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DOCTORADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS Estudio de la enzima Fosfolipasa C en raíces transforma\das de Catharanthus roseus César de los Santos Briones Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C. CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCATAN, A.C. UNIDAD DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL "ESTUDIO DE LA ENZIMA FOSFOLIPASA C EN RAÍCES TRANSFORIVIADAS DE Cafharanfhus roseus" TESIS QUE PRESENTA Q.B.B. CÉSAR DE LOS SANTOS BRIONES PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGIA DE PLANTAS MERIDA, YUCATAN, MEXICO 1998 A YERENl por todo lo que hemos compartido en la vida y por lo que sigue. . A toda mi familia: a mis padres y hermanos, a la familia Minero-García, por su fe en mí y por ser todos una familia. RECONOCIIvllENTOS Este trabajo se realizó en la Unidad de Biología Experimental del Centro de lnvestigación Científica de Yucatán AC. bajo la dirección de la Dra. Teresa Hernández Sotomayor y el Dr. Víctor M. Loyola Vargas Este trabajo fue financiado por la Fogany lnternational Research Collaboration Award (R03TW00263), el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (3016-N9306), la ln{ernati.onal Foundati.on for Science (C/2236-1) y una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (88202) para César de los Santos Briones. AGRADECIMIENTOS De manera especial: A la Dra Teresa Hernández Sotomayor, al Dr Víctor M Loyola Vargas, Dra. Rosario Muñoz Clares, al Dr. José Luis Boyer, al Dr. Vi.ctor Baizabal, a la Renata Rivera y al Dr. Jorge Santamaria por sus excelentes sugerencias y la revisión crítica con la que enriquecieron el presente escrito A la Dra Rosario Muñoz Clares, al Dr. José Luis Boyer, al Dr Víctor M Loyola Vargas y a la Dra Teresa Hernández Sotomayor por formar par(e de mi comité tutorial en donde se djscutió parte importante de este trabajo. A la Dra Teresa Hernández Sotomayor por su apoyo incondicional, su interés por mi formación académica y por la paciencia otorgada durante mi. estancia en su laboratorio. AI Dr. Víctor M Loyola Vargas por la dirección y asesoría otorgada al presente trabajo AI QFB Armando Muñoz Sánchez por su total colaboración durante la realizacjón experimental de este trabajo y por todos los momentos vividos. A las autoridades del Centro de lnvestigación Científica de Yucatán A C. en especial a la Unidad de Biología Experimental por permitirme hacer uso de sus instalaciones. AI Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologi.a, a la Fogarty lnternational Research Collaboration Award y a la ln{ernational Foundation for Science por el apoyo económico brindado durante la realización de este proyecto. ABREVIATURAS Pl-PLC .-Fosfolipasa C específica para fosfatidi.linositol PLC .-Fosfolipasa C PI .-Fosfatidilinositol PI-3-P -Fosfatidilinositol 3, monofosfato P14-P ó PIP.-Fosfatidilinositol 4, monofosfato PI-3,4-P2 .- Fosfatidilinositol 3, 4, bisfosfato P14,5-P2 ó PIP2 .-Fosfatidmnositol 4, 5, bisfosfato [3H]-PIP2.-Fosfatidi.linositol 4,5, bjsfosfato tritiado. Pl-3,4,5-P3 .- Fosfatidi.li.nositol 3, 4, 5, trisfosfato l-1,4,5-P3 Ó IP3 ,-lnosítol 1, 4, 5, trisfosfato DAG.-1,2-Diacilglicerol PKC.-Proteína cinasa C GPCR - Receptor acoplado a protei.nas G EGF -Factordel crecimiénto epjdérmico . PDGF.-Factor del crecimiento derivado de las plaquetas FGF.-Factor del crecimiento de los fibroblastos PTK Protei.na tirosina cinasa lGF.-Factor del crecimiento de la insulina TIIvl.-Triosa isomerasa PH.-Homología a Pleckstrina SH2.-Homología a Src 2 SH3 -Homología a Src 3 Src.-Sarcoma de rous lo.§ .-Concentración media inhi.bitoria EgF£:E:,,,á:g:::::.d::sj:n.:t:t,rnaoaecté{,.cáoc,dotetraacét,co_N,N,N,,N,. DTT.-Ditiotreitol PMSF.-Fenil-metil-sulfonil-fluoruro BSA.- Albúmina sérica de bovino BCA.-Ácido bicinconínico TCA.- Ácido tricloroacético SDS - Dodecilsufato de sodio PAGE.- Electroforesis en gel de poliacrilamida FPLC -Cromatografía líquida rápida de proteínas RESUMEN La fosfolipasa C (PLC), que hidroliza fosfolípidos de inositol para formar diacilglicerol y fosfatos de i.nositol, se encuentra presente en células de mamíferos así como en plantas y varios microorganismos [Shukla, 1982]. Esta familia de isoenzimas se convierte en un elemento importante al i.ni.ciar un mecanismo de transducción de señales en respuesta a estímulos específicos. Actualmente, en mamíferos se conocen 10 isoenzimas de PLC y se clasifican en 3 subfamilias, P, y, y Ó; de éstas, cuatro son de tipo P, dos son de tipo y, y cuatro son de tipo Ó [Rhee y Choi,1992; Lee y Rhee,1995; Rhee y Bae,1997]. Las isoenzi.mas de tipo Ó son la forma más simple, y son las más pequeñas (Mr 85,000) en comparación con las de tipo P y y (Mr 140,000-150,000) El descubrimiento de proteinas homólogas a las isoenzimas de la familia 8, ampliamente distribui'das en plantas [Shi eí a/,1995|, levaduras [Flick y Torner,1993], y moho de fango [Drayer y Van Haastert,1992], sugiere qLie esta familia ha evolucionado en lc)s eucariontes Diferentes estudios han establecido que la PLC tiene una función específica dependiendo del sistema del que se trate Actualmente, sabemos que la PLC existe en plantas y que su actividad es detectable. Sin embargo, no existen evidencias que sugieran una función fisiológica para la PLC en células vegetales En el presente trabajo se identificó y caracterizó una aptividad de la fosfolipasa C presente en extractos solubles y extractos membranales de raíces transformadas de Caíharanínus roseus. Durante una curva de crecimiento, en su pico máximo de actMdad, la actividad específica de la PLC en los extractos membranales (65 nmol/min/mg de proteína) fue superior que la actividad específica de la PLC en los extractos solubles (5 nmol/min/mg de proteína). Estos valores corresporidieron al día 8° y 4° de la curva de crecimiento respectivamente La actividad de PLC presente en extractos membranales se activó a concentraciones micromolares de calcio con una concentración media efectiva de 50 HM e hidrolizó preferencialmente al PIP y PIP2. La PLC prese\nte en extractos solubles tambien se activó a concentraciones micromolares de calcio, aunque ésta tuvo una concentración media efectjva de 3.5 LiM, a su vez, ésta catalizó la hidrólisis del Pl y PIP Se estudió el efecto de tres diferentes detergentes. Tritón X-100, deoxicolato y octilglucósido EI Tritón X-100 inhibió la actividad de PLC en ambos extractos. En el extracto soluble, el deoxicolato tuvo un efecto estimulatorio a bajas concentraciones (0 02-0 04%, p/v) pero un efecto inhibitorio a concentraciones altas (0.15-0 2%, p/v) El octilglucósido tuvo un efecto estimulatorio sobre la actividad de la PLC en el extracto membranal a una concentración partir de 015%, Se establecjeron diferentes enzima en ambos extractos que incluyen cromatografía de afinidad, y cromatografi.a de 0 04% y en el extracto soluble a estrategias para la purificación de la cromatografía de mtercambio iónico, de exclusión por tamaño. La enzima asociada a la membrana fue solubilizada utilizando Kcl 2 M y fue purificada parcialmente por cromatografia de afinidad. Se obtuvieron 5 veces cle purificación partiendo del eluato desalado de ambas fracciones y teniendo como mezcla final algunas bandas mayoritarias del rango de 55 a 75 kDa Estas estrategias podrán servir como antecedente para trabajos futuros relacionados con la purificación de la fosfolipasa C en plantas. ABSTRACT The phospholipase C (PLC) isozymes, which cleave i.nositol phospholipids to diacylglycerol and inositol phosphates, are present in most mammalian cells as well as in plants and various mjcroorganisms [Shukla,1982]. PLC isozymes play a crucial role in initiating the signal {ransduction cascade in response to specific stimulus. To date, 10 mammalian PLC isozymes have been identified and divided into three types known as P, y, and 6 (four PLC-P, two PLC-y, and four PLC-Ó) [Rhee and Choi,1992; Lee and Rhee,1995]. The 6-type isozymes are smaller (Mr 85,000) than the PLC-O and PLC-y (Mr 140,000-150,000) isoforms. To date, Ó-type isozymes have been identified in lower eukaryotes such as yeast [Flick and Torner, 1993], slíme molds [Drayer and van Haastert, 1992], and plants [Shi ef a/.,1995], suggesting that this family has been evolved among eukaryotes. The role of PLC in several systems including invertebrates, microorganisms, and mammalians has been studied. At present, PLC activiv has been identified in plants; however, its functional role has not yet been established This study shows the identification and characterization of a phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phospholipase C (PIP2-PLC) in cytosol and membrane extracts from transformed roots of Cafharanífius roseus During a growth curve, the maximal specific activity of the enzyme in plasma membranes (65 nmol/min/mg protein) was higher than the maximal in cytosol (5nmol/min/mg protein). These values did correspond at 8" and 4" days of culture, respectively. Both activities were calcium-dependent. PLC activity from membrane extracts was activated by micromolar concentrations of calcium; with a half effective concentration of 50 HM and hydrolyzed preferentially PIP and PIP2. PLC acti.vity from cytosolic extracts also was activated by micromolar concentrations of calcium, however it had 3.5 uM as half effective concentration; it catalized the hydrolysis of Pl and PIP. The effects of three detergents on both activities were also studied. Triton X-100, deoxicholate and octylglucoside. Triton X-100 had an inhibitory effect on both PLC activiti.es. ln soluble extracts, deoxicholate had a stimulatory effect at low concentrations (0.02-0.04%, w/v) but i.nhibited at higher concentrations (0.15-0.2%, w/v) Octylglucoside had a stimulatory effect on membrane associated activity at 0.04% and on soluble activity at 0.15%. Several strategies to puri.ficate the enzyme Ín both extracts were followed. lon exchange chromatography, affínity chromatography and gel filtration chromatography were included for the purification of the enzyme. The membrane-associated activity was solubilized using 2 M KCI ; it was pamally purified by means of affinjty chromatography. We obtained 5 fold purification since the desalting step, and a final preparation with several proteins of molecular weigh(s ranging from 55 to 75 as de{ermi.ned by SDS~polyacrylamide gel electrophoresis. We hope that the purification s(rategies used in this study will be useful for future purification of plant phospholipase C CONTENIDO RECONOCIMIENTOS ABREVIATURAS RESUMEN ABSTRACT lntroducción Capítulo 1. Antecedentes 1 Si.stema fosfoinosítidos-calcio Receptores de la superficie celular 3 3 Receptores acoplados a protei.nas G 4 Receptores con actividad de tirosi.na cinasa Proteínas G La fosfolipasa C en células animales lsoenzimas Ca racteri.sticas estru ctu ra les 5 6 7 7 8 9 Domini.o X y dominio Y Dominios SH2 y SH3 Dominios PH Dominios EF-Hand y C2 Mecanismos de regulación Activación por receptores con actMdad de tirosina cinasa Activación por receptores acoplados a proteínas G Actlvación de la PLC-ó Localización de las isoenzimas de la PLC Caracterización de las isoenzimas de la PLC Función de la PLC en diferentes slstemas Fosfoinosítidos en plantas PLC en plantas Modelo de estudio. Caíharaníhus roseus (L.) G. Don. 10 10 11 11 11 12 13 14 15 15 16 18 19 23 25 Hipótesis Objetivos Generales y Particulares Capítulo 2. -Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphoiipase c activity during 25 capítuio 3. tE:r#:::To9nphpaasr:i:if ::"i:'af:gf::ipr:::"S tTnns::irc::dt:::=f¿rmadas de 43 Catharanth us rcseus Capítulo 4. DISCUSION GENERAL Capitulo 5. CONCLUSIONES Capítulo 6. PERSPECTIVAS lNTRODUCCIÓN Todos los organismos vÍvos reaccionan a señales de su medio ambiente para poder sobrevivh y adaptarse a sus condici.ones de vida En los organismos multi.celulares es necesaria la comunicación intercelular, un conti.nuo flujo de información entre las células que lo integran, tanto para coordjnar y regular el desarrollo, la organización y el metabolismo del gran número de células que conforman los diversos tejidos y Órganos, como para controlar el crecimiento y la díferenciación y responder a las señales químícas en el medio ambiente. Esta comunicación puede lograrse a través de un contacto directo célula-célula, a través de la unión de "moléculas señal" a la membrana plasmática de las células, o (en el caso de células animales) a través de la formación de uniones "gap" cuando se trata de células vecinas [Loewenstein, 1987] Sin embargo, cuando se trata de células distantes, éstas se comunican a través de la secreción de mensajeros qui'micos Los mensajeros secretados pueden ser moléculas solubles (hormonas, neurotransmisores, éstas se unen a receptores que se localizan en la superficie de las células blanco) o moléculas hidrofóbicas (tales como las hormonas esteroideales, que son capaces de traspasar la bicapa lípídica de la membrana plasmática y unirse a proteínas específicas dentro de la célula) [Evans,1988] Muchas de las señales extracelulares son transmitidas a través de la membrana plasmática por una variedad de mecanismos que usan moléculas como segundos mensajeros. Esto es, algunas moléculas extracelulares, entre las que se incluyen las hormonas, los factores del crecimiento, Ios neurotransmisores y otros agonistas, se unen a receptores específicos que se localizan en la superficie externa de la célula. La unión agonista-receptor Ínicia la producción de segundos mensajeros Estos segundos mensajeros, una vez formados, inducen reacciones intracelulares que regulan una serie de procesos, tales como el metabolismo, la secreción, el crecimiento celular, etc La comparación entre eucariontes Ínferiores y superiores de los componentes Ínvolucrados en los procesos de transducción de señales demuestra que muchos de estos mecanismos han sido conservados durante la evolución. En plantas y animales las señales extracelulares controlan el crecimiento de muchos tejidos, gobiernan la síntesis y secreción de las proteínas y regulan la composición de los fluídos del organismo Las células de éste detectan lo que está sucediendo en el ambiente extracelular, mantienen su homeostasis y los traducen en respuestas fisiológicas. Algunas señales inducen una modificación en la actividad de una o más enzimas presentes en las células Este tipo de reacción permite a la célula responder rápidamente (en cuestión de minutos o segundos) Los mecanismos de transducción en las células animales han sido ampliamente estudiados Un ejemplo clásico es la generación de AMP ci.clico por la adenilato ciclasa. Otro mecanismo es aquel que utiliza la hidrólisis de fosfolípidos de inositol por acción de la fosfolipasa C para producir dos segundos mensajeros, el inositol 1, 4, 5-trisfosfato y el díacilglicerol [Bemdge,1990, Taylor eí a/ .1990] El descubrimiento del sistema de transducción de la cascada de los fosfoinosítidos llevó consigo un gran progreso en el entendimiento de cómo las 1 señales €ran percibidas por las células y convertidas en respuestas intracelulares Este avance condujo, naturalmente, a preguntarse si algún tipo de sistemas de señales sim.ilares estaban presentes en otros eucar`iontes. Algunos estudios han sugeridolaexistenciadeunsistemasimilaraldelavíadelosfosfoinosítidosenlas células vegetales [Sandelius y Sommarin, 1990] Aunque se ha demostrado la capacidad de liberación de calcio por el IP3 de membranas de cé" vegetales [SchumakerySze,1987|,estosestudiosnohansidoconcluyentesdebidoalhecho de que existen reservas muy bajas de fosfatidil.inosftd 4, 5-bisfosfato (PIP2) y de •inositol 1, 4, 5-tr.isfosfato (lp3). Un segundo inconveniente radica en el lento progreso de la caracterización funcional de los receptores para señales químicas tales como` las fitohormonas Algunos estudios preliminares con reguladores de crecimiento han mostrado efectos sobre las actividades enzimáticas de la vía de los fosfoinosítidos y cambios en la reserva de diferentes metabolitos [Murthy et a/., 1989, Connet y Hanke,1987, Ettlinger y Lehle,1988] En este trabajo se presenta la caracterización y purificación parcial de la fosfolipasa C a parim de raices transformadas de Catharanfhus roseus. CAPITUL0 1 Antecedentes SISTEMA FOSFOINOsiTIDOS-CALCIO Los fosfoinosi'tidos son fosfolípidos que contienen un grupo inositol o inositol fosfato como grupo polar. El fosfatidilinositol es el más simple de los fosfoinosítidos. Los principales fosfoinosítidos con grupos fosfato en el anillo de inosjtol son el fosfatidjlinositol 4-monofosfato (PIP) y el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) (Fig.1). ;ít:du::na.díí:g:!i:ás,:=gfgi£,:3i:ngors::íá;:fi!g:s%s::ctí:sf:3!,ií:s:f:::;#','B:4:=:_'i:i;i33?gij:s:toí inositol 1,3,4,5-tetrakisfosfato; F = inositol 1,3,4-trisfosfato: G = inositol l ,4-bisfosfato; La hidrólisis de fosfolípidos de inositol por acción de la fostolípasa C (PLC) involucra un mecanismo de transducción de señales ubícuo que media respuestas celulares producidas por cambios en el medjo ambiente externo. En células animales, las jsoenzimas de la PLC son actjvadas por proteínas G, receptores con actividad de tirosina cinasa (Jones y Carpenter,1992), 3 o por algún otro mecanismo aún desconocido, promoviendo la hidrólisis del PIP: localizado en la parte interna de la membrana plasmática y convirtiendo a éste en una molécula soluble en agua (inositol 1, 4, 5-trisfosfato o lp3) y en un componente que por su naturaleza lipídica permanece asociado a la membrana (dtacilglicerol o DAG) Ambos compuestos per se actúan como segundos mensajeros. afectando numerosas reacciones celulares [Rhee eí a/ ,1991| La principal fiinción del lp3 es movilizar calcio de almacenes internos no mitocondriales y quizá también estimular indirectamente la entrada de calcio a la célula con la ayuda de otro metabolito fosforilado, el inositol 1, 3, 4, 5-tetrakisfosfato El lp3 se une a receptores específicos localizados en organelos internos y estimula a los canales de calcio provocando la liberación y un aumento transitorio del calcio citosólico EI DAG, por su pane, puede activar a una clase de proteínas cinasas conocidas como proteínas cinasas C (PKC). Estas proteínas cinasas son dependientes de diacilglicéridos y calcio originando fosforilaciones de un amplio rango de proteínas. RECEPTORES DE LA SUPERFICIE CELULAR Los receptores de la superficie celular son proteínas que actúan como transductores de una señal. Éstos unen un ligando con alta afinidad y convierten un evento extracelular en una o más señales intracelulares que alteran la fisiología de la célula Los receptores son clasificados en diferentes familias basadas en sus similitudes estructurales y modos de transducción receptores acoplados a canales iónicos, receptores acoplados a proteínas G, receptores con actividad enzimática intrínseca y receptores que carecen de actividad catalítica intrínseca pero que se asocian directamente con proteínas tirosina cinasas citosólicas (Fig. 2). F¿g9%ia 2. Diferentes tipos de receptores celulares. qomado de Lodish et ai„ 4 Los receptores acoplados a canales iónicos contienen actividad intri.nseca que permite el paso de iones a través de la membrana celular cuando son activados por la unión de un ligando [Schofield eí a/., 1987; Grenningloh eí a/., 1987, Langosch eía/.,1988] Los receptores acoplados a proteínas G modulan la actividad de proteínas dentro de la célula después de la unión con su ligando. Estos receptores poseen una estructura que contiene siete dominios transmembranales. lntracelularmente, el receptor se acopla a una protei.na intermediaria para regular una enzima [Strader ef a/. , 1994]. Los receptores con actividad enzimática intrínseca contienen un dominio transmembranal. Estos receptores operan directamente como enzimas a través de un dominio localizado intracelularmente con actividad de guanilato ciclasa, tirosina cinasa o tirosina fosfatasa. Los receptores para varios factores del crecimiento son proteínas cinasas que son activados por un ligando En muchos casos, la unión del ligando produce dimerización y activación de la región catalítica de cinasa [Fantl eí a/„ 1993]. Los receptores para muchas citocinas, interferones y factores del crecimiento se incluyen en una familia de receptores cuyos dominios intracelulares carecen de actividad enzimática intrínseca Sin embargo, a pesar de las diferencias estructurales existentes entre estos receptores y los que poseen actividad catalítica intrínseca, el mecanismo de activación parece ser similar. La unión del ligando induce djmerización u oligomerización y esto permite el reclutamiento y activación de proteínas tirosina cinasas citoplásmicas que se asocian con el dominio intracelular de los receptores [Kishimoto eí a/.,1994, Mui y Miyajima,1994, Heldin, 1995]. Receptores acoplados a proteínas G Las proteínas que penenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G comparten dos propiedades. Primero, la unión del ligando al receptor induce la activación de una proteína heterotrimérica que une nucleótidos de guanina (o proteína G) Estos receptores se acoplan, por medio de las proteínas G, a proteínas efectoras (tales como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C, la fosfodiesterasa dependiente de GMP cíclico, y algunos canales iónicos). Segundo, las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados que codifican para receptores acoplados a proteínas G predicen una estructura común que consiste de siete ci héljces hidrofóbicas transmembranales [Henderson eí a/., 1990]. En la estructura de estos receptores, la secuencia ami.no-terminal es extracelular, la secuencia carboxilo-terminal es citoplásmica y las a hélices están acomodadas en la membrana en sentido contrario a las manecillas de un reloj. Los receptores acoplados a proteínas G pueden ser divididos en diferentes grupos basándose en sus ligandos naturales, sus homologías de secuencia de aminoácidos y en sus similitudes estructurales. 5 En células de mamíferos, existe un grupo homogéneo de receptores acoplados a proteínas G que son activados por ligandos peptídicos pequeños Este grupo consiste de receptores para péptidos que se encuentran relacionados con el intestino y el cerebro (tales como la secretina y el péptido intestinal vasoactivo), y receptores para hormonas reguladoras de calcio (tales como la calcitonina y la hormona paratiroidea) [Segre y Goldring,1993]. Estos receptores muestran un alto grado de similitud en las regiones transmembranales hidrofóbicas, pero no son homólogos a otros receptores acoplados a proteínas G. También contienen una región amino terminal larga (130 aminoácidos) con residuos de cisteína conservados. Los receptores acoplados a proteínas G, en células mamíferas, unen diversos ligandos glicoproteínas (tales como las hormonas estimulantes de folículo y de la tiroides), moléculas orgánicas pequeñas (tales como la adrenalina y la acetHcolina), compuestos hidrofóbicos (tales como los canabinoides), y el cromóforo retinal La región extracelular amino terminal varía grandemente en longitud Los receptores comparten un número limitado de secuencias de aminoácidos conservadas, principalmente en la región transmembranal [Probst ef a/,1992] En este grupo diverso de receptores, se ha propuesto que la tercera horquilla citoplásmica entre la quinta y sexta región transmembranal, una región con menos identidad de secuencia, es la regiórt involucrada en la interacción del receptor con proteínas G específicas [Savarese y Fraser,1992]. Receptores con actividad de proteina tirosina cinasa Los receptores con actividad de tirosina cinasa contienen un dominio extracelular amino terminal de unión al ligando, un dominio transmembranal y un dominio intracelular con actividad de proteína tirosina cmasa Los receptores que pertenecen a esta familia pueden ser divididos en cuatro subclases basándose en su similitud de secuencia y características estructurales [Ullrich y Schlessinger, 1990]. el receptor para el factor del crecimiento epidérmico (EGF), el receptor para la insulina, el receptor para el factor del crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y el receptor para el factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF) Los receptores para el EGF y para la insulina compaften secuencias homólogas repetidas de cisteína en sus dominios extracelulares Los dominios extracelulares de los receptores para el PDGF tienen una estructura parecida a la de las inmunoglobulinas (cinco repeticiones) Los miembros de los receptores para el FGF contienen tres repeticiones de secuencias similares a la de las inmunoglobulinas La unión del ligando al dominio extracelular ocasiona la dimerización del receptor, ia cual activa el dominio intracelular con actividad de tirosina cinasa promoviendo la autofosforilación [Schlessinger y Ullrich,1992] EI ligando EGF (monomérico) y el ligando PDGF (dimérico) median la dimerización de sus receptores [Heldin et a,I , 1989, Greenfield et al , 1989| Cada uno de los ligandos da origen a una o mas respuestas dependiendo del sistema y ambiente celular de que se trate La activación de los receptores con actividad de proteína tirosina cinasa induce a las células a proliferar y diferenciarse en el caso de los receptores para factores del crecimiento, o a activar vías metabólicas en el caso del receptor para la insulina |Schlessinger.1993| 6 El dominio con actividad de proteína tirosina cinasa es la región más conservada Ésta contiene la secuencia consenso para unión de ATP, como se encuentra en la subunidad catalítica de !as proteínas cinasas dependientes de AMP cíclico Los dominios de cinasa de los receptores para el PDGF y para el FGF contienen una secuencia insertada de residuos de aminoácidos hidrofílicos, que dividen al dominio de cinasa por la mitad. Esta secuencia insertada probablemente no está involucrada en la actividad de cinasa, pero se cree que tiene una función en las interacciones del receptor con sus substratos [Kazlauskas y Cooper,1989]. La autofosforilación del receptor tiene una importante función en la activación de la enzima y en la interacción con sus substratos [Koch eí a/.,1991] Los receptores activados transducen las señales extracelulares no solamente por fosforilación, sino también por interacciones directas de proteína-proteína. Muchos substratos proteicos de los receptores para factores del crecimiento con actividad de tií.osina cinasas contienen dominios de homología a src (SH2), una región descubjerta orlginalmente en las tirosinas cinasas citoplásmícas relacionadas a c-Src. Los dominios SH2 se unen a residuos de tirosina autofosforilados en el receptor En los receptores para el PDGF y el EGF, los sitios de fosforilación se encuentran en las regiones no catalíticas de los dominios citoplásmicos. Entre las proteínas que pueden ser substrato para estas proteínas cinasas están la fosfolipasa C-yl y la fosfotirosina fosfatasa Syp [Anderson eí a/.,1990; Margolis eí a/.,1990a, b: Moran eí a/.,1990; Kazlauskas eí a/.,1993]. PROTEINAS G Las proteínas G son una superfamilja compleja y diversa de proteínas altamente homólogas que unen e hidrolizan GTP. Entre éstas se incluyen proteínas involucradas en la síntesis de proteínas y dos clases de proteínas que transducen señales: las proteínas G heterotriméricas de tamaño grande y proteínas monoméricas de tamaño pequeño. Las proteínas G heterotriméricas consisten de subunidades a, P y y. La activación, ocasionada por la unión de GTP, produce la disociación de la proteína G formando un complejo dimérico de subunidades f}y y una subunidad G libre unida a GTP. Las proteínas G funcionan como interruptores moleculares que alternan entre la forma activa (unida a GTP) y la forma inactjva (unida a GDP). La interconversión entre el estado activo y el inactivo ocurre por la hidíólisis de GTP y del estado inactívo al estado activo por intercambio del nucleótido (Boume eí a/.,1991 ]. LA FOSFOLIPASA C EN CÉLULAS ANIMALES La fosfolipasa C (PLC) es una familia de isoenzimas que catalizan la hidrólisis del fosfatidilinosito]4, 5-bisfosfato (PIP2) Iocalizado en la membrana celular generando dos componentes, uno hidrofóbico y otro hidrofílico, denominados 1, 2-diacilglicerol (DAG) e inositol-1, 4, 5-trisfosfato (lp3) :,eesnpeencti::,Tneaná:(:|gá3f)jnAc%Rosd::T.puá:t::afi::ío::g::mcoeiig,T:Sme:en:t:j:r:su: producen estos mensajeros secundarios son el de estimular la liberación de calcio (lp3) [Berridge,1993] y el de activar a la proteína cinasa C (DAG) [Dekker eí a/., 7 1995]. Esta vía bifurcada ejerce control sobre una gran variedad de respuestas celulares incluyendo el crecimiento celular, Ia proliferación, la contracción, la excitación y la secreción. La actividad de la PLC es ubícua en las células animales, vegetales y en los mic")rganismos [Shukla, 1982; Jones y Carpenter, 19921. ¡ni,j:e£:,g::a:i:?g3s;a#::oi:i:eár:::s::,éési::::eÁÍ®:fg::eía:jLÍ:;niig?ti,:,g::tina#1Ía*s:pdi#roTá3r lsoenzimas En células animales, la PLC existe en múltiples isoformas y se han purificado a homogeneidad varias de ellas; también se han clonado ADNcs de una gran variedad de tejidos y especies y se han identificado aproximadamente 10 isoenzimas de PLC [Rhee eí a/., 1989; Rhee y Choi,1992; Waldo eí a/.,1994; Lee y Rhee, 1995; Rhee y Bae, 1997]. Todas las enzímas de PLC identificadas hasta ahora son polipéptidos monoméricos. En base al tamaño y la comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas, las PLCs puedan ser dMdidas en tres familias: PLC-P (de aprox. 150 kDa). PLct (de aprox. 145 kDa), y PLCó (de aprox. 85 kDa). Cada familia posee varios miembros, estos se designan añadiendo números arábigos después de la letra griega, p. ej. PLC-Pl y PLC-P2 [Rhee y Choi, 1992; Lee y Rhe, 1995]. El cuadro 1 proporciona una clasificación de las fosfoli pasas C identificadas. %adLrsárg£:#gdc:€ndebsñ:feanteens¡gu¡dgFMe:g;£*3oaEjncoácakg::ftge+aá+saosr.zóg2a,: NOMBFtE TAMAÑO (kDa) OFtlGEN D-cla] 150-154 Cerebro do rsta y bovino [Katan y Parker.1987; Katan eí 8/., Familia p 81 1988) É¡2 134 P3 'ap A ADNc HL60 de humano [Krftz oÍ a/., 1990] ADNcfibroblaBtosdehumano(Kritzeí8/.,1990] 125 GencmadeDmsapAÁza(Bloomquisteía/.,1988] CkmmadeDmsopAffi[ShomdgeoÍa/..1991) CenbroderataybcMno(Suheía/..19881)) HL60, pulrnón, bazo |Emori eí a/., 1989; Banno oÍ a/., 1990; Htxrmaeía/..1990;OhtaoÍa/.,1988] Cenbro do rata y bo\Áno [Homma eí a/., 1988; Suh oÍ a/., 1988a] Cenbrodebovino[Meldrumeta/.,1989;Meldmmefa/.,1991] ADNcdefibroblstc6deliumano[KritzoÍa/.,1990| ADNcdecerebrodonata(L®yRhee, 1996) Ca racten'sticas estructu rales La estructura de las tcs familias de PLC comprende dominios comunes a todas ellas (domjnio PH de homologi.a a la plcx3kstrina, dominios EbeFE#unnd=d=o_=#o~Xx=d=ov#XT.±o*=¥.5o^T¡=±_C.2_SLy_3F*.,_oe.=xtr=~S¡=.ELg:E=,::u#S# beta(umregióncarboxmterminaldegn]nlongitud)ygamma(d®dominiosSH2, un dominio SH3 y un dominio PH adicional) (Fig. 4). F-=-!-.-::.=.-.l-.-!i-±,=_-i--__i-i---i-=F== .=, :r:g:u,??o#ñe?pEgFe:#!iécn2g;en5ñá(,£n:o,:sdHá;;mfxTát:es:taá:oaTá:ei#Tin%e::,ng!:;aasfocso::',:: Dominio X y dominio Y. La secuencia de aminoácidos de todas las isoenzimas de PLC intracelulares contiene dos regiones altamente consewadas, llamadas dominio X y dominio Y (de aproximadamente 170 y 260 aminoácidos, respectivamente) las cuales están separadas por péptidos de secuencia y longM variable. La conservación de los dominios X y Y en todas las isoenzimas de PLC desdeOmsopMhastahumanosapoyalaideadequealgunafunciónesencial,tal como la catálisis, está ascx2iada cx)n estas regiones [Rhee ef a/,1989]. De acuerdo a Essen eí a/. (1996), quienes han cristalizado una versión truncada de la PLCól derata,laregiónXesunamitaddeloqueellosllaman"barril"(triosafosfato isomerasa) distorsionado pero cerrado". La o.tra miúd del barm TIM es la región Y. Algunos estudios de mutación y de delección en las PLCJyl y PLCJy2 han mostrado que la expresión de cualquiera de las dos regiones solas producen unaproteínainactiva.CuandolasregionesXyYdecualquieradelasdosenzimas se unen, la proteína expresada retiene su actividad catalítica [Bristol e( a/., 1988; Emori eí a/,1989]. Otros estudios de proteólisis con la PLC-8 indican que los dominios X y Y permanecen físicamente asociados después de la ruptura con tripsina entre estos dos dominios [Cifuentes ef a/., 1993; EllB ef a/., 1993]. Sin embargo. estos estudios reportaron resultados diferentes sobre el efecto de la proteólisis con tripsina sobre la actividad de PLC-8. Un {ercer estudio sugiere que los dominios X y Y se asocian fisicamente de una manem que se protege esta regióndelaproteólisisyproporcionaunsitiocatalítico[Femaldefa/,,1994]. Dominios SH2 y SH3. Mientras que las isoenzimas PLC-P y PLCó contienen una secuencia coha de 50 a 70 aminoácidos que separan la región X de la región Y, las isoenzimas PLctl y PLCJy2 contienen una larga secuencia de aproximadamente 400 residuos y se distinguen por la presencia de secuencias similares a las regiones de proteínas sm [Rhee et a/., 1989]. Estas isoenzimas 10 contienen dos dominios SH2 (src homology) y un dominio SH3 localizados entre lasregionesXyY[Stahlefa/.,1988;Siiheía/.,1988b].LosdominiosSH2ySH3 son pequeños módulos de estructiiras proteicas que comprenden aprox. 100 y 50 aminoácidos, respectivamente, y gobieman interaccíones proteína-proteína. Los dominios SH2 y SH3 de la PLCT no son necesarios para la actividad enzimática, ya que la enzima netiene la actividad cuando ki negión SH2/SH3 es eliminada [Bristol ef a/., 1988; Emori eí a/., 1989]. Sin embargo, los dominios SH2 de la PLC+1 están involucrados en la asociación de la PLCJyl con sitios específicos fosforilados en tirosina presente en proteínas [Anderson et a/., 1990; Margolis ef aí.,1990a, b; Mohammadi ef a/.,1991; Rotin ef a/.,1992; Soler eí a/., 1993]. Se piensa que esta interacción es un prerrequisito para la fósforilacíón de la PLCJyl en residuos de tirosina por tirosina cinasas activadas. El dominio SH3 se cree que funciona facilitando la asociación de la PLC+1 con proteínas de citoesqueleto parlicularmente con aquellas que contienen secuencias de aminoácidos ricas en prolina [Bar-Sagi eí a/.,1993; Gout eí a/.,1993]. Dominios PH. En todas las isoenzimas PLC de mamíferos se ha encontrado una negíón de aprox. 100 aminoácidos homóloga a una región de la pleckstrína (una proteína sustrato de la proteína cinasa C en plaquetas) denominada dominio PH (por Pleckstrin homology). En los tres tipos de PLC, el dominio PH se ha encontrado en la región amino-{eminal, precediendo a los dominios EF-hand [Parker ef a/., 1994; Essen eí a/., 1996]. Las isoenzimas de tipo PLCT contienen un dominio PH adicional entre los dominios X y Y que es dividido por los dominios SH. En 1992, Rebecchi eí a/. repoilaron que la región amino-terminal, que contiene el dominio PH de la PLC-81, es necesaria para unirse con alta afinidad al PIP2 en vesículas bicapa en ausencia de calcio. También consideraron la posjbilidad de que ese sitio de alta afinidad podría servir como anclaje de la enzima en la superficie de la membrana durante la hidrólisis p"3esiva del sustra{o catalizada por un sitio activo separado [Cifuentes ef a/., 1993]. Posteriomente, Harlan ef a/., (1994) reportaron que los dominios PH se unen al PIP2 y sugieren que esta región puede ser importante para la localización de proteínas en la membrana a través de in{eracciones con el PIP2. Estas observaciones sugieren que los dominjos PH pueden tener una función biológicamente significativa en la localización de proteínas por fcBfolípidos de membrana. Dominios EF-hand y C2. La estructura tridimensional de la PLci}1 de rata, que carece del dominío PH, i.eveló que ésta consiste de 4 dominicN3 EF-hand (similares a aquellos presentes en la calmodulina) que preceden al dominio X y de un dominio C2 (éste es un dominio de P-intercalaciones que tiene una estriictura similar al primer dominio C2 de la proteína sinaptotagmina 1) cerca de su carboxilo teminal [Essen ef a/., 1996]. Se sugirió que esta última región intewiene en la unión clependiente de Ca2+ a las vesículas lipídicas. Mecanismos de regulación En células animales, se han identificado dos fomas de receptores localizados en la superficie celular que activan a la PLC los cuales funcionan a través de diferentes mecanismos moleculares. 11 Activación por receptores con actividad de tirosina cinasa. Existen receptores con actividad de tirosina cinasa que activan a la PLC, tales como el receótor para el EGF, el receptor para el PDGF, el receptor para el FGF y el recep`or para el factor del crecimiento de los ___L:^__^ hepatocitos Estos receptores cruzan _ __ ,.. A^minir` rii.nnlácimir.r) Con una sola vez ia membrana plasmática y contiénen un dominio citoplásmico con actMdad de tirosina cinasa [Nismbe eí a/,1990: Goldsschmit-Clermont eí a/., 1991]. Estos recepto" promueven la hidrólisis de los fosfoinositidos a través de £ _isoenzimas '=____1_ -_---+-r '„C;\,C)'''\J"````.1--''''____ mecanismos _ que involucran la fosforilación en t.irosina de •las de la famh PLC-y. El mecan.ismo de activación involucra la unión ligando-receptor, misma que ocasiona dimerización del receptor; a su vez, este complejo conduce a la activación de la actividad intrínseca de proteína tirosina cinasa del receptor por lo que fosforila a numerosas proteínas en residuos de tiros`ina incluyendo la región intracelular del receptor mismo así como a la PLCJyl [Eriksson eí a/.,1995] Los residuos fosforilados en tirosina del receptor forman s.itios específicos de unión para proteínas que cont.ienen regiones de aproximadamente 100 aminoácidos (dominios SH2) como es el caso de la PLCJy. Existen algunos reportes que sugieren una asociación física entre la PLclyl y la tirosina cinasa activada del receptor [Margolis ef a/.,1990a, b; Rotin eí a/ ,1992, Mohammadi ef a/.,1991|. Estos experimentos de asociación concluyeron que la actividad de tirosina cinasa del receptor para el EGF era esencial para la asociación de las dos proteínas. S'in embargo, Hernández-Sotomayor y Carpenter (1993), en experimentos realizados /.n v/.Íro obtuvieron resultados que sugieren que el receptor para el EGF purificado puede aumentar la actividad de la PLC-yl independientemente de la fosforilación en residuos de tirosina, y que ésta asociación no requiere del receptor autofosforilado, es independiente de ATP, y la PLC-yl no fosforilada en residuos de tirosina responde al receptor para el EGF. Otros ensayos /.n v/.Íno de hidrólisis de PIP2 han proporcionado evidencia directa de que la fosforilación en tirosina de la PLC-yl aumenta su actividad enzimática (Nishibe ef a/„ 1990; Wahl ef at 1992). La activación de la PLC-yl es atribuída a la fosforilación en tres residuos de tirosina (771, 783 y 1254), dos de los cuales se encuentran localizados entre los dominios X y Y [Kim eí a/., 1990b; Kim eí a/„ 1991]. La fosforilación de la PLC-yl por el receptor para el EGF aumenta la act.ividad enzimática aproximadamente de 3 a 4 veces (Nismbe ef a/., 1990; Wahl ef a/.,1992) Asimismo, se produce un gran cambio en la Ks (hay una disminución de 7.5 veces), esto significa que se aumenta la asociación de la PLC-yl con las micelas que contienen el PIP2. A bajas concentraciones de fracción mol de PIP2 (0.07) la enzima fosforilada exhibe una velocidad de reacción 4 veces más alta y una Km más baja. Sin embargo, a concentraciones altas de fracción mol de sustrato (0.33), Ia velocidad máxima (Vmax) de reacción para ambas formas de PLC-yl fueron equivalentes (Wahl eí a/.,1992;). Existe una amplia variedad de proteínas tirosina cinasas (PTKs) que no son receptores, tales como los miembros de las familias SÍc, Syk, y Jaknyk; éstas cinasas son activadas por receptores que no poseen actividad de proteína tirosina cinasa. Las PTKs activadas fosforilan algunos de los componentes a los cuales se puede unir la PLCT a través de sus dominios SH2, y, por consiguiente, 12 es fosforilada en los mismos residuos de tirosina por la PTK AsÍ, en respuesta a la unión de ciertos receptores de la superficie celular, las PTKs también fosforilan y activan a las isoenzimas de la PLC-y [Noh ef a/ ,1995, Lee y Rhee,1995] Activación por receptores acoplados a proteínas G. Los miembros de la familia de PLC-P son regulados por proteínas G heterotriméricas (subunidades G y Pv cuya contribución relativa depende de la PLC-P Ínvolucrada) [Smrcka eí a/,1991; Boyer eí a/.,1992, Lee eí a/,1992; Wu eí a/,1992a, b] Las proteínas G heterotriméricas (compuestas por subunidades c[, P, y y) transmiten señales intracelulares de una familia de receptores que se encuentran acoplados a estas proteínas G (GPCR). Esta fami`Iia de receptores incluye a receptores adrenérgicos y fotorreceptores, entre otros. Los GPCR son proteínas que cruzan siete veces la membrana, es deci.r, contienen siete hélices transmembranales con tres horquillas citoplásmicas y un carboxilo-terminal intracelular [Kobílka ef a/., 1987] La unión del li.gando causa un cambio conformacional en la estructura del receptor, el cual activa a una proteína G heterotrimérica asociada La proteína G activada se disocia formando una subunidad a y un complejo de subunidades Py Ambos, la subuni.dad a y el complejo f}y, son capaces de acti.var enzi.mas efectoras intracelulares [Sternweis, 1994], incluyéndose enlre éstas a una PLC específica para fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato La activación de isoenzimas de la familia de la PLC-P por proteínas G heterotriméricas incluye a la subfamilia GGq de las proteínas GG [Smrcka ef a/,1991] La subfamilia Gq de las subunidades a incluye cuatro productos díferentes: Gaq, Gctii, Gaw y GGi6 Se ha reportado que éstas (Gciq, Gcm Gc" y Gcti6) acti.van a la PLC-P1 [Wu eí a/.,1992a] y que Gcw6 (y quizás Gaii) son activadores eficientes de la PLC-P2 [Lee eí a/„ 1992] Ninguno de los miembros de las otras subfamilias de las proteínas Ga activan directamente a la PLC y la subfamilia Gq únicamente activa a la PLC-P y no a los miembros de las familías -Ó Ó -y de la PLC [Wu eí a/„ 1992b] La PLC-P2 recombinante es activada por dímeros Py, la PLC-Pl recombinante puede o no ser afectada por Py [Katz ef a/.,1992] o puede ser mucho menos sensible que la PLC-P2 [Boyer eí a/., 1992; Camps ef a/., 1992a]. Se requíeren bajas concentraciones, nanomolares y posiblemente picomolares, de subunidades G para estimular a la PLC [Taylor ef a/., 1991, Smrcka et a/„ 1991]; la concentración necesaria para el caso de los dímeros Py es del rango mi.cromolar [Boyer eí a/ ,1992, Camps eí a/ ,1992a,1992b] La familia de PLC-P se distingue de las otras PLCs por la presencia de una secuencia de gran longitud en la región carboxilo-terminal de la molécula después del dominio Y de la enzima En esta región, Wu eí a/ , (1993a) encontraron una secuencia requerida para la activación de PLC-Pl por Gciq Ellos subdividieron la región C-terminal en dos secuencias. la caja P, que abarca los residuos Thr9°3 y Ginl03° y que es esencial para la asociación de PLC-f)1 con la fracción paniculada y subsecuente activación por Gaq, y la caja G, que es la región localizada entre los residuos Lys"" y Leu''" y que es requerida para la interacción de PLC-Pl con Gciq Las secuencias que se encuentran después de la caja G en la PLC-Pl y en la PLC-P2 son homólogas por lo que se sugiere que ésta es la regíón de la enzima 13 requerida para la act.ivación por las subunidades Ga en ambas .isoformas. Cabe hacer notar que la caja P es una secuencia de 128 aminoácidos compuesta de un gran número de residuos cargados, especialmente residuos básicos y generalmente lisinas. La asociación con la fracción pahiculada podrñ ocurrir a través de los fosfolípidos o algunas proteínas asociadas a la membrana que se encuentran cargadas negativamente. Posteriormente Wu ef a/., (1993b) encontraron un segmento am.ino-terminal de la PLC-P2 con una secuencia de aminoác.idos que se extiende hasta el final del dominio Y y que es requerida para la activación por Gpy También encontraron otra región carboxilo-terminal con el segmento que contiene la secuencia de aminoácidos requerida para la activación por Gci. Además, sugirieron que Gc" y las subunidades Py pueden modular simultáneamente la actividad de PLC-f)2. En 1996, Kuang eí a/. identificaron la región de PLC-P2 que interactúa con Gpy La secuencia que se extiende desde el residuo Leu" hasta el residuo Val6" parece tener una muy alta afinidad por Gpy en la región que abarca desde :1 inicio del dominio X hasta el final del dominio Y La proximidad de esta secuencia con el centro catalítico sugiere que puede estar involucrada en la activación de la PLC-P2 Activación de la PLC-Ó. Actualmente el mecanismo por el cual las distintas isoenzimas de la PLC-6 se regulan no se conoce con exactitud. Sin embargo, recientemente se reportó la activación de la PLC-Ól por una nueva clase de proteínas que unen GTP, llamadas Gh [Feng eí a/.,1996] La proteína Gh está formada por una subunidad a (de aprox 75m kDa) y una subunidad P (de aprox 50 kDa) [lm y Graham,1990] La subunidad Ghci, una proteína multifuncional que también tiene actividad de transglutaminasa, activa y forma un complejo con la PLC-Ól purificada [Nakaoka eí a/.,1994: Das eí a/.,1993|, esto ocurre en células estimuladas via receptor ctradrenérgico (cii-AR) Se ha sugerido que GhG acopla directamente cii-AR a la PLC-Ó1. Aun no se sabe si otras isoenz.imas de la PLC-Ó tambiénsonactivadasporGhct,osiotrosreceptoresseacoplanaGhcLycómoestá relacionada la actividad de transglutaminasa de Gha con su func.ión activadora de la PLC-ól En base a la información estructural obtenida después de la cristalización de la PLC-81 [Essen eí a/.,1996|, se propuso un mecanismo catalítico consistente en dos pasos "atar y fiiar" El domim PH de b PLC-W ata la enzi" a la membrana debido a la unión específica al PIP2 y el dominio C2 fija al dominio catalitico con una orientacm favorable hacia la membrana El dominio EF-Hand sirve como un enlace flexible entre el dominio PH y el resto de la enzima El ion Cap sería requerido para que el dominio C2 pueda funcionar. Además, en la catálisis pafticipan directamente otro ion de Ca2+, localizado en el sitio activo, y los am.inoácidos His3u e His356 14 Localización de las isoenzimas de PLC. lnicialmente la mayori.a de las PLCs fueron purificadas de fracciones citosólicas [Ryu ef a/,1987a, b; Bennet y Crooke,1987; Rebecchi y Rosen,1987; Fukui eí a/.,1988; Homma ef a/.,1988, Meldrum e! a/.,1989, Waldo eí a/.,1994]. También se ha caracterizado actividad de PLC que se encuentra asociada a la membrana [Banno ef a/.,1988; Bano y Nozawa,1987; Lee eí a/„ 1987, Baldassare ef a/,, 1989]. La actividad asociada a la membrana puede ser solubilizada con concentraciones altas de sales, indicando que existen interacciones iónicas que retienen a la PLC asociada a la membrana. Una de las actividades asociadas a la membrana (PLC-P1) está distribuída igualmente entre el comparti.miento citosólico y el compartimiento membranal [Lee eí a/., 1987]. El análisis de la hidropatía y secuencia de aminoácidos de la PLC-Pl no revela la presencía de regiones transmembranales. En contraste, la PLC-yl se encuentra predominan{emente en citosol [Lee eí a/., 1987] El tratamiento con el EGF en células A431 (las cuales están enriquecidas con receptores para el EGF) produce la fosforilación de la PLC-yl en residuos de tirosina (771, 783, y 1254) [Margolis eí a/„ 1989, Wahl eí a/., 1990] Este tratamiento ocasiona una redistribución de PLC-yl (un proceso de translocación) por lo que aumenta la asociación de la enzima con la fracción particulada de la célula [Kim ef a/„ 1990a, Todderud eí a/ ,1990]. Por otro lado, existen evidencias de que la PLC se localiza en el núcleo de células animales [Martelli eí a/ ,1992; Kuricki ef a/ ,1992; Divecha ef a/„ 1993a, Divecha eí a/,1993b, Mazzoni eí a/„ 1992] En células Swiss3T3 se observó que la PLC-Pl se localiza en el núcleo y que ésta se regula por lGF-1 [Manelli ef a/, 1992]. Además, Asano ef a/ (1994) también han mostrado evidencias de la existencia de una nueva PLC en el núcleo. EHos purificaron una PLC nuclear de peso molecular aparente de 85 kDa de hepatoma de ascitos de rata La PLC se detectó únicamente en el núcleo de hígado en regeneración La existencia de múltiples isoformas de PLC fue descrita en estudios hechos en diferentes teiidos en{re los que se incluyen el corazón, el cerebro, las plaquetas, el hígado, y riñón [Hirasawa eí a/.,1982a, b; Chau y Tai, 1982; Low y Weglicki,1983] En resumen, las PLCs de tipo P (PLC-P1, -P2, -P3, y -P4) están presentes en la fracción particulada y en el núcleo, mientras que las PLCs de tipo y y ó son detectadas principalmente en la fracción citosólica [Lee eí a/ ,1987, Katan y Parker,1987; Ryu ef a/ ,1987b; Jhon ef a/ ,1993, Lee eí a/ ,1993; Homma et a/ , 1988; Fukui eí a/ ,1988; Rebecchi y Rosen,1987; Martelli eí a/.,1992; Divecha ef a/.,1993a, b; Mazzoni eía/,,1992]. Caracterización de las isoenzimas de PLC Las primeras isoenzimas de PLC purificadas a homogeneidad de cerebro de bovino (de 150,145, y 85 kDa) fueron, más tarde, nombradas PLC-P1, 15 PLC-yl y PLC-Ót respectivamente. Estas isoenzimas fueron caracterizadas y además se obtuvieron una serie de anticuerpos policlonales y monoclonales para las tres isoenzimas [Ryu ef a/.,1987a, Suh eí a/ ,1988b] La caracterización incluyó la evaluación de la inmunorreactiv.idad hacia cada una de las formas de PLC en su estado nat.ivo y desnaturalizado Cada anticuerpo reaccionó únicamente con la enzima contra la cual fue preparado Las tres isoenzimas fueron específicas para fosfatidilinositol [Pl], fosfatidilinositol 4-monofosfato (Pl-4-P), y fosfatidilinosM 4,5-bisfosfato (P145-P2), y no hidrolizaron fosfatidilinositol 3-monofosfato (PIT3-P), fosfatidilinositol 3,4-bisfosfato (PI-3,4-P2) o fosfatidilinositol 3,4,5-tnsfosfato (Pl-3,4,5-P3) Se estudiaron las actMdades catalíticas de las tres isoenzimas utilizando vesículas unilamelares pequeñas preparadas con Pl, P14P o P14,5-P2 como sustrato Sus actividades catalíticas fueron dependientes de la concentración de calcio Con Pl como substrato, la velocidad de hidrólisis aumentó hasta alcanzar una máxima a 6 mM de Ca2+ y posteriormente disminuyó Sin embargo, cuando la concentración de calcio estuvo en el rango micromolar, el P14J' y el P14,5|P2 fueron mejores substratos para las tres isoenzimas. Con estos dos substratos, la velocidad de h.idrólisis aumentó hasta alcanzar una máxima a 100 LtM de Ca2+, concentraciones superiores a 1 mM Ca2+ fueron inhibitorias Cuando el substrato fue PI-4-P, las tres isoenzimas tuvieron similares actividades específicas a su pH Óptimo, el cual fue 4.8 para la PLC-P1, 5 0 para la PLC-yl , y 5 5 para la PLC" Sin embargo, a pH neutro el orden de actividad específica fue PLC-Ó1 > PLC-yl > PLC-P1. En contraste, el orden de actMdad específica para la hidrólisis de P14,5-P2 fue PLC-P1 > PLC-W > PLC-yl, signif.icando que la enzima de 150 kDa es la más especifica para Pl-4,5-P2 El efecto de iones metálicos sobre la hidrólisis de P14P mostró que la PLC-Pl y la PLC-yl no son afectadas por 50 iiM de Mg2+, Mn2+, Ca2+, o Ni2+ Sin embargo, el Hg2+, Zn2+, y Cu2+, inhibieron a ambas PLCs La PLC-yl exhibe una alta sensibilidad a estos iones comparada con la PLC-P1, por ej el valor de inhibición lo5 para Hg2+ fue 0 2 LiM para PLcyl y 1 LiM para PLC-PI inhibió selectivamente a la PLC-yl con un valor lo5 de 5 HM. EI Cd2+ Para las tres isoformas, en presencia de 3 mM de Ca2+ y 1 mM de EGTA, la velocidad de hidrólisis de Pl aumentó bastante cuando la concentración de deoxicolato fue de 075" mg/ml (0.075-01 % p/v). No se observó algún efecto cuando la concentración de deoxicolato fue de 0.5 mg/ml (0 05% p/v) [Ryu eí a/ ,1987a] Morris ef a/. (1990) purificaron una PLC de 150 kD a paftir de la fracción citosólica de eritrocitos de pavo. La actividad específica de la enzima purificada fue de 6.7" 0 Limol/min/mg de proteína con PIP2 o PIP como substrato Esta actividad fue dependiente de la presencia de Ca2+, con una activación media máxima de aproximadamente 70 nM de Ca2+ con ambos substratos Esta PLC mostró un pH Óptimo ácido (pH 40) y una estimulación a concentraciones superiores de 005% (p/v) de colato de sodio como detergente. La PLC de eritrocitos de pavo no reaccionó con la mezcla de anticuerpos monoclonales preparados contra las isoenzimas purificadas por Ryu ef a/ (1987a) Función de la PLC en diferentes sistemas La función de la PLC se ha estudiado en diferentes sistemas y se ha demostrado que la actividad de la PLC se encuentra involucrada en diferentes 16 procesos. S" ef a/. (1989) reportaron que la microinyección de PLC-yl y PLC-Pl a células de fibroblasto indujo la síntesis de ADN. Sin embargo, en células de mamíferos, Ia actividad de la PLC no fue esencial para la induccíón de la síntesis de ADN [Hill ef a/., 1990] Por otro lado, debido a que la PLCLyl es un substrato dírecto genera relatívo alto en de muchos receptores para factores del crecimiento, se piensa que ésta señales para la proliferación celular Se ha observado que el contenido de PLC-yl en carcinomas mamarios primarios es considerablemente más comparación con el de tejidos de seno normal [Arteaga eí a/„ 1991], Además, una PLC de tipo -y fue purificada de melanoma humano [Perella ef a/, 1991], esto implicó que la proliferación celular en células cancerígenas pudiera estar influenciada por los niveles superiores de la PLC-y Recientemente, se reportó que la PLC-yl es requerida para la proliferación célular en embriones de ratones así como la importancía que la enzima tiene para el crecimiento y desarrollo del embrión [Ji ef a/.,1997]. En Orosoph//a, el gene norpA (No receptor potential A) codifica para una proteína con similitud a la PLC-P de retina de bovino [Ferreira eí a/,, 1993]. Cuando se hicieron mutaciones al gene norpA, no se encontró respuesta a la estimulación por la luz, no se detectó actividad de PLC y se produjo ceguera Se sugiere que esta PLC está involucrada en el proceso de fototransducción [Bloomquist eí a/,,1988, Schneuwly eí a/., 1991] También se ha sugerido que la deficiencia de PLC-P2 ocasiona disfunciones plaquetarias en humanos[Lee eí a/ , 1996]. En Xenopus existe una PLC con un 64°/o de identidad a la PLC-P3 de mamíferos [Ma eí a/., 1993] Cuando se inyectó a oocitos con oligonucleótidos antisentido de PLC se redujeron significativamente las corrientes de Cl- Sacharomyces cerev/s/ae y D/.cíyc)síe//um contienen una PLC con secuencia similar a la de la PLC-ó [Yoko-o eí a/., 1993, Drayer y Van Haastert, 1992] En levaduras, la ruptura del gene PLcl produjo defectos en el crecimiento, aunque la severidad dependió de la cepa utilizada [Yoko-o eí a/,1993] En otros estudios, tambien en levaduras, la elíminación de cíerta secuencia de la PLC dió como resultado células viables, las cuales, sin embargo, retardaron su crecimiento celular cuando se cultivaron en condiciones no óptimas [Flick y Thorner,1993, Payne y Fítzgerald-Hayes,1993] En O/cíyosíe//um, algunas observaciones previas sugirieron que la regulación de la PLC era importante para la quimiotaxis y la diferenciación [Bominaar eí a/, 1991; Bominaar y Van Haastert, 1994] Sin embargo, la eliminación de una región de secuencia del gene OdpLC dió como resultado la pérdida de actividad de PLC en las células y no se observó alguna alteración en el crecimiento y desarí.ollo [Drayer eí a/., 1994] Existen algunas bacterias que secretan a una PLC al medio de cultivo. entre éstas se pueden citar a Bac///us cereus [lkezawa y Taguchi,1981, Volwerk eí a/.,1989], Bac/.//us Íhur/ng/'ens/s [lkezawa y Taguchi,1981] Síaphy/ococcus auneus [Low,1981] y C/osír/d/um novy/ [Taguchi e lkezawa,1978] Estas PLCs reconocen la estructura del inositol fosfato presente en el Pl, pero no hidrolizan los derivativos fosforilados del Pl, Pl-4-P y P14,5-P2. Las PLCs de bacterias son monómeros de 17 aprox 35 kDa de masa molecular específicas para la hidrólisis de Pl. Se ha reportado que las Pl-PLC de bacterias muestran efectos cuando se incuban con preparaciones membranales o células sensibles a la insulina [Mato eí a/., 1987; Saltiel y Cuatrecasas,1986; Saltiel ef a/.,1986]. Marques eí a/. (1989) compararon la producción de Pl-PLC en cepas de S, aureus aisladas de pacientes con síndromes tóxicos y de pc)rtadores saludables. Ninguna de las cepas a.isladas de portadores saludables produieron Pl-PLC, 10 de las 32 cepas patogénicas si produjeron Pl-PLC Además, hubo una significativa asociación entre la producción de Pl-PLC y el desarrollo del síndrome de deficiencia respiratoria aguda o de la coagulación intravascular diseminada, como complicaciones de la infección con el estafilococo.`Esta correlación sugirió una función de la PI-PLC en la patogénesis de enfermedades particulares de S. aureus Por otro lado, en L/síer/a monocytogenes se identificó una proteína que es codificada por el gene plcA, y que es homóloga a la PLC de Bac/.//us cereus, y de 8 fhumg/.ens/.s. La expres.ión del gene plcA correlaciona con la aparición de actividad de PLC en las células. La actividad de PLC se encontró unicamente en las especies patogénicas del género L/.síer/.a. Cuando el gene sufre una ruptura, la actividad se pierde y la virulenc.ia disminuye Esto sugiere que la PLC de L monocy{ogenes puede estar involucrada en el proceso de v.irulencia [Mengaud ef a/ ,1991] En plantas, no se ha establecido alguna función fisiológica para la PLC. Legendre ef a/. (1993) han planteado la hipótesis de que la activación de la PLC puede constitw una vía por la cual un inductor activa la combustión oxidativa en células en suspensión de soya. FOSF0lNOsiTIDOS EN PLANTAS En teiidos vegetales se ha demostrado la presencia de PIP2 Crain, i993],-se h'a detectádo actividad de PLC [Coté y Crain, igg3, Huang 1995], y se ha clonado ADNc que codifican para PLCs [Hirayama ef a/.,1995; a/ ,1995, Yamamoto eí a/ ,1995, mrayama eí a/ ,1997]. Desde el primer reporte de la existencia de fosfoinosítidos en plantas [Boss y Massel, 1985] han aparecido otras publicaciones indicando que estos compuestos están presentes tanto en plantas completas como en cultivo de células o teiidos [Helsper eí a/ ,1986a, b, lwine ef a/.,1989; Coté e{ a/.,1990, Rincón y Boss,1990] Sin embargo, la distribución de estos IÍpidos es diferente de la que se encuentra en células animales. Por ejemplo, el Índice de PIP a PIP2 es 0.51 en músculo de coneio [Akhtar y Abdel-Latif,1980]. En contraste, el Índice de PIP PIP2 en células vegetales es de entre 10:1 y 201 y el contenido de PIP2 representa del 0% al 0 5% de los fosfolípidos de inositol totales [Dr®bak eí a/,1988; Heim y Wagner,1989, Boss,1989]. Se ha estimado que, en células animales, unicamente del 10% al 20% de las reservas de PIP2 se recambian en respiiesta a un estímulo Si el origen de los segundos mensajeros en plantas es PIP2, la velocidad del recambio debe ser bastante alta ya que las reservas son relativamente pequeñas. En plantas superiores existen evidencias para sugerir que una función primordial de los fosfoinosítidos puede 18 ser la de regular la estructura del citoesqueleto [Tan y Boss,1992; Dr®bak,1993; Gross y Boss,1993; Staiger ef a/., 1993, Yang eí a/., 1993]. En células vegetales se han detectado cambios en los niveles de fosfolípidos de inositol en respuesta a estímulos específicos [Drobak, 1992], aunque los mecanismos de regulación de las enzimas involucradas en el metabolismo de estos IÍpidos no se conocen. También, se ha observado que el lp3 causa liberaci.Ón de calcio de las vacuolas [Allen ef a/., 1995]. Kim ef a/. (1996), presentaron evidencias de que el lp3 estimula la liberación de calcio, el cual luego cierra los canales de K+ en las células puMnares. EIlos midieron la producción de IP3 en protoplastos de tejidos flexores y extensores (que estimularon con varias señales de luz) usando un ensayo radioreceptor en el cual el IP3 no radiactivo en la célula compite con el IP3 radiactivo por la unión al receptor específico de lp3 aislado de glándulas adrenales de bovino. PLC en plantas En los últimos años han aparecjdo reportes de actividad de PLC en varios si.stemas vegetales; estos estudios han sugeri.do la exístencia en células vegetales de un sistema si.milar al de la vía de los fosfoinosítidos descrita en células animales [Sandelius y Sommarin,1990]. En células vegetales se han identificado dos tipos de PLC específicas para fosfolípidos de inositol. enzimas solubles y enzimas asociadas a membrana [Mc Murray e lrvine,1988, Melin eí a/.,1987; Pfaffman ef a/,1987; Tate ef a/., 1989; Kamada y Muto,1992; Yotsushima eí a/.,1992; Yotsusmma eí a/,1993] La información que va a ser descrita a continuación puede ser resumida en el cuadro 2. La actividad de una PLC en plántulas de trjgo fue caracterizada por Melin ef a/ (1987) La fracci.ón de membrana plasmática estuvo enriquecida de fosfolipasa C con actividad para PIP y PIP2. Esta actividad fue mayor en brotes que en raíces. Además, la actividad específica de la enzima en la membrana plasmática de brotes culti.vados en oscuridad fue superior que aquellos cultivados en luz En contraste, Ia actividad enzimática en membrana plasmática de rai.ces no fue sensible al régimen de luz. Aunque se encontró actividad de PLC en la fracción citosóIÍca, unicamente la enzima en membrana plasmática mostró especificidad de substrato para PIP y PIP2 Esta enzíma fue dependiente de calcio, se activó a concentraciones menores de 10 LiM y se inhibió a concentraciones mayores de 10 HM A concentraciones bajas de calcio se hidrolizó preferencialmente PIP2. En contraste a las PLCs de animales, la PLC de plántulas de trigo no se activó por GTP o análogos no hidrolizables de GTP En frijol y soya, se detectó activídad de una PLC específica para Pl en membrana plasmática y en la fracción soluble. El 85-90% de la acti.vidad total se detectó en la fracción soluble, mientras que el 15% estuvo en la fraccion asociada a la membrana; ambas se activaron con 0 5 mM de calcio y a un pH Óptimo de 66 [Pfaffman ef a/.,1987]. La activi.dad de PLC, utilizando Pl como substrato, se ha observado en fracciones citosólicas de apio, coliflor, narciso [Irvine ef a/ ,1980]. En los tubos polínicos de iMm /ong/.#ort/m se observaron dos actividades de PLC en la fracción particulada y una actividad de PLC en la fracción citosólica [Helsper ef a/ ,1986a, b,1987]. La actividad de esta 19 PI-PLC aumenta durante la elongación del tubo polínico y es estimulada con 1 mM de calcio [Helsper ef a/.,1987] En apio, se ha identificado una enzima asociada a la membrana y una enzima soluble. Mientras que la enzima soluble hidroliza unicamente PIP, la enzima asociada a la membrana hidroliza también PIP2 a pH neutro y en una manera dependiente de calcio., además, la actividad aumenta también en presencia de deoxicolato (01%, p/v)[Mc Murray e lrvine, 1988| En algas verdes (DL/na//.e//a sa//na) Ia existencia de una PLC estuvo enriquecida en la fracción correspondiente a la membrana plasmática y fue estimulada por calcio y GTP [Einspahr eí a/,, 1989]. En membranas plasmáticas de raíces de avena, la actividad de fosfolipasa C, utilizando PIP2 como substrato, fue de 13 2 nmol/min/mg deproteínayalcanzaunmáximoaconcentracionesde10LiMdecalcio[Tateeía/, 1989] La purificación de una fosfolipasa C` soluble específica pa,ra fosfatidilinositol se realizó a panir de células de arroz cultivadas en suspension [Yotsushima ef a/., 1992] El peso molecular aparente de la enzima se estimó en 50 kDa, tuvo un punto isoleléctrico de 6.3, un pH óptimo de 5 2 y una alta especificidad para fosfatidilinositol Los valores de Vmax y Km fueron 5 Limol/min/mg de proteina y 0.3 mM, respectivamente La fosfolipasa C de membrana plasmática de raíces de trigofuepurificada(parcialmente)25vecesatravesdecromatografíadeadsorción ycromatografíadeintercamb.ioiónico.LaenzimacatalizólahidrólisisdePIPyPIP2 .iviuauc;. especificas t;cit.;`~`,,„`,._ , .,10 ^Hmol/min/mg _ . , ____ nin „ de con actividades de ._ 5y proteína, respectivamente. El a c= c hara PIP. 1 a enzima fue imo de la actividad fue entre 6-7 parar PIP PIP2 La enzima t pH Óptimo cie ia activioau iut= c;uiic v-, -,.,..,y _6-6_ 5 _para . _ ____ ..-- :^.^-rni^r^m^iarf>c; /1n uM\ rMelin ef a/„ 199 dependiente de calcio a concentraciones micromolares (10 LiM) [Melin ef a/.,19( Yotsushima TÜISU>UIHia eít;.a/c7.. (1993) \ i-vv/ purificaron r-.„ --_ una fosfolipasa . . . C a_ paftm _ J_ ^de r\ __-^^l/r-in/mr, membranas\, arroz, los valores de Vmax y Km para fosfatidilinositol fueron de 2 9 Limol/min/mg y mM, mM, respec(lvarllc:lllt=. respectivamente Ll El r+c;ou peso molecular „,v.~v-._. _r__ _ de enzima se rle estimó en _ _ . iiaparente ¿_1:_^ ..,- lai-i]rti`;irlz.rl 65 V kDa, el punto isoeléctrico fue 51, dependiente de calcio pH Óptimo para la actividad de 65 y fue En las raices de plántulas de avena se reportó la existencia de al menos cuatro variantes de fosfolipasa C, dos citosólicas y dos asociadas a la membrana [Huang ef a/ ,1995] Las dos PLCs c.itosólicas y las dos PLCs asociadas a la membrana pueden ser separadas en base a su afinidad por la heparina La PLC citosólica y la PLC asociada a la membrana que se unen a la h?parina presentan un peso molecular aparente de 50-70 kDa, son activadas a concentraciones micromolares de calcio y son específicas para fosfoinosítidos fosforilados 20 Cuadro 2, Evidencias de PLC en plantas PLANTA CARACTERISTICAS REFERENCIA ACTIVIDAD DETECTADA EN FFUCCION MEMBRANAL FRACCION SOLUBLE TR'GO Hidrólisis (brote y raíces) activación con Ca2+ < 10 L.M, de PIP y PIP2: "drólisis de Pl, Melín eí a/..1987 inhibición con Ca2+ > 10 HM,pHóptimode5,5-6conPIP2,y5,5-75conPIP FRIJOL y Hidrólisis SOYA actividad total), concentración actividad total). (ta'lo) Óptima de Ca2+ 0 5 mM, pH Óptima de Ca2+ 05 mM; pH Óptlmo 6.6_ Óptmo 6 6_ de Pl (15% de la Lillum Hidrólisis de Longiflorum actividad total); concentración Óptima de Ca2. 1 mM, pH (polen) APIO (tallo) Pl (35°/o de la Hidrólisis de Pl (85% de la concentración "drólisis de Pl (65% de la Óptlmo 6.5 actividad total), concentración óptima de Ca2+ 1 mM, pH Óptlmo 6 5 Hidrólisis de PIP2; activación Hidrólisis con 01% de deoxicolato,ConcentraciónÓptimadeCa2+1mM con 01% de doexicolato TR'GO Hidrólisis (p'ántu'as) activación cx)n 0025% dedeoxícolato;concentraciónÓDtimadeCa2+10uM de PIP y Hidrólisis (raíces) concentración óptima de Ca2+10L,M. PIP y PIP; actwación PIP2, AVENA de de Pfaffmann eí a/. 1987 Helsper eí a/ 1986a MCMurray e lrvine, 1988 Pical eí a/.,1992 PIP2, Tate ef a/.1989 PURIFICADA A PARTIR DE FRACCION MEMBRANAL ARROZ FRACCION SOLUBLE PM aparente de 50 kDa; pl 6 3, pH Óptimo 5 2; específica (celulas en suspensión) Yotsushima eí a/ 1992 Para Pl, Vmax 5 Limol/min/mgproteína,Km03mM311vecesdepurmcación,activi-dadespecíficadelaenzimapui.a33umol/min/mgproteí-ria,concentraciónÓptimadeca2+100uM TR'GO Específica para PIP y PIP2, (raíces) 25 veces de purtficación.actividadespeci'ficadelaenzimapura5Limol/min/mgproteína(paraPIP)y10LLmol/mln/mgprotel'na(paraPIP2).pHÓptlmo6-7(PIP)y6-65(PIF'2),concentraciónÓptimadeCa2+10HMy1mM(enpresenciadeMgc124mM) Melm eí a/ ,1992 AFtROZ P M aparerite 42 kDa, pl 51. Yotsushima eí a/ . (células en suspensión) pH Óptimo 6 5, 220 veces de 1993 purificación, especi'fica paraPl.Vmai29Limol/min/mgproteína.Km12mM, 21 activacion Por ca2. y sr2+ imwactividadespecíficadelaenzimapura1.9umol/min/mgproteína formas separadas en (raíces) base a su afinidad por heparina; P.M aparente de 42 kDa,81vecesdepurificación, base a su afinLdad por heparina, PM. aparente de 50-70kDa;561vecesdepurifica- act¡vidad ción; actividad específica delaenzimapura14.6 de en formas Dos específica separadas Dos AVENA laenzimapura806 nmol/min/mg proteína (con pip2), concentración Óptima Huang eía ' , 1995 nmol/min/mg proteína (con pip2). concentración Óptlma de Ca2+ 1 mM i de Ca2+ 1 mM` Actualmente, se ha reportado la clonación de tres genes en plantas de Arab/dops/s ma//.ana El gen A{PLC7S codifica para una PLC específica para fosfatidilinositol y es inducido baio condiciones de estrés salino y deshidratación [Hirayama ef a/,1995], éste gen codifica para una proteína de 561 aminoácidos con una masa molecular calculada de 64 kDa. Este producto incluye en su estructura los dominios EF-hand (en su región amino terminal), X, Y, y es similar a aqueHas isoformas de la familia Ó, además hidroliza PIP2 y su actividad fue dependiente de calcio La clonación y secuenciación de un gene (AfpLct) que exhibe un alto grado de similitud de secuencia por Yamamoto eí a/ (1995) aminoácidos, y contiene en su reside la actividad catalítica La jóvenes Las plantas con los genes de PLC-Ó de animales fue realizada Este gen codifica para una proteína de 533 estructura las dos regiones conservadas en donde expresión de este gene no se detectó en plántulas expresaron este gene cuando se transfirieron desde condiciones cultivadas con períodos cortos de luz (8 h de luz/16 h de oscuridad) hasta condiciones cultivadas en períodos largos de luz (16 h de luz/8 h de oscuridad) Recientemente, se reponó el tercer gene de Arabidops/.s Íha//.ana (AfpLC2) [Hirayama ef a/ ,1997]. El producto proteico de este gene exhibe bastante similitud de estructura con la de AtpLCIS Ambos son similares a las isoformas de la familia Ó Aunque AtpLC2 posee las regiones X y Y, éste no presentó en su estructura amino terminal el dominio EF-hand ni el domino PH Las plantas cultivadas en cond.iciones normales expresan constitutivamente el gen AíPLC2 en casi todos los órganos excepto en las síliques, implicando que AtpLC2 no está involucrada en el desarrollo de la semilla. Los niveles de ARNm de AtpLC2 fueron altos bajo condiciones normales de cultivo y los niveles de ARNm de plantas que habían sido expuestas a deshidratación no sufrieron cambio alguno Debido a que el gene AíPLCIS es inducible con estrés salino y de deshidratación, Hirayama eí a/. (1997) indicaron que la expresión de AtpLC7S y A{PLC2 es regulada de diferente manera bajo las mismas condiciones de estrés, y que la función de éstas Pl-PLCs en las respuestas de estrés pueden ser diferentes 22 También en plantas de soya se caracterizó un gen (PLC7) que codifica para una proteína que incluye los dominios catalíticos conservados de las PLC de típo 6. El gen PLcl codifica para una proteína de 600 aminoácidos y posee una masa molecular de 68.8 kDa Esta proteína contiene en su estructura (entre las regiones X y Y) un sitio de unión a Ca2+ de tipo EF-hand; la región amino terminal está truncada. Debido a estas características, Shi et al„ (1995) sugirieron que esta isoenzima es un miembro de una famma nueva de Pl-PLCs. La localización de esta protei'na, expresada en plantas de tabaco, indicó que se encuentra tanto en la membrana plasmática como en el citosol La identidad de esta enzima fue confirmada por estudios de complementación funcional en levaduras y por pruebas de actividad /.n v/.Íro [Shi eí a/., 1995] MODELO DE ESTUDIO: Calharanfhus noseus (L.) G. Don. C. roseus es una angiosperma dicotiledónea, perteneciente a la familia Apocynaceae, originaria de Madagascar y díspersada por cultivo a todo el mundo, es un arbusto pequeño y erguido, de 30 a 60 cm de altura, perenne y común en las regiones tropicales [Taylor y Farnsworth, 1975]. C roseus es una de las plantas medicinales más ampliamente estudiadas [Moreno eí a/ ,1995]. Estos estudios se han enfocado en el aislamiento y semi-síntesis de sus alcaloides. Se han aislado más de 200 alcaloides de diferentes panes de la planta, muchos de ellos con actividad farmacéutica importante [Cordell,1980; Mersey y Cutler,1986]. De éstos, los más imponantes son la vinblastina y la vincristina con propiedades antileucémicas, el alcaloide antihipertensivo ajmalicina, y la serpentina que produce efectos sedantes. Los bajos rendímientos de estos alcaloides en la planta, además de su alto costo comercial, ha impulsado la investigación hacia nuevos métodos alternativos para la producción de estos alcaloides tales como la sintesis o semi-síntesis [Kutney eí a/ ,1988] y el cultivo de células y tejidos [Miura y Hirata, 1986] En las últimas dos décadas, se ha obtenido una considerable cantidad de información relacionada con el crecimiento y producción de metabolitos secundanos a partir de cultivos celulares y de tejidos de C. noseus Nan der Heijden ef a/ ,1989; Ganapathi y Gargi,1990, Moreno eí a/„ 1995]. Actualmente, la Unidad de Biología Experimental del Centro de lnvestigación Científica de Yucatán cuenta con varios modelos experimentales para la obtención de alcaloides a partir de cultivos de C. roseus. Uno de éstos es la línea J1, la cual previamente ha sido caracterizada en cuanto a crecimiento y producción de alcaloides Esta línea de raíces fue obtenida mediante la infección de hojas con Agrobacfer/.um rh/zogenes [Ciau-Uitz eí a/., 1994]. Adicionalmente, las raíces transformadas ofrecen ventajas con respecto al cultivo de plantas. Entre éstas se incluyen la estabilidad genética y bioquímica, el no requerimiento de fitohormonas exógenas y la alta tasa de crecimiento. En C. noseL/s se han aislado y caracterizado varias enzimas involucradas en la biosíntesis de los alcaloides indólicos [Moreno eí a/., 1995], sin embargo aún no se conocen los mecanismos de regulación correspondientes. Por otro lado, C roseus ha comenzado a ser un modelo para estudios de fisiología vegetal. La elucidación de los mecanismos de transducción de señales que 23 pudieran estar involucrados o relacionados con la activación o expresión de enzimas de la biosíntesis de los alcaloides, permitiría la manipulación de diferentes factores que puedan conducir al incremento de la producción alcaloides en cultivos de C. roseus. 24 HIPÓTESIS Exi.sten estudios que han sugerido la exi.stencia en células vegetales de un sistema similar al de la vía de los fosfoinosítidos descrita en céw animales También se ha identificado la actvidad de PLC con características diferentes a las de animales, por lo que es posible la existencia de múltiples isoformas de PLC en plantas que pudieran ser similares a aquellas de otros sistemas Asimismo, al igual que en células ani.males, cada una de las PLCs de plantas tendría mecanismos de ac{ivación y regulación djferentes. Este trabajo sería un avance para el entendimiento de la función fisiológi.ca de esta enzima en los mecanismos de transducción de señales en plantas. OBJETIVOS GENERALES Caracterizar a la PLC durante el proceso de crecimiento en raíces transformadas de C. noseus. Purificar a la fosfolipasa C de raíces transformadas de C. roseus. OBJETIVOS PARTICULARES Medir los niveles de actividad de la PLC /.n v/Íro, utilizando [3H]-PIP2 como sustrato en raíces transformadas de C. roseus. Determinar el efecto del Ca2+ sobre la PLC de rai.ces transformadas de C. roseus. Determinar la especificidad del sustrato de la PLC de rai.ces transformadas de C roseus. Determinar el efecto de diferentes detergentes sobre la PLC de raíces transformadas de C. noseus. Desarrollar un protocolo que permita la separación y purificación de la PLC de raíces transformadas de C. roseus utilizando técnicas de cromatografía convencjonales y de FPLC. 25 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akhlar A. and Abdel-Latif acetylcholine-stimulated A. (1980) Reciuirement phosphodiesterat¢ phosphatidyl-myo-inositol 4,5-bisphosphate in for calc.ium cleavage rabbit iris smooth ions in of muscle. J Biochem ,192:783-791. AIlen G.J., Mü S.R., and Sanders D. (1995) Release of Ca2+ from individual plant vacuoles by both lnsp3 and cyclic ADP-ribose Science, 268.735-737 Anderson`D., Koch C.A., Grey L., Ellis C., Moran M.F., and Pawson T. (1990). BindingofSH2domainsofphospholipaseCyl,GAP,andSrctoactivatedgrowth factor receptors. Sciencie 250`979-982 Arteaga C.L., Johnson M.D., Todderud G., Coffrey R.J., Carpenter G., and Page D.L. (1991). Elevated contents of the tyrosine kinase substrate phospholipase C-yl .in primaw human breast carcinomas. Proc. Natl Acad. 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(1993b) Activation of phospholipase C P2 by the G and Py subunits of trimeric GTP-binding protein Proc. Natl. Acad Sci USA, 90:5297-5301. 42 CAPITULO 11 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-Phospholipase C activity during the growing phase of Cafharanfhus noseus transformed roots. César De Los Santos~Briones, J. Armando Muñoz-Sánchez, José Chín-Vera, Victor M. Loyola-Vargas and S. M. Teresa Hernández-Sotomayor. Publicado en J. Plant Physiol. Vol 150, pp. 707-713 (1997). ABBREVIATIONS lp3, PLC, phospholi.pase C; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; inositol 1,4,5,trisphosphate, PIP, phosphatidylinositol 4-monophosphate; Pl, phosphatidylinositol; C. n)seus, Cafharan!hus roseus,. EGTA, [ethyl - enebis (oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid; DAG, diacylglycerol; TCA, trichloroacetic acid; SDS, sodium dodecyl sulfate ABSTRACT A phosphati.dylinositol 4,5-bisphosphate phospholi.pase C (PLC) activjty was identified in different tissues from Caíharaníhus nDseus. The §pecific activity of the enzyme was 10 times higher in a membrane fraction than in cytosol. During a culture cycle, in two different root lines, PLC-activity in the cytosol reached a maximum that preceded the higher activity in the membranes. Both ac{ivities, soluble and membrane, are calcium-dependent for full activity. The membrane~bound activity catalyses efficiently phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) and phosphatidylinositol 4-monophosphate (PIP) hydrolysis while phosphatidylinositol (PI) is a poor substrate. The soluble activity preferentially hydrolyzes Pl over PIP and PIP2. Both activities are completely inhi.bited by Triton X-100, whereas they respond differentially to n-octyl P-D-glucopyranisde. lNTRODUCTION Phospholipase C has a key role in the signal-transduction pathway in animal cells. PLC catalyses the hydrolysis of phosphatidyli.nositol 4,5-bisphosphate, generating two potential intracellular second messengers: diacylglycerol and inositol 1,4,5 trisphosphate ln mammalian cells, approximately eight distinct PLC isoenzymes have been purified, cloned and sequenced (Rhee ef a/., 1989). Activation of PLC and stimulation of PIP2 hydrolysis in animal cells occurs through agonists that bind to either G-protein-coupled receptors or tyrosine kinase receptors (for review see Jones and Carpenter,1992; Lee and Rhee,1995). Purification and biochemical characterization of PLCs have been carried out mostly with materials of animal orjgin However, the function of the 43 enzyme /.n vÍvo remains unelucidated, ln Drosoph//a, analys.is of the norpA gene has revealed that .n encodes a putative PLC (Bloomquist e{ a/ , 1988). Mutations in this gene render the fly blind (Pak ef a/., 1970), suggesting that PLC is an essential component of the phototransduction pathway in Orosoph/./a. In Saccharomyces cerev/s/'ae, disruption of the PLcl gene results in slow growth or lethal.ity for ceHs, indicating that PLcl is impohant for ceH growh (Yoko -o eí a/. , 1993). Several repons on plant PLC have emerged in the last few years (for review see Gross and Boss, 1993) lt appears that all the enzymes hitherto investigated, faH in one of two main groups PLC type 1 is predominantly soluble, has a clear preference for Pl over PIP and PIP2, and requires millimolar concentrations of Ca2+ for fun activity (MCMurray and lrvine, 1988. Pfaffman ef a/., 1987, Yotsushima ef a/,1992); PLC type U is predominantly associated with plasma membrane, shows a marked preference for PIP and PIP2 over Pl, and is fully activated by low micromolar Ca2+ concentrations (Melin eí a/.,1987, Sandelius and Sommann,1990; Yotsushima ef a/.,1993, Melin et a/ ,1992) Recently, an Arab/.dops/s fha//.ana cDNA has been cloned that exhibits a high degree of sequence homology to animal PLC-Ó type (Yamamoto eí a/ , 1995). A soybean cDNA has also been cloned that shows strong homology to D/'cfysfel/um LJIuly>`C3IIUIIl PLC i-L`i am^ and ui`^„„„:„: mammalian ` . PLC-Ó _.=, isoform (Shi r`eí a` ,1995)ic Also, a gene •,. _L___L_i:__^^ `i`.hirh inrliirf]A bv encoding a phosphatydilinositol-specific phospholipase C, which is induced b rlehvdration in Arab/dops/s Íha//.ama _ (Hirayama __L ----- :-11\, eí a/ dehydration and and salt salt stress stresswas wasidentified iut3Hiiiic:u „ .,c]„,uut,u ,..,,... _.._ `` ,___, 1995) The possible modes of activation of plant PLC(s) are relevant, especially if exists any analogy to mammalian systems. Evidence in favor of involvement of G-proteins in plant PLC activation has been reported (Einsparh and Thompson, 1990), as has inositol phospholipid breakdown induced by light and auxm (Morse eí a`.,1987: Ettlinger and Lehle,1988). lt has also been suggested that a major role for inositol phospholipids in higher plants may be to regulate cytoskeletal structure (Gross and Boss,1993; Tan and Boss,1992, Drobak,1993, Straiger ef a/ ,1993) However, further investigations of both the b`iochemical and molecular characteristics of the plant PLC isoenzymes is required ln tms paper, data are presented suggesting that PLC activiv can be regulated during the growth of Caíharar)Íhus noseus transformed roots MATERIALS AND METHODS Cell culture. Hairy root line Jl of C roseus was obtained by infection of leaves with Agrobacíer/um rn/zogenes (Ciau-Uitz et a/ ,1994) and maintained in 85 medium (Gamborg eí aL 1968) (1.54 g/1., Sigma), supplemented wm 30 g/L sucrose, pH was adiusted to 5 7 prior to autoclaving of the medium with 01 molfl KOH/HCI One hundred milliliters of medium were placed in a 250 mL Erlenmeyer flask and autoclaved for 20 min at 15 psi. Flasks were inoculated with 0 5 g (fresh mass) of hairy roots Roots were subcultured every 14 d. Cultures were grown in darkness at 25°C on a rotary shaker at 100 rpm Normal roots of C roseqs Ínon-transformed) were obtained as described (Ciau-Uitz eí a/ ,1994) and grown in the same conditions except that the medium was supplemented with 10 nmol/L of naphtalene acetic acid Normal roots were subcultured every 28 d 44 Preparation of tissue and cell extracts. Roots were quickly frozen with liquid nitrogen and homogenized with a politron in buffer A (1g of tissue in 2 5 ml; 50 mmol/L Nacl,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L Tris.Hcl pH 74, 250 mmol/L sucrose,10°/o glycerol,1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride,10 mmol/L sodium pyrophosphate and 0.2 mmol/L orthovanadate). Extracts were passed through a gauze, and tissue debrjs was removed by centrifugation at 12,000 gn for 30 min at 4 °C The supernatant was further centrifuged at 100,000 gn for 45 min. The supernatants (protejn: 3.5-5.0 mg/mL) were recovered as the soluble fraction. The pellet was resuspended in the same buffer A (protein: 0.5-1 2 mg/mL), and was used as a crude membrane fraction. Similar protein concentrations were founded in all the tjssues studied. All steps duríng the extraction were performed at 4°C. The cell extracts were quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -75°C. Protein concentrations of samples were measured by BCA protein assay reagent using bovine serum albumin as standard. PLC as§ay. The hydrolysis of [3H]PIP2 was measured as described by Hernández-Sotomayor and Carpenter (1993) and Nishibe eí a/., (1990) in a reaction mixture (50 LtL) that contained 35 mmol/L NaH2P04 (pH 6.8), 70 mmol/L Kcl, 0.8 mmol/L EGTA, 0.8 mmol/L Cac12 (final Ca2+ concentration 25 Ltmol/L), 200 Limol/L PIP2 (~20,000 cpm), 0.08 % deoxycholate The reaction was stopped with 100 LtL of 1 % (w/v) bovine serum albumin and 250 HL of 10 % (w/v) TCA. Precípitates were removed by centrifugation (13,000 gn for 10 min) and the supernatants collected for quantification of [3H]lp3 release by liquid scintíllation counting Aquasol. ln some experiments, lp3 the product of hydrolysis of PIP2 by PLC, was separated and charactenzed on a Dowex AG IXs formate form column (1 mL) according to the methods of Berridge eí a/., (1983). Calcium dependence. A Cac12/EGTA mixture was used, and the free calcjum concentration was calculated using EQCAL (Biosoft) and Chelator (Shoenmakers) programs. Data presentation. All experiments were repeated at least three times using extracts prepared on separate occasions, and all gave similar results. Each figure contains data from a single, representative experiment assayed in duplicate, the errors varied by less than 10%. Materials. Mannheim. [3H]PIP2 PIP2 , ammonium [3H]PIP, [3H]Pl, salt was obtained from Boehringer and Aquasol were obtained from Du pont-New England Nuclear BCA protein assay reagent was supplied by Pierce Chemical Co. 85 medium, PIP and Pl were obtajned from Sigma. Dowex AG 1-Xs formate form was obtained from Bio-Rad. RESULTS Change in PIP2-PLC activity during the growth cycle of different roots lines. Cells in culture grow following a sigmoidal curve, and the metabolic requirements throughout the growth cycle differ. There js substantial evidence that enzymes are expressed differentially through this cycle The growth curve for line J1 45 transformed roots from Caíf}araníhus roseus is presented in Fig. 1. This curve sriows a lag period of about 4-5 d, the exponential phase starts during the sixth d, and then a linear phase continues over 14 d after this period, whereiipon the roots enter a stationary phase 0 4 8 12 16 20 24 28 CULTURE DAYS !|#,:c::;!:g:e;s:;s,a:n':pi:,P#L?Ct,,anoc.:,'#,,f,:.:;dno:r.Tíe,T!:a::?mt:??;:o:n,'sffiÑeR3)`oBri;'g'£i:; was expressed tn absolute values of lp3 formation. Growth curve (.) PIP2-PLC activity was detected in the Jl line The specific actMty in the total extract (at day 6 of culture) was 20 nmol/min.mg, protein. When the total extract was fractionated into soluble and membrane fractions by centrifugation, the specific actMty in the membrane fraction was found to be 65 nmol/min.mg and in the soluble fraction was 5 nmol/min.mg protein. The activity in both fractions was then measured along the growth culture cycle The time-course of PIP2-PLC activity along the growth culture peaked in the soluble fraction from day 2-4 and from day 6-8 for the membrane fraction This (day 8) is the period where the exponential growth phase starts in line J1 (Fig 1) PLC activity was measured in normal roots 46 which require naphtalene acetic acid for growth and compared with the transformed root Jl line that does not require external growth factor regulators. As shown in Fig. 1, normal roots grow more slowly than transformed roots and follow a more linear growth curve. PIP2-PLC activity was also measured in the normal root line. The absolute values of actívity differ from those observed in the Jl line (Fig.1). ln this case, the soluble activity was higher at the beginning of the cycle before going to basal levels during the remainder of the cycle. The paftern for the membrane fraction was different. There was one main peak of activity between s and 10 d. To determine whether the observation of PLC activity could be extended to other tissues and cell lines from C. roseus (ranging from normal plants to suspension cells), the capacity to hydrolyze PIP2 was evaluated ln several cultures and dlfferent tissues of C. roseus plantlets. Because it was previously noted that PLC activity changes according to culture age, we attempted to measure in the different cultures when they initiated the exponential growing phase. As shown in Fig. 2, PLC activity was detectable in all cultures, with a higher specific activity present in the membrane fraction lt is interesting to observe that the specific activity of the membrane fraction from transformed tissues (tumors) and undiferentiated tíssues (callus) was higher than that from roots, stems, or leaves, whereas, the specific activity of the soluble fraction from transformed tissue was higher or similar to specific activity of leaves, stems and roots or suspension culture cells. :¿Fúbíép(dpá-sahcetáv¡b¢a!g)d#e:een;b:ápesir:St:;Sns|:#)Pá-apí:S,anct{¥;tsyu¥saswmiasrffr:ÍdeLn, degree of differentiation. Suspension cells (from tumors obtained from A. Íumeíac/.ens transformed stems); tumor (from stems transformed with A. ÍL/meíac/ens); light callus (from roots); clark callus (from roots); leaf, stem and root from C mseus plant from 4 weeks of culture 47 Since the Jl line presented the most prominent peak in PLC activity, we decided to use this line for further characterization of this enzyme ldentification of hydrolysis products and substrate specificity. The products of inositol phospholipid hydrolysis by the membrane-bound-PLC activity were analyzed by anion-exchange chromatography. When [3H]PIP2 was the substrate, the main product eluted was lp3. The majority of phospholipase activity degrading the exogenous radiolabeled PIP2 is of a PLC nature since over 95 % of [3H]inositol phosphates released were recovered as [3H]lp3 (data not shown). The PLC activity of the membrane-bound and soluble fractions with various inositol phospholipid substrates js shown in Table 1. ln the membrane fraction, PIP2 and PIP were hydrolyzed ~ 20 times the rate of Pl hydrolysis, whereas in the soluble fraction PIP and Pl were hydrolyzed at 10 and 4 times the rate of PIP2 hydrolysis, respectively. Table 1. Substrate specificity of the Jl transformed roots. Soluble and membrane g,#:r::{':':Estaraieasyed dur¡ng the 6th Culture day in the presence of 2oo Limoi/L of the SOLUBLE | MEMBRANE (nmoi min-i mg-1 ) PIP2 0_26 54 PIP 36 54 Pl 1 3 Calcium dependence of phospholipase C. To determine the effects of varying Ca2+ concentratlons on PLC activity, a series of Ca2+-EGTA buffers at pH 6 8 were prepared, using two different computer programs, to yield the free Ca2+ concentrations shown in Fig. 3. The hydrolysis of PIP2 of both enzymes, soluble and membrane, was activated by Ca2+. lnterestingly, the EC5o for the soluble fraction is greater than for the membrane-bound enzyme. These data differ from previously published data, in which it was reported that the soluble form requires a higher Ca2+ concentration for activation than the membrane form (Melin ef a/.,1987; Sandelius and Sommarin,1990; Yotsushima eí a/„ 1993; Melin eí a/.,1992). Our data show that there was an inhibitory effect at higher Ca2+ concentrations. Tms occurrence has also been observed m other plant PLCs (MCMurray and lrvine,1988; Melin eí a/.,1987; Hirayama ef a/.,1995). 48 0123456 LOG [ Ca2+ ], nM :¡ag;3.etEí=:nte3fwc,#cbuaT+ccOo:%::{::ti¡oonnsov:n:'dp2u!,yndgrod¥S+¡_sÉGTThÁB#reor'¥,s',§niiep'jpí2 line. For cytosol (.), samples were from clay 4 and for membrane (.), samples were from day 6. Effect of detergents on soluble and membrane associated phospholipase C activity. To determine the optimal detergent for PLC activity, the effect of various detergents on both soluble and membrane-assocíated PLC activity was tested using PIP2 as a substrate. When increasing concentrations of detergents were added to the assay, three distinct responses were observed (Fíg. 4). The non-ionic detergent, Triton X-100, had a dramatlc inhibitory effect on both PLC actMties. The ionic detergent deoxycholate had djfferent effects. ln the soluble fraction, it had a stimulatory effect at low concentrations but inmbited the enzyme at higher concentrations (0.15-0.2 %). ln the membrane fraction, deoxycholate had an inhibitory effect but was less pronounced than in the soluble fraction. Non-ionjc octylglucoside had very little effect on the membrane associated activity, but did stimulate the soluble actMty. 49 A 8 0 00 05 10 15 20 25 | DETERGENT ] % E¡egt.er4g.e:tg:C¿,:hf{he:erfi:nea|üco°nncesn?:=tE|:sanadsTnedTct¡83::::e°C:adt3gdptLocsat::¡#d :n:::i;et;i!!sEr:ftiís:s:reárn::f;:s:r?ghe:nnt:ca::,:ie;ds#orv::,'y:'en,g::tgTeenpTP;af|:ehs:w3::rg;ta?t;Áací3)t3eoí :ro°±/ymJ.nDTgqu¿:pyTaen%9,rdaen:E ,a#/dv),Cs€8:u°+ dreeos;ecchttí:(€ (oT,rl¿O/C) X-100 ( Á, v/v), DISCUSSION The wealth of information accumulated on the molecular mechanisms by which animal cells perceive and transduce external signals starkly contrasts with our relative ignorance of the initial events in plant-specific signaling cascades. Research in a number of different eukaryotic systems has led to a general belief that the selectivity of cellular signals required to provide cell-specific responses do not necessarily caH for fundamentally new mechanistic elements to transduce the initial signal to their final cellular response in each case Extensive evidence, including Ca2+ mobilization studies, suggests a central importance in plants of a signal transduction pathway involving both calcium-and phosphatidylinositol-derived second messengers, which may connect light and other environmental signals to the regulation of genes. The presence and relevance of second messengers, such as lp3, and their rapid production in response to phytohormonal or light stimuli, point to a fundamental role of these compounds in plant signaling (Coté and Crain,1993) 50 Since it has been shown that PLC plays a key role in signaling mechanisms in mammalian cells, the possibility remains that this is the case in plant cells However, there are only a few repohs concerning the purification and characterization of plant inositol phospholipid specific PLCs, but the cloning of a putative Pl-PLC in higher plants has been reported (Yamamoto eí a/., 1995). To date plant PLC has not been purified to homogenei.ty, and although calcium is required for activity, there are no reports about the possible mechanisms for activation of this enzyme. ln this study, we detected 1) significant changes (3-10 fold) Ín the PLC activíty during culture growth (PLC was more prominent during the initiation of the exponential growing phase of the cultures, and was observed in two different root lines); 2) detection of two different activities in cytosol and membrane fractions (both activities have been reported in different plant cells and tíssues, but during the first 10 d of culture in the two root lines studied, there was a peak in the soluble activity that preceded the activity in membranes). lt has been reported in C roseus suspension cells that the amounts and ratio of the different inositol phosphates depended on the stage of the growth cycle, with the highest levels corresponding to the cell-division phase A role of the phosphatidylinositol cycle in the proliferation control of plant cells was then proposed The activities of the phospholipid kinases of the Pl cycle also correlate with the cell division phase of the growth cycle (Heim and Wagner,1989, Grabowski eí a/ ,1991 ). However, to date, it has not been reported how a key enzyme such as PLC changes during a growth cycle, particularly in a differentiated tissue. ln mammalian cells, it has been shown that the subcellular localization of the PLC isoenzymes is important. PLC-Pl is primarily membrane associated, whereas PLC-yl and ól are primarily soluble. Translocation of the PLC-yl from cytosol to membrane compartments has been observed in response to growth factors (Todderud eí a/ ,1990, Kim eí a/„ 1989). However, the mechanísm by which this translocation takes place is unknown. ln our model, we can not rule out the possibility that translocation from the cytosol to the membrane may occur; there could also be several isoforms at the beginning of the culture The mechanism by which the PLC activity is membrane-associated is unclear from the available results. lt could be that when soluble PLC translocates to the membrane it binds to PIP2 perhaps in a manner similar to that suggested for mammalian PLCÓ (Cifuentes eí a/„ 1993). The PH domain (pleckstrin homology), which is found in a broad array of signaling proteins including all animal PLC isozymes, has been suggested to be a sequence that associates proteins with membranes in order to function (Musacchio eí a/., 1993). Evidence for the interaction of PLCó-PH domains with PIP2 was provided ln this enzyme, the amino-terminal region containing the PH domain was necessary for binding to phospholipid vesicles containing PIP2 (Cifuentes ef a/ , 1993). These results suggest that PIP2 might be important for localizing protetns containing PH domains at the membrane surface. The soluble localization of PLC, as well as for other PLC isozymes in animal cells, presents a logistic problem since PIP2 is located in the membrane. ln C. roseus the specific activiv for PIP2 hydrolysis is about 10-fold higher in membranes than in the cytosol for most of the tissues 51 studied (Fig. 2, Table 1) ln plants, it has been reported that membrane-bound PLC preferentially hydrolyzes PIP2 and PIP over Pl (Melin ef a/„ 1987: Sandelius and Sommarin,1990; Yotsusmma ef a/.,1993, Melin eí a/ ,1992; Huang eí a/.,1995). With the discovery that so many of the components of the mammalian phosphoinositide signaling system also are present and functioning in plant cells, the obvious question is: what is the role of this system in plant cell signaling? The central feature of this system is the production of the two messenger molecules lp3 and DAG Little attention has been paid to the role of DAG, principally due to the difficulty in detecting protein kinase C activity in plants, but i( has been shown extensively that lp3 is able to release Ca2+ from intracellular stores in plant cells (Trewavas and Gilroy,1991). Little is known about the metabolism of lp3 /.n v/.vo, but several studies using soluble plant extracts and membrane preparations as enzyme sources suggest that, Í.n v/.Íro, the metabolism of lp3 (1, 4, 5) by plant enzymes differs significantly from that of other eukaryotes (Memom eí a/., 1989, Dr¢bak eí a/.,1991; lrvine eí a/„ 1992; Joseph eí a/,1989). Although we expect the IP3 release to be a very fast response, some of the kinases and phosphatases involved in its metabolism may be regulated in a different way in plants (for reviews see Dr®bak,1992; Cho ef a/ ,1993: Yang and Boss,1994; Yang eí a/.,1993). ln the search for primary events initiated by phytohormones, both short and long-term effects on plant grow^h have been studied A major difficulty ras been to distinguish those primary hormonal responses of probable importance in growfth regulation from those that are merely consequences of the primary alterations of cellular physiology. Growth responses such as cell elongation, however, require the completion of a series of metabolic steps to facilitate promotion and spatial control of cell wall synthesis, as well as cell division. This suggests long-term responses, with time intervals that may vary beween 1 h and several days. Calcium signals emanating from the plasma membrane are known to be generated by a number of mechanisms that use calcium channels that are receptor operated, voltage dependent, or regulated by second messengers. The calcium fluxes induced can be either transient or sustained. The proposed role of calcium as a common denominator may also explain why previously stimulated cells can retain an enhanced responsiveness that outlasts the initiating stimulus Persistent responsiveness may be caused by osciiiatory fluxes or repetitive spikes in éaicium concentration, creating what has been termed a cellular memory. It is a possibility that lp3 has a more relevant role than DAG as a second messenger in plant cells, and also that lp3 levels can be maintained by the continuos activation c)f PLC. Our work has identified phospholipase C activity capable of hydrolyzing polyphosphoinositides in different tissues from different degrees of differentiation and organization, at rates comparable to those of other animal and plant tissues The enzyme has dependence on micromolar concentration of Ca2+ for its activity as described for other PLCs lt efflciently catalyses PIP2 and PIP while Pl is a poor substrale, thereby displaying a different phosphoinositide substrate profile compared with PLCs from other tissues.Our results agree with those obtained by Huang eí a/,1995. who found two cytosolic and two membrane-associated enzymes The partially purified enzymes were activated by micromolar calcium and 52 were specific for phosphorylated phosphoinositides. Thus, plants, in contrast to animals, may have PLCs highly specific for phosphorylated phosphoinositides With the data presented here, we are presently unable to answer the main question about the mechanism by which external or intemal signals regulate PLC. Guanine nucleotides failed to stimulate th.s enzyme (data not shown). The possibility that G-proteins may be involved in the PLC regulation in our model remains open ln mammalian cells /.n v/.vo or /.n v/'fno, tyrosine phosphorylation increases the catalytic activity of PLC-yl , suggesting that PLC-yl catalytic activity is regulated by tyrosine phosphorylation (Nishibe eí a/„ 1990) /n v/'Íro experiments also showed that the association of EGF receptor can increase PLC-yl activity independently of tyrosine phosphorylation (Hernández-Sotomayor and Carpenter, 1993). We found that the absence of phosphatase inhibitors in the buffer extract reduced more than 50 % the activiv of the membrane-associated activity but did not modify the soluble activity (data not shown). The fact that mammalian PLC can be modulated by so many mechanisms opens the possibility that perhaps plant's PLC may be regulated by a new mechanism not described before. Purification of PLC in our model, to homogeneity, will be essential for a full understanding of the physiological rates and the regulation of the enzymes ACKNOWLEDGMENTS. The authors thank Dr. José Luis Boyer for critical advice, Dr. Graham Carpenter for generous assjstance with reagents and advice, Dr. Roger Ashburner for the revision of the English version of the manuscript, and Sue Carpenter for the administí.ative work to the FIRCA grant. Suppohed by Fogarty lnternational Research Collaboration Award (R03TW00263), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (3016-N9306), lnternational Foundation for Science (C/2236-1) and a Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologi'a Fellowship to De Los S -8. C (88202). REFERENCES Berridge M.J., Dawson R.lvl.C., Downes C.P., Heslop J.P. and lrvine R.F. (1983). Changes in the levels of inositol phosphates after agonist-dependent hydrolisjs of membrane phosphoinositides. Biochem. J., 212:473482 Bloomquist B.T., Shoilridge R.D., Schneuwly S., Perdew M„ Montell C., Stel[er H., Rubin G. and Pak W,L. (1988). lsolation of a putative phospholipase C gene of Drosoph/'/a, nopA and its role in photottransduction. Cell, 54:723-733. Ciau-Uitz R., Mii.anda-Ham lvl.L., Coello-Coello J., Chí 8., Pacheco L.M. and Loyola-Vargas V.M. (1994). lndole Alkaloid Production by Transformed and Non-transformed Root Cultures of Caíharaníhus roseus. ln Vitro Cell. Dev. 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Muchas de ellas fueron purifícadas en un principio de la fracción soluble y posteriormente de la fracción particulada [Rhee eí a/.,1989]. La actMdad de fosfolipasa C también se ha detectado en otros organismos como en bacterias [lkezawa y Taguchi,1981], levaduras r/oko-o eí a/., 1993], moho de fango [Bominaar eí a/.,1994], algas verdes unicelulares [Einspahr eí a/„ 1989], etc. En plantas se ha detectado actividad de PLC en raíces, brotes, tallos, inflorescencias y polen de varias angiospermas [lrvine eí a/., 1980; Helsper eí a/ , 1985; MCMurray and lrvine,1988; Tate eí a/„ 1989; Melin eí a/.,1992; Yotsushima ef a/.,1992,1993]. En base a sus características bioquímicas, las PLCs de plantas se han clasificado en dos grupos [Dr¢bak, 1992]. Las PLCs solubles (tipo 1) hidrolizan prefierencialmente Pl y requieren concentraciones milimolares de Ca2+; las PLCs asociadas a membrana (tipo 11) hidrolizan preferencialmente al P14-P y al PIP2 y se activan por concentraciones micromolares de Ca2+[Yotsushima ef a/., 1993]. La mayoría de estos estudíos sostienen la hipótesis de que el metabolismo de los fosfolípidos de inositol en plantas está involucrado en algún mecanismo de transducción de señales. Sin embargo, se requieren de estudios precisos y detallados para probar esta hipótesis. En lo que se refiere a la purificación y caracterización de PLCs en plantas, existen algunos repones: no obstante, ninguna se ha purificado a homogeneidad y, debido a esto es escaso el conocimiento no sólo de los mecanismos en los que se involucra a la PLC sino también de la posible función que ésta pudiera tener. MATERIALES Y METODOS Cultivo de tejidos vegetales. Como material biológico se utilizaron cultivos de raíces de Caíharaníhus roseus obtenidas por transformación mediante 58 el uso de la bacteria Agrobacíen.um rh/.zogenes. De las diferentes líneas obtenidas en el laboratorio se empleó la J1, la cual fue obtenida transformando raíces de plántula y se caracteriza por su rápido crecimiento (tiempo de duplicación igual a 30 h) [Ciau-Uitz eí a/„ 1994]. La líneas Jl se cultivó en medio de cultivo 85 (a la mitad de su fuerza iónica) suplementado con 30 g/L de sacarosa Las raíces de la línea Jl fueron subcultivadas cada 14 días en matraces Erlenmeyer de 250 mL utilizando 0.5 g de tejido como inóculo inicial. Extracto Proteico. Las raíces frescas se congelaron en nitrógeno líquido, se trituraron hasta obtener un polvo fino y se homogenizaron con un politrón en el amortiguador A (Nacl 50 mM, EGTA 1 mM, Tris-Hcl 50 mM pH 7.4, sacarosa 250 mM, glicerol 10% (v/v), PMSF 1 mM, P-mercaptoetanol 1 mM, pirofosfato de sodio 10 mM y ortovanadato de sodio 0. 2 mM) 1 g de tejido en 2.5 mL de amortiguador. El extracto se filtró a través de una gasa y los restos de tejido fueron removidos por centrifugación a 12,000 X g durante 30 minutos a 4°C. EI sobrenadante obtenido se centrifugó a 100,000 X g durante 45 minutos a 4°C. EI sobrenadante fue recuperado como la fracción citosólica y el sedimento resuspendido en el mismo amortiguador A se usÓ como la fracción membranal cruda. Las concentraciones de proteína fueron medidas por el método del ácido bicinconínico (BCA) utilizando albúmina de suero de bovino (BSA) como estándar [Smith ef a/.,1985]. Medición de [a actividad de PLC. En nuestro modelo se midjeron los niveles de actividad de la PLC /`n v/.Íro, utilizando [3H]-PIP2 como sustrato, en 2 distintos extractos celulares fracciones citosólicas y fracciones membranales crudas. La hidrólisis del [3H]-PIP2 se midió en una mezcla de reacclón (50 LiL) que contenía NaH2P04 35 mM (pH 6.8), Kcl 70 mM, EGTA 0 s mM, Cac12 0.8 mM (concentración final de Ca2+ 25 HM), PIP2 200 uM (~ 20,000 cpm), deoxicolato 0.08% (p/v). El tiempo de la reacción fue de 10 minutos y se detuvo con 100 LiL de BSA 1% (p/v) + 250 LiL de TCA 10% (p/v). El precipitado fue removido por centrifugación (12,000 X g durante 10 minutos) y el sobrenadante se colectó para la cuantificación del [3H]-lp3 formado en líquido de centeHeo Aquasol. Solubilización de la PLC membranal. Se tomaron las raíces frescas del 6° día de cultivo La extracción proteica para obtener la fracción membranal cruda se realizó de acuerdo al protocolo ya descrito, con la ligera modificación de que el sedimento obtenido de la centrifugación a 100,000 X g, se resuspendió en el amortiguador A con Kcl 2 M. El sedimento resuspendido se sonicó durante 90 segundos y se ultracentrifugó nuevamente a 100,000 X g durante 45 minutos a 4°C. El sobrenadante se recuperó como la fracción membranal solubilizada. Purificación de la PLC asociada a la membrana. Todos los procedimientos de purificación se realizaron a 4°C haciendo uso de iin equipo de FPLC® (Fast Protein Liquid Chromatography). Para la extracción de la proteína se utilizaron 100 g en peso fresco de raíces. Se obtuvo la PLC membranal solubilizada (2.3 mg de proteína/mL). 59 PROTOCOLO No. 1 prec,p,tóc.n:::::£::a:::3=:::::##;S::atEu'raed:ra:t:NT:,Tsbg:nhaás::':3':'zaa,::n:: un 40% de saturación. El precipitado se separó mediante centrifugación a 28,000 X g durante 20 minutos Al sobrenadante se le adicionó el volumen necesario de una solución saturada de (NH4)2S04 para que éste alcance un 60% de saturación. EI precipitado se separó mediante centrifugación a 28,000 x g durante 20 minutos. La pastilla se disoMó con amortiguador A y se le adicionó el volumen necesario de una solución saturada para obtener una concentración final de (NH4)2S041 7 M. obtemda en::g=ggg£=Í:aé#ní=:a:;;£:5±:£=#3,Íío, :: npareTta rác,xón38nz#t,:: Phenyl-Sepharose® CL4B (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mL de amortiguador 8 (Tris 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.6 mM, 2 Hg/mL de leupeptina) Con (NH4)2S041 7 M. La elución se hizo con un volumen de 100 mL de amortiguador 8 con un gradiente linear decreciente de 1.7 a 0 M de (NH4)2S04. Se colectaron fracciones de 0.5 mL, se midió la actividad de PLC y la absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas. PROTOCOLO No. 2 desaióutdiza::==::=:=:í=::::i:::!S:i:=i=)::eger;:ta°dem#.r25na('psh°:::':c:a; previamente equilibrada con 5 volúmenes de amortiguador 8 a un flujo de 2 mL/min. La elución se llevó a cabo con 100 mL de amortiguador 8 Las fracciones colectadas fueron de 5 mL La absorbancia se midió a 280 nm. con,en,an,aggg:g::;1¡É::3!:¡3:::::i:::::col:sm:raacp::oen:3adc:áaa'a,ia6SxqTS cm) HiLoad" Q Sepharose® HP (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mL de amohiguador 8. La elución se hizo con un volumen de 200 mL con un gradiente linear de 0 a 1 M de Nacl. Se colectaron fracciones de 3 mL Se midió la actMdad de PLC y la absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas. depLCseag:%==:=£:=:::±:#:::¡::£=Í=±=áaEt2V%,uxm6eoncc#at:Ldooadfgns:::r:dea£ 200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador 8 conteniendo Nacl 100 mM a un flujo de 2 mL/min. La elución se hizo con 320 mL de amortiguador 8 con Nacl 100 mM. Las fracciones colectadas fueron de 3 mL ap,,ffi,..aug:g:gg::tiiTg:=g::ggFdeLaHse;raar::i?neepshacr::e3cér'-d6aBd(g:a:::c:a3 equilibrada con 100 mL de amortiguador 8 con Nacl 100 mM. Se eluyó con 200 mL de amortiguador 8 con un gradiente linear de NacI 100 a 900 mM. Las fracciones colectadas fueron de 2 mL. 60 PROTOCOLO No. 3 sedesa,óut,g:hmd:tougnr:f:?,:i::tra:'Ósne:3#x®Eá%risthoarmeamcpar,a:a,:::l,:R,|,:a,g: condiciones del protocolo No.2 anteriormente descrito. Cromatografía de afinidad. Las fracciones con actividad de PLC se aplicaron a una columna (1.6 x 17 cm) de Heparin-Sepharose® CLJ3B (Pharmacia) equilibrada con 150 mL de amortiguadcm C (fosfato de potasio 20 mM pH 7.3, EDTA 1 mM, DTT lmM, PMSF 0.6 mM, 2 ug/mL de leupeptina). Se eluyó con 250 mL de amortiguador C con un gradiente linear de Kcl 0 a 1.5 M. Las fracciones colectadas fueron de 5 mL. act¡v,daddegm-ast:9ar:iiícaód::::ac::,nu:nnage±reEe'mv::UcT::i2°':C}a88%Ume)CH°,nLtoean!3 Superdex® 200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador 8 con Nacl 100 mM a un flujo de 2 mL/min. La elución se hizo con 320 mL de amortiguador C con Nacl 100 mM. Las fracciones colectadas fueron de 3mL. Purificación de la PLC citosólica. Todos los procedimientos de purificación se llevaron a cabo a 4°C haciendo uso del equipo de FPLC® (Fast Protein Liquid Chromatography). Para la extracción proteica se utilizaron 20 g en peso fresco de raíces El sobrenadante obtenido después de la centrifugación a 100,000 X g (~ 12 mg de proteína/mL) se consideró como la fracción que contiene la PLC citosólica. PROTOCOLO No. 1 Precidt¥on con íNHbsoi, El o)mcto cjtosóllco s. ptüpb de acuerdo al protocolo No. 1 descrito para la fracción membranal. Cromatografía de interacción hidrofóbica La preparación enzimática obtenida en el paso anterior se aplicó a una columna de interacción hidrofóbica en condiciones similares a las descritas en el protocolo No. 1 para la fracción membranal. PROTOCOLO No. 2 PredpjtEmon cofi íNH}>SO,. El e)rb.ac±o cttosólkD se pTedptó d. Ea misma forma como se describe en el protocolo No.1 para la fracción membranal. La pastilla obtenida en la última centrifugación se resuspendió con amortiguador A. Cromatoqrafía de filtración en gel. La preparación enzimática obtenida en el paso anterior se desaló utilizando una columna (2.6 x 18 cm) de Sephadex® G-25 (Pharmacia) siguiendo las indicacic)nes del protocolo No. 2 descrito para la fracción membranal. 61 con,en,an,ag:::gtg:g,gÉ;::!:;3:::::i::::=col:sm:raacpcr:oen:;adc:sdaa`a,:a6Sxqi: cm) HiLoad" Q Sepharose® HP (Pharmacia) de igual forma a la descrita en el protocolo No. 2 para la fracción membranal. ac,,v,dadde;ggg:?Í::i::::::;S:=:=%reE:#ucT3::2`:c;ag3:ume,cf,nLtá:t? Superdex® 200 prep grade (Pharmacia) utilizando las condiciones descritas en el protocolo No. 2 para la fracción membranal. depLCseasg:;:g::::is=g::S:a6Laxs,f;a::?ndeesHqeu:a:,:Táeenpí::r:asea.ct:v[d€ag (Pharmacia) de manera similar a la descrita en el protocolo No. 2 para la fracción membranal. Calibración de la columna HiLoad® 26/60 Superdex® 200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador 8 que contenla NacI 100 mM Se prepararon dos mezclas de marcadores de masa molecular (primera. azul de dextrán-2000 kDa, apoferritina443 kDa, P-amilasa-200 kDa, BSA-66 kDa., segunda. tiroglobulina-669 kDa, alcohol deshidrogenasa-150kDa, anhidrasa carbónica-29 kDa, aprotininaú 5 kDa) en el amortiguador de equilibrado Se aplicaron 3 mL de mezcla proteica Se hicieron dos corridas, una para cada mezcla proteica. Se colectaron fracciones de 3 mL. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) Se conservaron alícuotas correspondientes ya sea a las fracciones eluídas de cada columna o a cada paso de purificación. Las proteínas de cada alícuota se separaron en geles de poliacrilamida al 10% con SDS por electroforesis, de acuerdo al método de Laemml.i (1970), a 50 mA o 30 V. Los geles se tiñeron con una solución de nitrato de plata [Bloom eí a/„ 1987| o azul de comassie. RESULTADOS Solubilización de la PLC membranal. Se probaron concentraciones crecientes de Kcl para encontrar la concentración en que la enz.ima se disocia de la membrana. Como control se utilizó una fracción membíanal resuspendida en amortiguador sin Kcl y s.in ser sometida a la segunda centrifuga.ión. En la figura 1 se observa que la actividad de la PLC aumenta en forma proporcional a la concentración de Kcl alcanzando una concentración Óptima de 2 M: esto sugiere que la enzima se disocia de la membrana debido a la modificación de las interacciones iónicas cuando se presentan concentraciones altas de sales. 62 SOBRENADANTE PASTILLA Figura 1. Solubilización de la PLC asociada a la membrana. Precipitacion con sulfato de amonio. Como primer paso de purificación se empleó la precipitación con sulfato de amonio Para ello se llevaron a cabo experimentos de precipitación para seleccionar el rango de las concentraciones adecuadas. En estos experimentos se utilizó una solución saturada y se adicionó a alícuotas (5 ml) de extracto soluble o membranal solubilizado hasta que éstas alcanzaron un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de saturación. Los resultados indicaron lo siguiente: Con respecto a la actividad enzimática total en ambos extractos (fig. 2 y 3, panel A) se observó la disminucjón gradual de la actMdad de PLC en el sobrenadante hasta un 50% de saturacióm después de ésta concentración la actividad se pierde por completo. Con respecto a la actMdad específica de la enzima, en el caso de la PLC membranal solubilizada (fig. 2, panel 8), a un 10% de saturacjón se observó iin incremento ligero tanto en el sobrenadante como en la pastilla, posiblemente debido a un mecanismo de activación. Posteriormente, a 20%, 30%, y 40%, la actividad enzimática en la pastilla se mantiene en valores similares a los del control; pero al alcanzar un 50% de saturación se observó un incremento de 4 veces con respecto al control y este patrón se mantiene hasta el 90% de saturación. En el caso de la PLC soluble (fig 3, panel 8) la actividad específica aumenta ligeramente en el sobrenadante a un 10% de saturación y posteriormente va disminuyendo hasta perderse a un 50% de saturación; mientras que en la pastilla la actMdad específica de la enzima va incrementando proporcionalmente hasta un 40% de 63 saturación en donde alcanza un valor similar al del control. Al alcanzar un 50% de saturación la actividad específica de la enzima en la pastilla se incrementa 10 veces y a concentraciones superiores a esta la actívidad específica decrece gradualmente Finalmente, en ambos casos (extracto soluble y extracto membranal solubilizado) se decidió utilizar los rangos vistos entre un 40% y un 60% de saturación para la precipitación con sulfato de amonio, ya que a un 40% de saturación se sacrifica hasta un 50% de actividad específica en el sobrenadante comparada con la del control pero que eliminará cierta cantidad de proteínas en este rango de precipitación, y al 60% de saturación se observa un incremento en la actividad especifica de al menos 4 veces comparada con la del control. 0 io 20 30 .0 50 60 70 10 90 PUIFATO DE AHONIO| % 0 10 20 .0 .0 50 60 70 00 90 |SllLFATO OE AHONIO] % ia;giu:rsá,,:::a;:ie¡|i;d!a:::sei,;ue#;a.:::i:::TCN:óH:,,b2igÁa;f§?:d*£t:gi::t,á£::n:,::#3e:i::ii3a; 64 E# l 0 Lllll .0 20 W 40 Ñ 50 80 10 80 90 PULFAT0 DE AMONlo| % 811 ll_ J.ú o .o 2o 3o ao =Lí#Ntillnr So 6o lo so go PUIFATO DE AMONlo| % ;;#:dc:ód:ere,;`:p',?:cii!n::dé.;a!p,,L¡á#:!e:e?ipa:ac:fi¥,eqnsuo:3:e::a£rif:nie::y:,d?en,o,,igBo:oíot:# obtenida de la precipitación. Purificación de la PLC asociada a la membrana. Para la purificación de la PLC membranal se inició con la solubilización de ésta en el extracto crudo utilizando 2 M de Kcl. Para establecer la cantidad de material usado para la purificación, se tomaron en cuenta los resultados del cuadro de purificación reponado por Yotsushima eí a/. (1992) en donde parten de 22.8 g de protei'na protei.na tuvieron columnas total con una actividad total de 242 Limol/min (110 nmol/min/mg de como actividad específica); ellos iniciaron con columnas de 5 0 x 40 cm y un rendimiento final de 0.8% En nuestro caso, la disponibilidad de de 1.0 cm x 30 cm y de 1.6 x 18 cm en el laboratorio, nos limitó a iniciar la purificación partiendo de 100 gr de raices frescas y que corresponde a 122 gr de protei'na total y 83 69 nmol/min de actividad total en el extracto citosólico, o 618 mg y 33 68 nmol/min de actividad total en el extracto membranal. A pesar de las cantidades mínimas de proteína y de activldad, en todos los casos se observó actividad de PLC eluyendo después del lavado de la proteínas que no se unieron a la matriz, sugiriendo un sobrecargado de la columna 65 PROTOCOLO No. 1. Se realizó una extracción completa partiendo de 20 gr de raíces frescas Este protocolo incluyó una columna de fenil-sefarosa, aprovechando la concentración de sulfato de amonio como requisito de unión a la matriz. Se cargó a la columna un volumen de 6 mL proveniente de la precipitación al 40%-60% con sulfato de amonio que contiene 1.53 mg de proteína y 128 9 nmol/min de actividad total. El perfil de unión y elución de la columna de fenil-sefarosa del extracto membranal se presenta en la figura 4. Se observó que existe unión y elución de algunas proteínas en la columna de fenil-sefarosa. Sin embargo, al medm la actividad de PLC, ésta no se detectó durante el lavado de la columna, ni durante la elución de la proteína pegada a la columna. Este comportamiento podría deberse a que la PLC sÍ se une a la fenil-sefarosa aunque posteriorme`nte es difi'cil eluirla ya que se aplicó extracto con actividad y ésta no se detectó en ningún lugar de la elución. 100 150 200 250 VOLUMEN (mL) :#:r:o4enpuenfflá,cdo¡u#::,¡Txdsbec#,agteopT:nmyp.rs:3L£rr:sc¿%,tca£_o45oTo%oL6Looíoedaems:,,fga::ddoer de elución 0.5 mL/fracción Nuevamente, se reintentó purificar a la enzima siguiendo este protocolo Se obtuvo la fracción membranal solubmzada, ésta se precipitó con sulfato de amonio en el rango de precipitación ya descrito; en esta ocasión, no se logró disolver la pastilla con el amortiguador A Se intentó la disolución adicionando Kcl 0 S M, también se intentó con sonicación Los resultados fueron negativos por lo que se eliminaron estos dos pasos de purificación (precipitación con sulfato de amonio y la cromatografía de interacción hidrofóbica) del protocolo de purificación para la PLC membranal y se planteó otra estrategia Se pensó que estos resultados fueron negativos debido a la agregación de la masa proteica en presencia de altas concentraciones de sales tanto de sulfato de amonio como de Kcl. PROTOCOLO No. 2 Se obtuvo un extracto y la PLC asociada a la membrana se disoció de la misma sometiéndola a concentraciones altas de cloruro de potasio El extracto membranal soluble (9 5 mL) se aplicó a una columna de 66 G25 para desalar (figura 5) La actividad de PLC se detectó al inicio del volumen vacío de la columna (27-30 mL) y se observó en los dos picos de absorbancia, EI primer pico de absorbancia no contiene sales a diferencia del segundo pico en donde se detecta conductividad debido a la presencia de sales. Estas últimas fracciones no se tomaron ya que no estaban completamente desaladas La muestra desalada (45 mL) se aplicó a una columna de intercambio iónico El perfil de elución (figura 6) muestra un pico de actividad dentro del gradiente de elución Las fracciones que tuvieron actividad de PLC (54 mL) se mezclaron y concentraron por ultrafiltración con membranas DiafloYM30 (Amicon). El volumen concentrado (6 mL) se aplicó a una columna de exclusión por tamaño Esta columna se incluyó para eliminar proteínas de alto y bajo molecular esperando separar las proteínas presentes dentro de un rango de 50-150 kDa de masa molecular. . ---. , ..'' , 0030 - 0025 0020 0015 0010 .'/ 0005 / 0000 -0 005 20 40 60 80 100 VOLUMEN (mL) :Lg,uáae5seB;fEed£ál2:i,ópnhgret?cT:?d|o6om#%rea:#osh::uubá'ázoarddoeee,u:,nóan,Cg':mu,raaé3i.gnxl8 67 0 50 100 150 200 250 300 350 VOLUMEN (mL) ;:g:r:p6a.c:gg'Hd,:oeáá9LónQds'e#::oe®miTgRrapná|grems:Lacdeoe2no5n:LCoáuem::á`h.¡Suxaásrc:? elución. 3 mL/fracción. El perfil de elución de la columna de superdex 200 (figura 7) muestra un volumen vacío de aproximadamente 100 mL y un pico con actividad de PLC. Este pico corresponde a una masa molecular de 90 kDa de acuerdo a la curva de calibración (figura 8) obtenida con proteínas de masa molecular conocida. 100 150 200 250 300 VOLUMEN (mL) 5,ugpué:d3pp2orid:ree;,::;o;ned3e2,6:[cdemveoTub:aenna!:ne,::FÓ::!u:nuaír`a2c:,orngocm)deH,Load® 68 10 15 20 25 V.„o :#a.g.(gu6Wxa6doeccma;'bHr,aLC:g3®ogLepn:Fdaes;on2oP6o::énpasrg3em328::'á?utao|uc:::cideaeiTcrónn: 3 mL/fracción. •./ / _ -.`:``.``ii€:.l=`=',..,-..-ri` 0 50 100 150 200 250 300 350 400 VOLUMEN (mL) i'8#:ingseppehT'io8:® e2#mnL dd% JaoiupmL:n Tee:::?orna.' 2e#L7fT:ccC.%':mna (16 X 17 cm) de 69 El pico (un volumen de 2.9 mL) obtenido de la columna de exclusión por tamaño se aplicó a una columna de afinidad columna (figura 9) no se detectó actividad de PLC En el perfil de elución de esta El cuadro de purificación de la PLC asociada a membrana (cuadro 1) indica un incremento en la actividad total cuando el extracto eluye de la columna de Sephadex G-25, este fenómeno, que también ocurrió cuando se realizó la precipitación con sulfato de amonio, se repite en este paso de purificación y por consiguiente aparentemente aumentan las veces de purificación si se compara con la actividad específica del extracto inicial Este resultado sugiere la existencia de algún factor inhibitorio que se elimina ya sea durante la precipitación con sulfato de amonio o bien, durante la elución a través de una columna de filtración en gel. Por lo tanto, después del desalado existen 10 veces más de actividad total El último paso de purificación alcanzado fue el de la cromatografía por exclusión de tamaño por superdex 200 HP El gel de poliacrilamida al 10% (figura 10) revela en el carril del pico de Superdex 200 HP la intensificación de 4 bandas de 73 kDa, 65 kDa, 59 kDa, y 55 kDa respectivamente Aunque hasta este paso existe cieno grado de purificación, se requiere optimizar la purificación En el carril correspondiente a la proteína no unida a heparina se observan también las mismas bandas siendo las de 65 y 59 kDa las que se observan menos Cuadro 1 Cuadro de Purificación de la PLC membranal del 7° dia de una curva de crecimiento PASO DE PURIFICACION PROTEINA ACTIVIDAD TOTAL TOTAL ACTIVIDAD VECES DE ESPECIFICA PURIFICACION RENDIMIENTO (%) (mg) (pkat) (pkat/mg prot.) Extractomembranal 279 2439 8744 1 100 Extractomembranalso'uble 26.02 2 200 7 84_57 096 90.2 930 87 106 8927 Desalado porG25 234 Seíarosa-Q 168 4 069 5 2 422 32 277 1667 Superdex 200HP 0.168 6339 3 773 1 431 259 No unida aSefarosa-heparina 0085 22.95 270 308 0.94 Sefarosa-heparina 0 0 0 0 0 21781 5 70 lvIW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 FOSFORILASA 8 107 kDa BSA 76 kDa OVALBUMINA 52 kDa ANHIDRASA CARBONICA 36.8 kDa lNH. TRIP. SoyA 27.2 kDa LISOZYIVIA 19 kDa :;g:;:::,:í:°;°a3:d;e;i:8:i#;&CÍ_Í#Í,:¡egs;;dci?TTe::¥b:.a::nLi:,;iíír!e!1:£?Sefti:a;;t#s::a¡:'!;2::°Áir;ÍÍ:g: 8é3:Pi::éoespeh®ár:;:#a,t8,deiu,aatocá,:Tancaofuemsn:pde:d#a2r,no-sHeppigí:gé®9,proteínanou"aa PROTOCOLO No. 3. En este caso se realizó una extracción a partir de 20 g de raíces del 7° día de cultivo; se inició con esta cantidad de material vegetal para observar los perfiles de elución en cada uno de los pasos a seguir en la purificación, a pesar de la cantidad de proteína se observó actividad de PLC en las proteínas que no se unieron a la matriz de la columna, nuevamente sugiriendo un sobrecargado de la columna Se obtuvo el extracto membranal solubilizado (5 mL) y se aplicó a una columna de G-25 para desalar. La muestra desalada (27.5 mL) se aplicó a una columna de afinidad, seguida de un volumen de 200 mL de amortiguador C para eluir a la protei'na que no se unió a la matriz de heparina Posteriormente se eluyó la proteína que sÍ se unió, con 250 ml de amortiguador C utilizando un gradiente linear de Kcl de 0 a 1 5 M (estas condiciones fueron tomadas del manual que acompaña a la Heparin-Sepharose® CL-6B comercial y se modificaron del protocolo No. 2 para investigar alguna optimización de la elución) El perfil de elución (figura 11) muestra un pÍco de actividad dentro del gradiente de elución, aproximadamente a 0.6 M de Kcl. 71 E,g#:,n:áeppheaí:sg8£5uoc#ddeevL;u:Le:dmeeeTubcr,%nn:,5emnuífaacc:gLumnatt6xí7cm,de El poliacrilamida-SDS pem de elución al 10% (figura también 12), en se cada observó carrh se en un aplicó gel la de proteina previamente precipitada correspondiente a 0.5 mL de la fracción colectada durante la elución de la columna de heparina A parü del carril correspondiente a los 310 mL de la elución, se observó un aumento en la intensidad de tinción de una banda de 56 kDa, ésta permanece hasta los 360 mL de la elución También se observó la separación de las proteinas de aMo peso molecular (al principio de la elución) con respecto de las proteinas de bajo peso molecular (al final de la elución). PICO DE ACTIVIDAD DE PLC r, ml ELuiDO FRACCION 107 kDa 76 kDa 52 kDa 3e kDa 27 kDa '9 koa :±guYrdaeTc2o:::':sd,::i':,Cd:nd::a':oPuL:nT:gLreaFaaj]nv:St:p::r:sDe%-PAGEall0°/oteñiticon 72 Las fracciones que se obtuvieron de la elución de la columna de heparina se mezclaron de acuerdo al cuadro 2. En este cuadro se aprecia la cantidad de proteína aplicada y la cantidad de proteína eluída Cuadro 2 Mezclas obtenidas de la elución de la columna de heparina Fracción Memb.solubilizada de mL 30 a 60 corresponde a: vol. total (mL) Cantidad deprot.(mg) extracto aplicado 4.1 4.2 prot. no unida 35 0.34 de mL 250 a 285 11 40 0.8 de mL 290 a 330 111 45 1.22 20 0.48 45 0.49 de mL 335 a 350 pico de act. PLC de 355 mL a 395 V Después de haber probado una columna de afinidad como primer paso de purificación se planteó la estrategia de utilizar como segundo paso la misma columna de afinídad Para esto, se realizó otro extracto bajo las mismas condiciones que el anterior y se aplicó a una primera columna de afinidad sin alterar ninguna condición El patrón de elución (figura 13) resultó ser bastante similar al de la figura 11 ` 0010 0005 0 100 200 300 400 500 0000 600 VOLUMEN (mL) Figura 13 Perfil de elución de la PLC membranal en una la columna (16 x 17 cm) de Heparin-Sepharose® 250 mL de volumen de elución, 5 mL/fracción. 73 Las fracciones en las que se detectó actividad de PLC (del mL 305 al 350) se combinaron y se concentraron por ultrafiltración con membranas DiafloYM30 (Amicon). El volumen concentrado (7 mL) se desaló por filtración en gel. El volumen final obtenido del desalado (19 5 mL) se aplicó a una segunda columna de afinidad bajo las mismas condiciones que la anterior, salvo el gradiente de elución que fue creciente de Kcl de 0 a 1 M. El perfil de elución del segundo paso de purificación se aprecia en la figura 14. En este caso ya no detectamos actividad de PLC en ningun punto de la elución. Sin embargo, el perfil de elución fue similar al de la figura 13, aunque se esperaba en su totalidad la unión de la proteína cargada, esto no sucedió ya que durante el lavado eluyó proteína que no se unió (aunque en menor proporción) a la matriz. También se observó el primer pico que elüyó en el primer paso de purificación y que supuestamente ya se había separado del pico que contenía la actividad de la PLC. 0 100 200 300 400 500 Volumen (mL) E'8#:inlseppheaí;s83. 25UoC# ddeevL£u:Le: dmeeeTubcr¡%nn:'5emnL/?rnaacc::irna (1 6 X 17 cm) de Aunque no se detectó actividad de PLC, se realizó una corrida de la proteína eluída (de este segundo paso de purificación) en un gel de poliacrilamida-SDS al 7 5 % (figura 15) para observar la separación de bandas durante la elución. En esta ocasión se observaron las bandas proteicas que corresponderían al pico de acttvidad siendo éstas las que se observan en los carriles de las fracciones 52 a 56. La siguiente estrategia consistió en eliminar la segunda columna de afinidad e incluir, en lugar de ésta, una columna de exclusión por tamaño basándose en la la separación de 4 bandas proteicas presentes en los carriles 52 a 56 de la figura 15 AsÍ, nuevamente se repitió todo el proceso de extracción, 74 disociación de la membrana, desalado, elución por la columna de afinidad obteniendo resultados idénticos a los ya señalados. Finalmente las fracciones que contenían actívidad de PLC se aplicaron a la columna de exclusión por tamaño. Figura 15. Perfil de elución de la PLC membranal visto en SDS-PAGE al 7.5% teñido con nitrato de plata eluída de la segunda columna de Heparin-Sepharose®. La figura 16 muestra la elución de proteínas en base a su peso molecular en esta última columna Este perfil indicó la presencia de proteinas de diferente peso molecular la aparición del pico de actividad de la PLC debería apreciarse aproximadamente en el mL 190-205 de acuerdo a la figura 7, en donde sÍ se aprecia el pico de actMdad; sin embargo, no detectamos actividad de PLC en ninguna de las fracciones eluídas. Esta fue la última estrategia realizada. 75 0_0018 0.0016 .', 0.0006 "-`J,...`+:`.".„`. 0,0004 0 0002 0_0000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Volumen (mL) 5,ugpu::d:6£Esí,p?:pe;::Lóen82óampLL:eT:,T:r::ad,ee:"ucn,:n:oáu#Lirá:c:Óxn6ocm,deH,Load® Purificación de la PLC citosólica. PROTOCOLO No 1 precipitación con una columna de fenil-sefarosa del igual forma que Se obtuvo un extracto citosólico y se sometió a sulfato de amonio (40-60% de saturación) Este protocolo incluyó fenil-sefarosa El perfil de unión y elución de la columna de extracto citosólico se muestra en la figura 17 Se observó que, de el extracto membranal, sÍ existe unión y elución de algunas proteínas en la columna ésta no se detectó ni en en las fracciones eluídas la elución se propuso de fenil-sefarosa, aunque, al medir la actMdad de PLC, las fracciones correspondientes a la proteína no unida, m Debido a que se obtuvieron resultados negativos durante el protocolo no 2 Los resultados negativos pudieron originarse por la fuerte interacción existente entre la enzima y la matriz 76 50 100 150 200 VOLUMEN (mL) :#:F:ole7nupneam:oiuemen'::,i,ÓTgg'c#rdaec,3h:,ioyi-o!iec:hg::S:p:t6E?4g,To4ooL6foáoedaem3:,ifga:?ddoer de elución. 0 5 mLMraccion. PROTOCOLO No. 2. En esta ocasión para la extracción se emplearon 20 g de raíces del 4° día de cultivo. El extracto citosólico obtenido se sometió a precipitación con sulfato de amonio La resuspension obtenída (5.5 mL) se aplicó a una columna para desalar (figura 18) La actividad de PLC se detectó al inicio del volumen vacío de la columna (27-30 mL) y abarcó 5 fracciones haciendo un total de 22 mL Se pudo apreciar que la proteína sale antes que la conductividad confirmando el objetivo de desalar la muestra La muestra desalada (20 mL) se aplicó a una columna de intercambio iónico. El perfil de elución de esta Última columna (figura 19) muestra un pico de actividad dentro del gradiente de elución Las fracciones que mostraron actividad de PLC (46 mL) se mezclaron y concentraron con gel de Sephadex®G-25 ya que en ese momento no se disponi'a del equipo de ultrafiltración (Amicon) 77 40 80 120 VOLUMEN (mL) :Lg:rnaalc8.-,uP:::i2.6':c|isnc#,ldeerisae33acátá#:25P,rpe:;Priiaadc:ai??64oo-:EOÁáesá'La:ohidgeu:dm.:nd: elución; 5 mL/fracción 0025 0020 + 0015 0010 1 ...``_;'.i'`.f+ 0_005 0_000 0 50 100 150 200 250 300 VOLUMEN (mL) Figura 19 Perfil de elución del extracto citosólico desalado en una columna (1.6 x 10 cm) 8Í%Tnpa3Camd|£ff;:g#:M Q Sepharose® High Performance 200 mL de amortiguador de El volLimen concentrado (10 mL) se aplicó a una columna de exclusión por tamaño. El perfil de elución de la columna superdex 200 (figura 20) mostró un volumen vacio de 100 mL y un pico de actividad de PLC pero en una sola fracción que posiblemente se debió a un ensayo de 78 actMdad erróneo Este pico corresponde a una masa molecular de 156 kDa de acuerdo a la curva de calibraci.Ón (figura 8) obteni'da con proteínas de masa molecular conocida. También se observó un segundo pico de actividad correspondiendo a una masa molecular de 61 kDa; este pico de actividad coincide con un pico de absorbancia a 280 nm. :,ugpu::d:%!g#rdeepeg,ruacá:n3d2eo,:Ft:;:t,ousmó::ad:ne,uunc?Ó:?,3u#nLñr,a2c:,;n6ocm,deH,Load® El volumen concentrado (2.2 mL) de las fracciones (del mL 195 al 201 ) que contienen el pico de actividad de PLC obtenido de la eluci.Ón en la columna de exclusión por tamaño se aplicó a una columna de afinidad. En el perfil de elución de esta columna (figura 21) no se detectó actividad de PLC. Esto probablemente fue debido a la dilución de la proteína de interés durante la elución por la columna La absorbancia negativa observada en las figuras 20 y 21 fue el resultado de un error de calibración en el equipo de FPLC. 79 Ei Eziil -----,---. 0 50 100 150 200 250 300 VOLUMEN (mL) L,g#:,n:éepph:r:,sed®e 2ed:CLOLn d:ev¿FumpeLncd:,teq:::ácna, 2enm#r:c::j:mm tt 6 x í 7 cmt de El cuadro de purificación (cuadro 3) indicó que existen 3 veces de purificación con la precipitación 40-60% con sulfato de amonio También se observó que existen aprox 15 veces de purificación en la proteína que no se unió a la Q-Sepharose® Esto se confirmó al observar el gel de poliacrilamida al 10% (figura 22) en el carrn de la proteina que no se unió a Q-Sepharose® se intensifica una banda de 65 kDa que también aparece en el carril del pico de Q-Sepharose® Aunque en el carril que corresponde al eluato de la columna de superdex se observa proteína, cuando se midió la actividad de la PIC para obtener el cuadro de purificación, ya no se detectó alctividad alguna Esto sugiere un proceso de degradación y/o desactivación de la enzima durante su almacenamiento. 80 Cuadro 3. Cuadro de Purificación de la PLC citosólical del 4° dia de cultivo PROTEINATOTAL ACTIVIDADTOTAL PASO DEPURIFICAcloN ACTIVIDADESPECIFICA VECES DEPURIFICACION RENDIMIENTO (%) (mg) (pka') (pkat/mgpl'Ot.) Extracto citosól ico 4853 4077 8403 1 100 Precipitación con(NH4)2S0440-60°/o 919 2 472 43 2688 313 60_63 Desalado por G25 6.56 1 730.5 263.8 313 42.43 No iinida aSefarosa-Q 01 135 1 323.5 15.75 331 Sefarosa-Q 134 50.25 37.47 044 123 Superdex 200 HP 002 0 0 0 0 Sefarosa-heparina 0 0 0 0 0 FOSFORILASA 8 107 kDa BSA 76 kDa OVALBUMINA 52 kDa ANHIDRASA CARBONICA 36.8 kDa lNH. TRIP. SOYA 27.2kDa LISOZYMA 19 kDa Figura 22. Perfil de purificación visto en SDS-PAGE al 10% teñido con nitrato de plata WM, Marcadores de pesos moleculares, 1, extracto total; 2, extracto membranal, 3, extracto citosólico: 4, sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio al 40%, 5, pastilla de la precipitación con sulfa`o de amonio al 40%; 6, sobrenadante de la prec.ipitación con §§#3nd:oedp:TQg_Ts2:5bah;á6:::X;é®,#n:os:í,uLa:{:ea,:Q:Í%:p:í:`:oc::gbcéooné§:c:g:;d:e:aec¿:óTdoa:d:oe,:u:g66oooa{oéTíÍ eluato de la columna de Heparin-Sepharose®. En todos los camles se aplicaron 10 iig de proteína` 81 DISCUSION En células vegetales se ha detectado actividad de PLC tanto en la fracción soluble como en la fracción asociada a la membrana. Ambas poseen características diferentes [Helsper eí a/ , 1985; lrvine eí a/ , 1980, MCMurray and lrvine,1988: Melin eí a/ ,1992, Tate eí a/.,1989, Yotsushima eí a/.,1992,1993]. En su reporte, Pfaffmann eí a/. (1987), examinaron la distribución subcelular de una Pl-PLC de hipocótilos de soya y frijol. De la actividad total de los homogenados, aproximadamente el 85% fue soluble y el 15% estuvo asociada a la membrana; y de la actividad que estuvo asociada a la membrana la actividad más alta fue recuperada `en la fracción correspondiente a la membrana plasmática. Nosotros también hemos detectado actividad de PLC en fracciones solubles y en fracciones asociadas a la membrana [De los Santos eí a/,1997] Para solubilizar la PLC asociada a la membrana se intentaron vanos métodos y se obtuvieron los mejores resultados con la adición de 2 M de cloruro de potasio al amortiguador de extracción [Hernández-Sotomayor eí a/., 1997] Esto indica que esta isoforma puede estar asociada a la membrana débilmente a través de interacciones iónicas. Existen repones sobre la purificación de PLCs en plantas; sin embargo, esta enzima aún no se ha purificado a homogeneidad Una PLC asociada a la membrana plasmática fue purificada 25 veces a partir de raíces de trigo [Melin ef a/, 1992]. La enzima parcialmente purificada hidrolizó PIP y PIP2 a concentraciones micromolares de Ca2+. Esta enzima no fue purificada a homogeneidad debido a su labilidad En arroz, ambas PLC soluble y particulada fueron purificadas a aparente homogeneidad Estas enzimas presentaron masas moleculares aparentes en electroforesis de SDS-poliacrilamida de 55 y 42 kDa, fueron purificadas 311 y 219 veces, y con actMdades específicas de 33 Limol/min/mg de proteína y 19 Limol/min/mg de proteína, respectivamente [Yotsushima eí a/„ 1992,1993] Ambas enzimas fueron altamente específicas para PI, aunque la actividad contra PIP2 pudo ser reconstituída por la adición de un factor proteico perdido durante la purificación En raíces de avena, las dos formas presentes tienen una masa molecular aparente de 50-70 kDa [Huang eí a/.,1995]. En este trabajo, hemos iniciado la purificación de la PLC de C. roseus a partir de raíces transformadas utilizando diferentes tipos de cromatografía como Sephadex G-25, Heparin-Sepharose®, Q-Sepharose®, y Superdex® 200 Aunque no sabemos con certeza el peso molecular aparente de las PLCs existentes en C. roseus, de acuerdo al análisis de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida pudmos apreciar bandas de peso molecular dentro de un rango de 55-75 kDa. De acuerdo al peso molecular de las familias de PLCs en células animales, la PLC de plantas corresponderi'a a las PLCs de tipo ó. Además, se han clonado genes de PLC de Arab/dops/s Íha//ana [Hirayama eí a/.,1995,1997; Yamamoto eí a/„ 1995] y soya [Shi ef a/.,1995] cuyos productos poseen pesos moleculares de 60-70 kDa, similares a las enzimas parcialmente purificadas, y características estructurales parecidas a las de tipo -ó de animales No obstante, no debemos excluir la posibilidad de que en C. noseus exista alguna otra familia de PLC. 82 El incremento de la actividad total observado después de la adición del sulfato de amonio (en la fracción soluble) y del desalado por filtración en gel G25 (en la fracción asociada a la membrana) sugiere la presencia en el homogenado total de algún factor que pudiera estar afectando la actividad de la PLC cuando ambos se encuentran presentes. Esta sugerencia seguirá presente hasta no demostrar lo contrario para lo cual se requieren ensayos de reconstitución durante el proceso de purificación. Por otro lado, aunque se mantuvo en mente iniciar la purificación con cantidades altas de proteína, siempre se observó sobrecargado en las columnas sugiriendo el empleo de columnas mas grandes. Teniendo estos antecedentes se plantea como estrategia el empleo de la precipitación con sulfato de amo"o tratando de optimizar los resultados presentados en este trabajo, el uso de una columna de heparina en una columna de 2.6 x 60 cm para obtener mayor capacidad de unión, incluir una columna de exclusión por tamaño preparativa y como paso final una columna de exclusión por tamaño analítica. En nuestro trabajo, la purificación no se logró debido a la pérdida de la actividad de la enzima. Las causas probables son: a) La inactivación por proteólisis, causa poco probable debido a la presencia de inhibidores de proteasas dentro de los amortiguadores de elución en cada paso de purificación; b) La cantidad de proteína presente en la última etapa de la purificación, originando la dilución de la mezcla aplicada como resultado inevitable del proceso de elución de la columna, originando la incapacidad para detectar la actividad; c) La desnaturalización de la enzima por efecto de la dilución, ya que el hecho de que la enzima se encuentre aislada en una solución altamente dilui.da puede originar desnaturalización; d) La adsorción de la enzima a la superficie de la columna en la última etapa de la purificación, puesto que la enzima es de naturaleza hidrofóbica puede interaccionar con la superficie de la columna ayudada además con la alta dilución en que se encuentra presente; e) La labilidad de la enzima, la pérdida de la actividad de la enzima puede deberse a la presencia de pequeñas cantidades de contaminantes en el amortiguador originando algún proceso reactivo; f) El aislamiento de cierto activador durante alguna de las etapas del proceso de purificación, minimizando la detección de la actividad. Las veces de purificación de ambas PLC soluble y asociada a la membrana (aprox. 6 y 5 veces respectivamente) no alcanzaron las expectativas deseadas Sin embargo, se puede asumir cierta purificación parcial, útil para realizar alguna caracterización adicional de la enzima. Conjuntamente, ya se cuenta con el monta/e de al menos un protocolo de purificación repe`itivo para la obtención de una preparación enzimática de PLC parcialmente pura Para el análisis cinético de la PLC de C, roseus [Hernández-Sotomayor eí a/., en preparación] se utilizó una preparación enzimática purificada parcialmente a partir del extracto membranal (con una actividad específica de 107 nmol/min/mg de proteína) y empleando el último de los protocolos aquí descritos Estas técnicas de purificación podrán ser optimizadas para trabajos futuros sobre la PLC. 83 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Bloom H., Beier H., Gross H.S, (1987). lmproved silver stainíng of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. 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Aunque en las células vegetales se ha demostradQ la .biosíntesis y el metabolismo de los fosfolípídos de inositol [Boss y Massel, 1985; Sandelius y Sommarin, 1986], no se conoce su función fisiológica; sin embargo se ha reportado que la degradación de los fosfolípidos de inositol puede ser inducida por estímulos ambientales como choque osmótico [Einsparh eí a/„ 1988], luz [Morse eí a/., 1989] fitorreguladores de crecimiento tales como auxinas [Eftlinger y Lehle, 1988] y citocininas [Connet y Hanke,1987]. También se ha detectado actividad de fosfolipasa C en una variedad de tejidos vegetales (MCMurray e lrvine, 1988). Todos estos repones proporcionan evidenclas que sugieren que los fosfoli'pidos de inositol tienen una función importante en la transducción de señales en plantas. En este trabajo, se detectó actMdad de una fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en diferentes teiidos de raíces de C. roseus. Pfaffman ef a/„ (1987) han reportado que, de la actividad total de la PLC de los homogenados de hipocótilos de soya, el 85% es soluble y el 15°/o está asociada a la membrana. En células vegetales se han detectado dos tipos de PLC específica para fosfolípidos de inositol: enzimas solubles y enzimas asociadas a la membrana [Mc Murray e lrvine, 1988]. En base a estos repohes, se decidió fraccionar un extracto total proteico para obtener extractos membranales y citosólicos crudos. La actMdad de PLC se detectó en ambos extractos aunque la actividad específica de la enzima fue 10 veces más alta en extractos membranales que en los extractos citosólicos. En las dos líneas de raíces estudiadas, durante los primeros 10 días de cultivo se observó un pico de actMdad de PLC de la fracción citosólica que precede a aquella de fracciones membranales. Ambas actividades son detectadas al inicio de la fase exponencial de la curva de crecimiento. Esta variación de la actividad con respecto al ciclo de cultivo sugiere que el metabolismo de los fosfolípidos de inositol puede estar involucrado en el proceso de proliferación celular. Estos resultados correlacionan con la detección de actividades de proteínas cinasas del metabolismo de los fosfoinosítidos durante el ciclo de cultivo de células en suspensión de C. roseus [Heim y Wagner,1986,1987,1989]. Yotsushima eí a/., (1992,1993) reportaron la purificación a homogeneidad aparente y la caracterización de una PLC soluble y una PLC asociada a membrana a partir de células en suspensión de arroz. La comparación de sus propiedades indica que son jsoenzimas diferentes. La masa molecular 87 aparente de las enzimas asociada a membrana y soluble fue 42 y 55 kDa, respectivamente La PLC asociada a la membrana tuvo un pH Óptimo de 65 mientras que la soluble lo tuvo a 5.2 El ion Sr2+ activó a la PLC asociada a la membrana y no lo hizo con la soluble. Melin ef a/ (1992) reportaron la purificación parcial y caracterización de una PLC de membranas plasmáticas de trigo enzima fue solubilizada con octilglucósido y La la purificaron 25 veces. La enzima parcialmente purificada hidrolizó PIP2 y PIP. En este trabajo se llevó a cabo una caracterización inicial de ambas actividades detectadas con el fin de realizar un análisis y comparación de la conducta enzimática. Cabe hacer notar que esta caracterización preliminar fue hecha en extractos crudos AsÍ bien, al determinar la especificidad por el sustrato observamos que la PLC asociada a membrana hidrolizó preferencialmente al PIP2 y al PIP mientras que la PLC de la fracción citosólica hidrolizó preferencialmente al PIP y al Pl. Estos resultados preliminares correlacionan con aquellas reportadas para las PLCs asociadas a membrana y solubles respectivamente. Las PLCs de plantas superiores requieren de Ca2+ para su activación [lrvine eí a/, 1980] Las actividades de PLC reportadas en plantas son dependientes de Ca2+ a concentraciones micromolares (enzimas asociadas a membrana) y a concentraciones milimolares (enzimas soluble) En contraste con la dependencia de Ca2. de las enzimas solubles reportadas, la actividad de ambas PLCs que detectamos en las raíces de la línea Jl de C. mseus tienen una dependencia total a concentraciones micromolares de calcio y se presenta un efecto inhibitorio a concentraciones superiores de calcio De acuerdo a algunos investigad]res, los niveles basales de Ca2+ libre en la célula vegetal se encuentran en un rango Je 100 a 300 nM [Dr®bak,1992, Felle,1988] Esto indica que ambas PLCs se encuentran inactivas a niveles basales en la célula y que la actividad enzimática es estimulada cuando las concentraciones de Ca2+ citosólico se eleva a niveles micromolares en respuesta a algún estímulo a la célula por 1o que podrían estar reguladas por la concentración de Ca2+ en el citosol Parece ser que las PLC solubles contribuyen a la amplificación de señales en lugar de transducir señales extracelulares dentro de la célula En células animales se ha reportado que los fosfolípidos de inositol están localizados en la pane citosólica de la bicapa lipídica y que el contenido de fosfatidilinositoles es mayor en las endomembranas que en la membrana plasmática [Hokin, 1985] En plantas superiores, Ias membranas plasmáticas están ennquecidas de PIP y PIP2 mientras que los microsomas contienen PI [Boss,1989] Estas observaciones mantienen la función hipotétióa de las PLCs solubles. Sin embargo, también en células animales se ha reportado la translocación de la PLC-yl desde el citosol hacia la membrana en respuesta a factores del crecimiento aunque no se conoce la naturaleza de este mecanismo [Todderud e( a/ ,1990, Kim ef a/ ,1989]. Por lo tanto, tampoco podemos excluir la posibilidad de que cieha translocación pudiera estarse llevando a cabo Al determinar los parámetros cinéticos aparentes se observaron cambios durante los primeros 10 días de cultivo, hasta llegar a ser similares Estos datos no proporcionan información relevante que se puedan tomar en cuenta para sacar conclusiones aunque sÍ nos dan una idea de que el comportamiento 88 enzimático en su máxima actividad es diferente uno del otro. Por ello, indispensable la determinación de los parámetros cinéticos con la enzima pura. es La estimulación de la actividad de la PLC por deoxicolato y Tritón X-100, en membranas plasmáticas de raíces de trigo, se observó a un 0.01% (p/v) [Melin ef a/,1992] y a 0.02-0 025% (p/v) [Pical eí a/.,1992]; la inhibición de la actividad enzimática se presentó cuando la concentraciones fueron superiores a 0 05%. En nuestro modelo el Tritón X-100 tuvo un efecto inhibitorio a panir de 0.02% (p/v) tanto en la PLC soluble como en la PLC membranal. El deoxicolato activó unicamente a la PLC soluble a 0.02% (p/v) El octilglucósido activó a la PLC asociada a membrana pero únicamente a 0 04°/o (p/v) mientras que la PLC soluble se activó a concentraciones superiores (0.15-0.2°/o). El aumento de la actividad enzimática en presencia de detergentes podría ser explicada en varias formas: a) el complejo substrato lípido-detergente es un mejor substrato para la enzima que el substrato lípido solo; y b) el detergente abre una barrera estructural y expone el sitio activo de la enzima. La primera explicacjón no sería vállda si a concentraciones altas de detergente se observa inhibición de la enzima. La segunda opción sería la indicada si tomamos en cuenta el efecto diferencial de los tres detergentes sobre una misma isoenzima. Además, la comparación de los datos reportados para la PLC en plantas sugeriría que el efecto de cierto detergente podría deberse a la combinación específica de la enzima con el detergente, o bien el sustrato lípido con el detergente. Aunque existen reportes en relación a la purificación y caracterización de las PLCs especi.ficas para fosfolípidos de inositol en plantas, ésta no ha sido purificada a homogeneidad. Huang ef a/ (1995) reportaron al menos cuatro vanantes de Pl-PLCs en las raíces de plántulas de avena, dos citosólicas y dos asociadas a la membrana. Las dos variantes citosólicas y las dos asociadas a la membrana se separaron en base a su afinidad por la heparina. En nuestro modelo no descartamos la existencia de isoformas con diferente afinidad por la heparina ya que se detectó actividad de PLC en el perfil de lavado y elución de la proteína en la columna de heparina. La purificación parcial de la fosfolipasa C de C. roseus que hemos obtenido puede ser optimizada para lograr la homogeneidad. Ambas PLC soluble y asociada a la membrana de C. roseus mostraron afinidad por heparina, unión a Q-sepharose, y una buena elución por cromatografía de exclusión de tamaño. La existencia del ciclo de los fosfoinosítidos en células vegetales ha sjdo establecida a partir de la determinación tanto de sus metabolitos como de sus actividades enzi.máticas [Boss, 1989; Sandelius y Sommarin, 1990]. Desde hace más de una década, se han realizado estudios preliminares con fitohormonas que mostraron efectos sobre las actividades enzimáticas del ciclo de los fosfoinosi'tidos y cambios en las reservas de sus metabolitos [Falkenau ef a/,1987; Connett y Hanke,1987; Murthy eí a/..1989] Ettlinger y Lehle (1988) estudiaron la capacidad del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) para reiniciar la división celular de células en suspensión de Caíharaníhus roseus mantenidas en la fase Gi. La adición de 2,4-D causó una disiminución transiente de PIP y PIP2 acompañada de un aumento en los niveles de lp2 e lp3, Estos efectos sugerían la estimulación de la PLC por auxinas, por lo que Zbell y Walter-Back (1988) utilizaron el ácido ¡ndolacético (lAA) 89 en células en suspensión de Daucus carioía para observar los efectos que éste produciría. La adición de lAA a las preparaciones microsomales redujo los niveles de PIP`y PIP2 sugiriendo un efecto de la auxina sobre la acción catalizadora de la PLC Otros reportes relacionados con la existencia del metabolismo de los fosfoinosítidos en plantas en respuesta a otras señales refieren a los efectos de la luz sobre el control del movimiento de las hojas en Samanea saman [Morse et al., 1989]. La luz blanca indujo un aumento del lp2 e lp3 así como diacilglicerol. Actualmente, dadas las evidencias se deduce que la PLC en plantas, como en células animales, puede estar involucrada en diferentes procesos; es por esto, que se requiere atención y esfuerzo para demostrar una acción concertada de los elementos involucrados en el metabolismo de los fosfoinosítidos en determinado peoceso La purificación a homogeneidad de al menos una de las isoenzimas de la PLC en C. noseus permitirá un estudio más profundo para conocer la función de estas enzimas en la fisiología vegetal, en el desarrollo, y en la respuesta a cambios ambientales. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Boss W.F. and Massel culture cells. Biochem (1985). Polyphosphoinositides are present in plant tissue Biophys. Res Commun.,132.1018-1023. Boss W.F. (1989) Phosphoinositide Metabolism lts Relation to Signal Transduction in Plants ln Second Messengers in Plant Growth and Development, W F. Boss and D.J Morré (Eds.), Alan R. Liss, New York, 29-56. Conet R.J.A. and Hanke D.A. (1987). 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Durante una curva de crecimiento de la línea J1, ambas actividades alcanzaron un pico máximo durante el inicio de la fase exponencial 8) La actividad de PLC en ambos extractos, membranales y solubles, fue dependiente de calcio a concentraciones micromolares. C) La actividad de PLC presente en extractos membranales es especi'fica para fosfoinosítidos monofosforilados y bisfosforilados, mientras que la actividad de la PLC presente en extractos solubles es específica para fosfoinosítidos no fosforilados y monofosforilados D) El efecto que tienen los detergentes sobre la actividad de la PLC es diferencial El octilglucósido fue el único detergente de los estudiados que tuvo un efecto estimulatorio sobre la actividad de PLC presente en ambos extractos E) El protocolo establecido para la purificación parcial de la PLC presente en extractos solubles y en extractos membranales permite obtener 5-6 veces de purificación partiendo del eluato desalado de ambas fracciones Con este protocolo se obtienen en la preparación final varias proteínas cuyas masas moleculares están en el rango de 55 a 75 kDa determínados por SDS-PAGE 93 CAPITULO 6 Perspectivas Actualmente, es evidente que los constituyentes de fosfoinosítidos, incluyendc) los fosfolípidos, inositoles fosfatos y encuentran presentes en las plantas También es evidente que los cuales opera esta vía apenas comienzan a ser elucidados, tratando la vía de los las enzimas, se medios por los de encontrar su participación en mecanismos de transducción de señales a estímulos tales como luz, fitohormónas, ataque a patógenos y estrés S.in embargo, hasta ahora no ha emergido un esquema que defina claramente la posición de los elementos de esta vía dentro de las células vegetales. Aunque a lo largo de los años las investigaciones acerca del metabolismo de los fosfoinosítidos han sido hechas basándose en los mecanismos que existen en células animales, es necesario enfatizar que esta vía podría no funcionar en idéntica forma en plantas De cualquier manera, se tiene la ceneza de que esta vía en plantas pahicipa en varios procesos en los cuales se transfiere información intercelular e intracelular. Existe una lista de acciones futuras a seguir` 1. PURIFICACIÓN A HOMOGENEIDAD DE LA PLC DE C roseus La acción inmediata a seguir es la purificación a homogeneidad de cualquiera de las PLCs presentes en las ralces transformadas de C roseus considerando los antecedentes de este trabajo e incluyendo algún paso adicional. Uno de éstos podría ser la purificación mediante una electroforesis en gel preparativo, una vez identificada la banda proteica (con anticuerpos comerciales contra alguna PLC de animales) se cofta del gel y la proteína se electroeluye y concentra. Otra alternativa sería una cromatografía de afinidad utilizando una columna con una matriz que contenga acoplado un anticuerpo dirigido contra alguna de las regiones comunes a las PLCs de ammales, un anticuerpo dirigido contra la secuencia completa de alguna PLC de animales o bien algún ligando específico para um a la PLC (p ej. IP3). Para optimizar el grado de pureza, se puede realizar la combinación de ambas estrategias ya mencionadas seguida de la cromatografia de afinidad y posteriormente preparativo. 2. la electroelución PRODUCCIÓN de DE la proteína separada ANTICUERPOS. La mediante obtención el gel de los anticuerpos puede hacerse directamente a partir de la banda proteica cortada y electroeluída del gel, e incluso sin electroeluirla del gel Lo ideal es obtenerlos a partir de una proteína con un alto grado de pureza Los anticuerpos obtenidos serían útiles para realizar estudios de inmunolocalización /.n v/íro e /n v/.vo a nivel celular o de tejido, o bien para determinar si existe expresión o activación de la enzima a lo largo del ciclo de cultivo 3, ESTUDIOS CINÉTICOS. Con la enzima pura se podrían determinar los parámetros cinéticos de la enzima. El análisis cinético se realizaría de acuerdo a la cinética de dilución superficial descrita para las fosfolipasas y que incluye dos 94 reacciones: Ia primera es la asociación de la enzima con la superficie micelar y la segunda es la catálisis interfacial de donde se obtienen los valores de Km y Vmax. Estos valores podrían ser comparados con los parámetros cinéticos reponados para algunas de las PLCs, o bien servir como referencia en futuros estudios cinéticos con alguna PLC aislada de otra fuente vegetal. 4. SECUENCIACIÓN DE LA ENZIMA. La secuenciación de la enzima permitiría conocer la homología qiie ésta presenta con las enzimas de células animales y, como resultado, la clasificación dentro de la familia de PLCs Por otro lado, de la secuencia de aminoácidos se puede derivar el diseño de oligonucleótidos para la obtención del gen, mismo que sería útil para expresar la proteína ya sea en alguna bacteria o tejido vegetal mediante transformación dependiendo de los fines a que se diriga la expresión. 5. EXPERIMENTOS DE RECONSTITUCIÓN. Con la enzima pura y algunos de los elementos de transducción (receptores, proteínas G, mastoparan) de células animales se podría saber si esta enzima sigue el mismo mecanismo de acción que en animales Además, en estos experimentos se pueden incluir fitorreguladores para conocer su efecto sobre esta vía de transducción de señales. 6. EXPERIMENTOS DE MUTACIÓN. La clonación del gen de la PLC de plantas permitiría realizar experimentos de mutagénesis sitio dirigida, ya sea para conocer la función que tiene la enzima en la célula vegetal, o bien para conocer los sitios de interaccion con los elementos del mecanismo de transducción. Esto se realizaría cambiando un aminoácido en particular o cierta secuencia de aminoácidos que parezca es requerida para alguna función de la enzima. 95 ffl`ffiüHffiü!Hmü!mmüiñmffi¡mñm r*íS üí®X~ íJx®~XB9 ñmEmÑmmi-ELEiññEñ-EñüüiEmH tíb€ Áj oEmm DE "vNlaAcm cl[NTl[10A D[ TllBATAN, A.c. 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