
segmentos del ADN.
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GMO – pruebas basadas en
detección de proteínas
Según el informe de ISAAA, Argentina continúa
siendo uno de los principales productores de
cultivos transgénicos, luego de EEUU y Brasil, con
23,7 millones de hectáreas en 2011, lo que
representa el 14,8% del área global cultivada con
transgénicos y un aumento del 3,5% con respecto al
año anterior.
En cuanto a las aprobaciones regulatorias,
Argentina autorizó en 2011 la siembra comercial de
tres maíces (MIR162, Bt11 X GA21 X MIR162, DP098140-6) y dos sojas (A2704-12, A5547-127),
completando la lista de 3 eventos de soja, 16 de
maíz y 3 de algodón aprobados hasta el momento.
Los tests de la tira reactiva están limitados a las
proteínas de eventos genéticos específicos (ej. Bt o
Roundup Ready) y por lo tanto, no son útiles para
detectar todos los eventos genéticos de GMO.
GMO - detección de ADN insertado
GMO
Reacción Polimerasa en Cadena (ó PCR).
El ADN insertado es mucho más estable que las
proteínas y está presente en las mismas
concentraciones en todo el OGM.
Como es imposible detectar a moléculas individuales
de ADN, estas se amplifican usando la técnica de la
PCR.
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PCR
Permite la amplificación de secuencias específicas
del ADN en pocas horas, facilitando el análisis
cualitativo y cuantitativo de dichas secuencias por
medio de técnicas de laboratorio comunes. El
procedimiento de la PCR se aplica rutinariamente en
el caso de alimentos no procesados, en los que el
material genético se encuentra intacto. Su selección
se fundamenta en su extrema sensibilidad que, bajo
condiciones experimentales óptimas, permite la
amplificación de más de un billón de copias de la
secuencia deseada a partir de una sola copia del ADN
original.
Desnaturalización:
separación de las cadenas de
ADN madre por aumento de
la temperatura (94°C).
Alineación: se baja la T para
permitir el reconocimiento d
primer con su secuencia
complementaria en hebra de
ADN madre ( 40 – 72°C).
Extensión: la T óptima para
actividad de ADN polimerasa
(72°C)
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif
Lectura de un microchip luego de la hibridación con DNA marcado.
Los puntos fluorescentes representan secuencias pertenecientes
a GM presentes en la muestra. En primer plano se muestra
una ampliación de uno de los 16 campos que conforman
el micro-array.
Análisis de GMO empleando micro-arreglos de DNA.
A, muestra de soja con bajos porcentajes de soja Roundup Ready (2%);
B, muestra de maíz con un bajo porcentaje de Bt-176 maize (1%).
Amarillo: sondas específicas de GMO; Rojo: DNA control para ver la
eficiencia de la hibridización (luciferasa) y especificidad para cada planta:
lecitina de soja o invertasa y zeina de maíz.
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Métodos electroquímicos para el
análisis de alimentos.
Análisis avanzado de alimentos
16/10/2011
Métodos electrométricos:
Medición
Diferencia de potencial
Resistencia (conductancia)
Corriente vs. voltaje
Corriente vs. concentración
Corriente vs. tiempo
Método
Potenciometría
Conductimetría
Polarografía
Amperometría
Coulombimetría
Otros:
Movilidad
Electroforesis
Métodos espectroscópicos: respuesta de
la interacción de radiación
electromagnética con el material en
análisis.
Métodos electrométricos: se basan en la
cuantificación de analitos a través de su
interacción con corrientes eléctricas.
Ejemplos del empleo de métodos
electroanalíticos en el análisis de alimentos
Principio
Ejemplos
Potenciometría
Electrodos ión selectivos.
Titulaciones potenciométricas.
Polarografía
Electrodo para O2
Amperometría
Electrodos enzimáticos.
Coulombimetría Detectores para CG.
Tit. automáticos para K.Fischer.
Conductimetría Detectores: para cromatografía
(HPLC, IC, GC), electroforesis capilar.
Determinación de contenido de agua.
Propiedades dieléctricas det. de cont. de agua
Características mecánicas de los materiales
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Potenciometría. Electrodos ión-selectivos.
Determinación de concentraciones a través de
mediciones de potencial
Celda de medición: electrodo ión-selectivo (o
indicador) + electrodo de referencia +
dispositivo de medida.
Ión solución
Ión membrana
Las cargas transportadas durante este proceso
generan la diferencia de potencial en la capa
límite, cuyo valor depende de la actividad del ión
en la solución, a través de la ecuación de Nernst.
El voltaje total de la celda de medida es:
E = Eo + (RT/ziF) ln ai
Pendiente de
Nernst
E es el voltaje de la celda de medida
Eo es el voltaje de de la celda de medida en
condiciones estándar
R es la constante de los gases
T es la temperatura (en K)
zi es la carga del ión
F es la constante de Faraday
ai es la actividad del ión en cuestión
Membranas de estado sólido.
Tipos de electrodos
La composición de la membrana es decisiva
para establecer a qué ión o compuesto será
selectivo el electrodo. Se puede diferenciar
entre membranas:
Vidrio
Membrana cristalina
Membrana líquida
Además de comp. iónicos se pueden
determinar los gases disueltos en equilibrio
con un ión, y sustratos que forman iones
durante transformaciones enzimáticas.
La más empleada es la de vidrio.
Los electrodos de vidrio son los electrodos iónselectivos más ampliamente empleados para la
medición de iones H+.
Para valores de pH muy altos (pH>10) o muy bajos
( pH<1) hay desviaciones, cuya magnitud depende
de la composición de la membrana.
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Electrodo de vidrio (pH)
pared externa
(E)1
(H+)1
Electrodo selectivo de H3O+
pared interna
(E)2
Electrodo combinado
de pH.
(H+)2 = cte
Fundamento: Los iones H3O+ se fijan parcialmente sobre la pared
externa e interna de la membrana de SiO2 y la diferencia de
concentraciones, genera un potencial eléctrico (de membrana EM).
Electrodos de membrana cristalina
El electrodo de referencia
externo se incorpora dentro del
dispositivo.
Electrodo de Cl-
se construyen con un precipitado muy poco
soluble del elemento en cuestión (por ejemplo,
AgCl, AgBr, AgI, Ag2S, que sirven para Ag o los
aniones). El más conocido es el de F-, realizado
con LaF3 que se emplea para determinar F- en
productos de uso dental. Con estos electrodos se
pueden determinar Cd+2, Pb+2, Cu+2, CN-.
Existen distintos diseños comerciales
que responden a distintos
tipos de aniones y cationes.
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Electrodos de membrana líquida
consisten en un solvente orgánico no
miscible con agua en el que se disuelven
intercambiadores de iones, o ionóforos.
El soporte de la solución son discos porosos
de plástico que absorben el líquido.
Los intercambiadores de iones pueden ser
tanto intercambiadores de cationes (como
fosfatos sustituidos que responden a Ca++ o
Zn++), o intercambiadores aniónicos (como el
ión caprilmetilamonio).
Electrodos de membrana líquida
Electrodos sensibles a los gases.
El intercambiador líquido forma
complejos con el analito.
A uno y otro lado de la interfase,
tiene lugar el intercambio:
[(RO)2POO]2Ca
2(RO)2POO- + Ca
orgánico
orgánico
Ejemplos
Ion
intervalo
respuesta
2+
acuoso
La diferente concentración
de Ca2+ a ambos lados genera
un incremento en el valor del
potencial que se puede medir
interferencias
Son electrodos ión-selectivos que responden a
compuestos no iónicos debido a un equilibrio preexistente entre un gas y la solución en la que los
iones son producidos.
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Electrodo para CO2
Emplea una membrana permeable al gas, para
separar la solución de la muestra de la solución
interna del electrodo. El CO2 disuelto en la
muestra difunde a través de la membrana hasta
que se alcanza el equilibrio entre la presión parcial
de CO2 en la muestra y en la solución interna del
electrodo.
H+ + HCO3-
CO2 + H2O
[H+] [HCO3-]
=
E
=
Eo
+
k. log H+
Donde:
E: potencial medido
Eo: potencial de referencia (una constante)
H+: concentración de iones H
k: pendiente del electrodo.
De esta manera, la concentración de CO2 es
directamente proporcional a la concentración de H+
E
=
Eo
+
k. log CO2
constante
CO2
La concentración de HCO3 - se puede considerar constante, y
H+ = CO2*constante
Electrodo para amoníaco
El NH3 en la solución de análisis difunde a
través de una membrana de teflón, por la cual
los compuestos iónicos no pasan, hasta el
electrolito interno. Esto causa un cambio de
pH, de acuerdo con:
NH3 + H2O
NH4+ + OH-
Este cambio de pH se detecta por
medio de un pHmetro.
APLICACIONES DE ELECTRODOS SELECTIVOS
Nitrato y nitrito en alimentos base de carnes.
Determinación de cloruros.
Floruros en agua, bebidas etc.
Calcio en leche
Potasio en jugo de frutas.
Nitrato, potasio calcio y cloruro en suelo y aguas
Control analítico de cianuro,fluoruro sulfuro en efluentes,
aguas naturales..etc
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Estación de Trabajo para Titulaciones Potenciométricas
Alimentos y bebidas
· Número de peróxido: grasas y aceites comestibles
· Cloruros: leche, manteca, otros lácteos
· Acido ascórbico: jugos de frutas y alimentos en general
Medio ambiente y Agua
· pH y alcalinidad
· Calcio y Magnesio
· Sulfato
· Demanda química de oxígeno (DQO)
Industria química y farmacéutica
· Determinaciones ácido-base en medio acuoso / no acuoso
. Karl Fisher
· Determinaciones redox
Otra aplicación de los electrodos de pH:
Determinación de la actividad enzimática
Como consecuencia de la actividad enzimática se
generan o se consume protones, lo que causa un
cambio de pH.
Se puede mantener el pH constante y luego medir
la catidad de ácido o base empleados.
Sistema pH-stat
Ej. para determinación de lipasa, esterasa,
proteasa, colinesterasa
Polarografía
Monitor polarográfico de oxígeno
Consiste en una medición polarográfica
(corriente vs. Votaje).
Cátodo: metal noble (oro o platino)
Ánodo: usualmente de plata.
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Solamente una pequeña porción del electrodo
de Pt está expuesta, el resto del alambre está
sellado con vidrio o resina epoxi.
Una membrana cubre la punta del cátodo de
alambre de Pt, y debajo de la membrana una
pequeña porción de electrolito permite un
contacto eléctrico entre el ánodo y el cátodo.
La reacción que ocurre en el cátodo es:
O2 + 4H+ + 4e- --> 2 H2O
Las características de la membrana
determinan la velocidad de difusión
de O del medio externo hacia el
cátodo, lo que determina la
sensibilidad,
velocidad de respuesta y
linealidad del electrodo de O.
Otras sondas para O2 cuentan con un
electrodo plano circular de plata, concéntrico
con uno plano anular de Pb.
A medida que el O2 difunde a través de la
membrana y encuentra el voltaje aplicado, se
reduce en el cátodo (el metal del cátodo actúa
como una superficie catalítica).
cátodo: 2e- + 1/2 O2
ánodo: Pb + 2OH-
2OHPbO + H2O + 2e-
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Coulombimetría
Conductividad eléctrica
E·jemplo: Método de Karl Fischer para la determinación de agua
.
C5H5N . I2 + C5H5N . SO2 + C5H5N + H2O
C5H5N . SO3 + CH3OH
I = (V2 – V1)/R = (V2 – V1)/ (ρl/s)
2 C5H5N.HI + C5H5N. SO3
C5H5N(H)SO4CH3
En un electrodo (de trabajo) se genera iodo electroquímicamente mediante
pulsos de corriente.
Se obliga al sistema a producir la reacción mediante una corriente
constante. Se mide la duración de un pulso con la indicación voltamétrica
de punto final, con un electrodo de platino como contraelectrodo.
Permite determinar cantidades extremadamente pequeñas de agua.
Principio: por cada 1 F que circula se oxida o reduce 1 equivalente gramo
de la sustancia. 1F = 96494C
I = (V2-V1) (κ.s/l)
R es la resistencia
ρ es la resistividad
s es la sección de la muestra
l es la longitud de la muestra
κ es la conductividad
Conductividad eléctrica
Análisis de aguas
La conductividad está íntimamente relacionada con la suma
de la concentración de los iones.
Aproximadamente el valor de la conductividad en μS/cm por
un factor que oscila entre 0,55 y 0,7 es igual al contenido de
sólidos en mg/L.
Agua de mar ~ 50000μS/cm;
aguas residuales 600 a 2000 μS/cm;
aguas de pozo 150 a 1000μS/cm
aguas de río de 100 a 3000 μS/cm.
La medida de conductividad es función de la
concentración y movilidad de los iones.
En sistemas de bajo contenido acuoso la limitante para la
movilidad es el contenido de agua.
En sistemas de alto contenido de agua no hay
impedimentos para la movilidad iónica y la
conductividad es función de la concentración de iones.
La conductividad se mide mediante instrumentos
comerciales de lectura directa de µS/cm a 25°C con un ε
< 1%.
En vinos la determinación de conductividad está relacionada
con la genuinidad.
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En definitiva, la conductividad depende de la concentración
de iones y de su movilidad, por lo tanto, en un amplio rango
de concentraciones o temperaturas, la dependencia será:
Sensores y biosensores
Partes del Sensor
Conductividad
(µS)
Elemento de reconocimiento
Elemento Transductor
Convierte el reconocimiento químico en una señal electrónica medible
Elemento Amplificador
% de sólidos
(o T)
Elementos de reconocimiento molecular
– Enzimático (una enzima o una cascada de enzimas)
– Immunológico (Antígeno-Anticuerpo)
– Genómico (hibridización de DNA)
– Células, tejidos, microorganismos
– Receptores artificiales
– Membranas lipídicas
Elementos transductores
(generación de la señal)
– Eléctrica
– Óptica
– Acústica
– Magnética
– Calorimétrica
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Algunos ejemplos de biosensores enzimáticos para
el análisis en el control de alimentos:
Elementos amplificadores de la señal
– Potenciométrico
– Amperométrico
– Coulombimétrico
– Transistor molecular
L-lactato leche, fermentaciones lácticas. Emplea
lactato oxidasa y detección amperométrica.
Gránulos de almidón dañados y actividad
diastásica. Aptitud panadera de harinas Emplea αamilasa, glucoamilasa y glucosaoxidasa y un
electrodo para oxígeno.
Glucosa y lactosa leche y productos lácteos, control
de hidrólisis de lactosa. Emplea GOD, βgalactosidasa y detección amperométrica.
Biosensores electroquímicos
Hipoxantina, inosina e IMP determinación de
frescura de pescado.
Emplea nucleosidasa, nucleósido-fosforilasa y
xantino oxidasa en un electrodo de C vítreo
modificado y un electrodo para oxígeno.
Glucosa, lactato y colesterol Emplea GOD, LO y CO
y un electrodo para oxígeno.
Ejemplo: detección de H2O2 para la medición
de biomoléculas.
Algunos ejemplos de reacciones que liberan H2O2 y
permiten cuantificar biomoléculas
Medición de glucosa
Etanol control de fermentaciones. Emplea ADH,
NADH y electrodo de pasta de C.
Histamina, putrescina y cadaverina. determinación
de frescura de pescado. Emplea diamino oxidasa y
detección amperométrica.
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Medición de glutamina
Medición de Sacarosa
Medición de etanol
Y lo mismo para almidón, lactosa, galactosa, etc.
Medición del peróxido de hidrógeno generado
1. Mediante un electrodo de Pt
El H2O2 se oxida en el ánodo de platino, produciendo
electrones. El flujo de electrones es proporcional a
la concentración de H2O2 y, por lo tanto, a la
concentración de sustrato.
Membranas de tres capas.
1. Policarbonato poroso, limita la difusión del sustrato en la
segunda capa previniendo que la reacción se vuelva limitada
por difusión.
2. Enzima, por ejemplo glucosa-oxidasa.
3. Acetato de celulosa, permite que solo pequeñas moléculas,
tales como peróxido de hidrógeno alcancen el electrodo,
eliminando muchos compuestos electroquímicamente activos
que pueden interferir con la medición.
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2. Mediante Electrodos recubiertos con films de
polímeros redox con HRP (peroxidasa de rábano)
Un film de polímero redox que contiene HRP cubre superficie
de un electrodo de carbono vítreo y conecta
electroquímicamente la peroxidasa al electrodo.
El polímero redox reduce el peróxido de H generado
electroquímicamente.
(Bio)sensores optoelectrónicos
Ejemplo: electrodo para determinación de CO2.
Consisten en un pequeños reservorios de
buffer bicarbonato cubierto por una membrana
silicona permeable a los gases. El buffer
contiene HPTS (ácido hidroxipirentrisulfónico), un pigmento fluorescente
sensible al pH.
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Biosensores piezoeléctricos
La piezoelectricidad es un fenómeno que presentan
determinados cristales que al ser sometidos a
tensiones mecánicas adquieren polarización
eléctrica, apareciendo una diferencia de potencial y
cargas eléctricas en su superficie.
El CO2 difunde a través de la membrana hacia el buffer,
cambiando su pH. A medida que el pH cambia, cambia
también la fluorescencia del pigmento.
CO2 + H2O <-> H2CO3 <-> H+ + HCO3PTS- + H+ <-> HPTS
El equipo compara la fluorescencia del pigmento a dos longitudes de
onda diferentes para determinar la concentración de CO2 de la
muestra.
Muestra
Los materiales piezoeléctricos son cristales
naturales o sintéticos que no poseen centro de
simetría.
El efecto de una compresión o de un cizallamiento
hace disociar los centros de gravedad de las cargas
positivas y de las cargas negativas. Aparecen cargas
de signo opuesto en las superficies enfrentadas.
Resonancia de plasmón de superficie SPR
El plasmón es un fenómeno de densidad de
carga electrónica ondulante que sucede en la
superficie de una película metálica cuando se
refleja luz en condiciones específicas.
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La resonancia es resultado de la
transformación de energía y momento de
los fotones incidentes en plasmones de
surperficie, y es sensible al índice de
refracción del medio del lado opuesto al
film que refleja la luz.
Existen inmuno sensores ópticos
comercialmente disponibles basados en
este fenómeno.
Se mide el cambio en la posición del detector a través
de la caída de intensidad reflejada cuando varía el
índice de refracción por la presencia de analito
I: blanco. II en presencia de analito.
Algunos de los contaminantes que se han
detectado con éxito a través de la SPR
son:
- pesticidas: 2,4-diclorofenol
- alérgenos del maní y avellana
- toxinas de origen bacteriano
(Enterotoxina B) y fúngico: micotoxinas
de Fusarium y Aspergillus (zearalenona,
DON fuminisina B1 y aflatoxin B1)
- microorganismos patógenos: E.coli
0157:H7, Salmonella enteritidis, Listeria
monocytogenes, B.subtilis
- virus: mosaico del tabaco
Además, en el campo de la calidad
alimentaria se utiliza la Resonancia de
Plasmones Superficiales para la
detección, de ácido fólico, biotina y
folatos en fórmulas infantiles y leche.
Otras aplicaciones para la SPR
incluyen la detección de OMG,
y los más comunes de estos
combinan ADN con
transductores piezoeléctricos
(QCM) y ópticos (SPR).
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dextrano
analito
oro
Sensor con superficie modificada con dextrano
Métodos separativos basados en
propiedades eléctricas de los
componentes:
Las separaciones electroforéticas se llevan
a cabo en dos modalidades:
Electroforesis convencional
Electroforesis capilar
Electroforesis Convencional
La electroforesis se define como el movimiento
de partículas cargadas en un campo eléctrico.
La movilidad de las partículas es proporcional al
voltaje aplicado y la carga neta de la molécula e
inversamente proporcional a la fricción de la
molécula; esta última depende de la forma y el
tamaño de la misma.
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La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas,
ácidos nucleicos, polisacáridos) poseen
determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y
catiónicos capaz de disociarse. La carga neta de la
partícula está dada por el pH del medio y puede
modificarse.
La movilidad electroforética es la velocidad de
migración de un ión cuando se aplica un campo
eléctrico de 1 V/cm.
Su signo es igual al de la carga de la partícula.
La velocidad de migración de un ión (v) en el seno
de un campo eléctrico, es:
μ=
(carga neta)
Fricción (forma y tamaño)
v= μE
Donde E es la intensidad de campo eléctrico (V/cm)
Entonces
y μ es la movilidad electroforética
v=
qE
f
P.I.
Equilibrio ácido/base en aminoácidos
H
H
+ NH
3
C
+ NH
COOH
3
K1
R
3
C
R
COO- + H+
R
H
H
+ NH
C
NH2 C
COOK2
COO- + H+
R
26
Electroforesis Capilar:
El empleo de un capilar permite
aplicar un alto voltaje y mejorar la
separación de moléculas pequeñas
o grandes.
Ver Material Dra. Leiva
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