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Explicación de TP Nº 1
Técnicas de biología molecular
utilizadas en el diagnóstico de
enfermedades hereditarias
Química Biológica Patológica
Dra. Mariana L. Ferramola
Dra. Gabriela Lacoste
2015
Conceptos básicos en genética:
Gen
Natural, común o salvaje.
Alelo
Haplotipo
Genotipo
Fenotipo
Mutación
Polimorfismo
Alelos variantes o mutantes.
Conceptos básicos en genética:
Cromosómicos.
Desórdenes
genéticos
Monogénicos o
mendelianos.
Multifactoriales.
Homocigotas
Desórdenes
monogénicos:
Heterocigotas
Heterocigotas
compuestos
Variación genética:
mutación y
polimorfismo.
Mutaciones:
“Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido
o en la organización del ADN”
Genómicas
Mutaciones
Cromosómicas
Génicas
“No todas las mutaciones tienen consecuencias
clínicas”
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e
inserciones
Pequeñas (pueden producir
corrimiento del marco de
lectura).
Grandes (afectan la estructura
génica).
Deleciones e inserciones grandes:
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e inserciones pequeñas:
Tipos de mutaciones génicas:
Sustituciones
de nucleótidos
(puntuales)
Mutaciones de cambio de sentido
(missense)
Mutaciones sin sentido
(nonsense)
Mutaciones del procesamiento
de ARN
Mutaciones de cambio de sentido (missense) y sin sentido
(nonsense):
Polimorfismos:
Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se
encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la
población general.
Aplicaciones:
Forenses
Filiación
Medicina
Tipos de polimorfismos: SNPs, Inserción-Deleción
(STR, VNTR), RFLP
Tipos de polimorfismos: de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del ADN que
modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es
decir para determinar la presencia/ausencia de una
enfermedad/alelo mutado en individuos .
Métodos de análisis de
los ácidos nucleicos.
Conceptos básicos en biología molecular:
Endonucleasas de
restricción
Electroforesis
Sonda
Hibridación
Ligación
Polimerasas
Cebadores
Transferasas
Endonucleasas de restricción:
Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena
(dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos,
produciendo fragmentos de DNA definidos.
Endonucleasas de restricción:
Cuando se somete un fragmento de ADN a restricción con una
endonucleasa, esta genera fragmentos definidos, que
dependen del patrón de corte de la enzima.
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Geles de
poliacrilamida
Alta resolución.
Separan fragmentos de DNA
<500pb.
Geles de
agarosa
Baja resolución.
Separan fragmentos de DNA
de entre 300 a 10000pb.
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Sondas de ácidos nucleicos:
Molécula de ADN o ARN marcada, usada para
identificar secuencias complementarias mediante
hibridación.
Marcación de sondas
Radiactiva
Interna
No radiactiva
Externa
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Marcación
interna:
ADN polimerasas
Desplazamiento de
mella (*dNTP).
Random primer
extension (*dNTP o
*cebador).
Automatizada
Sondas de
oligonucleótidos
(*dNTP).
Marcación por desplazamiento de mella:
Nick translation.
Marcación por elongación de cebadores
aleatorios: random priming.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Marcación
Externa:
Polinucleótido quinasa
Marcación con 32P
en extremo 5’,utiliza
γ[32P]-ATP.
Marcación no
radiactiva.
Transferasa terminal
Marcación con 32P en
extremo 3’, utiliza
α[32P]-ATP.
Marcación no
radiactiva.
Marcación externa: Polinucleótido quinasa
Marcación externa: Transferasa terminal.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Formas de marcación
de sondas de ácidos
nucleicos: Radiactiva
y no radiactiva
Hibridación de ácidos nucleicos:
Las
hebras
complementarias de
ácidos
nucleicos
pueden
separarse
(desnaturalización) y
dadas las condiciones
adecuadas pueden re
asociarse
(hibridación).
Hibridación de ácidos nucleicos:
Factores que afectan la velocidad y especificidad
de hibridación:
Longitud del acido nucleico.
Composición de base.
Fuerza iónica.
Viscosidad.
Temperatura
Presencia de agentes desnaturalizantes.
pH
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tan
sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar
secuencias complementarias cuya concentración sea incluso
de 1 sola molécula por célula.
Rigurosa (bajo condiciones
astringentes).
Hibridación:
Poco rigurosa (bajo condiciones
no astringentes).
Longitud de una
sonda:
Desde 5 hasta miles de
nucleótidos
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos
que utilizan sondas.
Transferencia Southern
Análisis de DNA.
Transferencia Northern
Análisis de RNA.
Dot Blot
Revelado mediante
sondas ASO.
Transferencia Southern:
Se utiliza para analizar
fragmentos de ADN
generados por digestión
con enzimas de
restricción.
Transferencia Southern:
Transferencia Southern:
Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de
actividad variable, dependiendo del uso.
Principales usos:
Detección
de
secuencias
relacionadas ( ej. familias de genes).
Detección
de
deleciones
e
inserciones grandes causantes de
enfermedades
(ej.
Distrofia
muscular de Duchenne).
Identificación
de
individuos
mediante VNTR.
Detección de RFLP.
Tipos de polimorfismos: de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del ADN que
modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es
decir para determinar la presencia/ausencia de una
enfermedad/alelo mutado en individuos .
RFLP: detección
mediante
Southern
Blotting
1.
2.
3.
4.
5.
Extracción de ADN
Digestión con la Enzima de Restricción apropiada
Separación de los fragmentos por electroforesis y
transferencia a membrana (Southern Blotting)
Hibridación con la sonda especifica y revelado.
Análisis de los resultados
RFLP: detección mediante Southern Blotting
Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tiene
relación con la mutación que produce el trastorno.
De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce el
trastorno.
Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia.
Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estar
ligados (separados por una distancia no mayor a 106 pb)
RFLP: PCR-RFLP
1. Extracción de ADN
2. Amplificación con un
par de primers
específicos a la
región en estudio
(PCR)
3. Digestión con la
Enzima de
Restricción apropiada
4. Separación de los
fragmentos por
electroforesis, teñido
con Gel Red
5. Análisis de los
resultados
RFLP: PCR-RFLP
• Más simple y
económico que el
RFLP tradicional.
• Se requiere mayor
información de la
zona donde ocurre la
mutación.
• Generalmente es
la mutación que
genera el trastorno
la que da lugar al
polimorfismo.
Transferencia Northern:
Se utilizan sondas de tamaño intermedio. Esta técnica
permite estudiar la expresión génica celular.
Actualmente esta técnica ha caído en
desuso, debido a la utilización de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Transferencia Northern:
Se utiliza para analizar fragmentos de RNA
obtenidos a partir de extracción.
Transferencia Northern:
Comparación entre transferencias
Northern y Southern:
Dot Blot:
Se utiliza para detección de mutaciones puntuales,
principalmente aquellas que no modifican el patrón de
restricción de una secuencia de nucleótidos.
Revelado:
Sondas ASO
Condiciones de hibridación
de elevada astringencia.
El análisis de mutaciones puntuales
utilizando la hibridación de sondas ASO se
basa en el principio de que la presencia de
UN SOLO ERROR DE APAREAMIENTO entre
un nucleótido de la sonda y el ADN blanco
es suficiente para desestabilizar el híbrido.
Una de las primeras técnicas utilizadas
para el análisis de mutaciones puntuales
CONOCIDAS
sobre
fragmentos
amplificados de ADN.
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
2. Dot Blot: desnaturalización y transferencia de los productos
amplificados a una membrana.
El producto de PCR se
desnaturaliza (NaOH
2N y 95 °C). Se añade
a los pocillos donde
el vacío impulsa el
pasaje de la solución
a través de la
membrana (nylon o
nitrocelulosa).
La membrana se seca
entre filtros durante
una hora a 80° C en
estufa (o por cross –
linker).
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas y
complementarias para la secuencia de interés.
Pre-hibridación: solución de SDS y ADN de
esperma de salmón desnaturalizado.
Bloquea la membrana para evitar
reacciones inespecíficas (2h a 37°C).
Hibridación: sonda normal y mutada (8h
a 37°C).
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada.
5. Interpretación e informe.
Interpretación e informe:
Individuo 1: +/- : Heterocigota para la mutación.
Individuo 2:-/- : No presenta la mutación.
Individuo 3:+/+: Homocigota para la mutación.
Individuo 4:+/- : Heterocigota para la mutación.
Individuo 5:-/- : No presenta la mutación.
Individuo 6:+/+: Homocigota para la mutación.
Individuo 7:-/- : No presenta la mutación.
Individuo 8:+/+: Homocigota para la mutación.
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
Anemia Falciforme
PCR-ASO (PCR-Sondas Alelo Específicas)
PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de
Sondas)
1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.
2. Desnaturalización del producto de PCR doble cadena.
3.Hibridación de las sondas marcadas (sondas alelo específicas
marcadas con biotina y sonda común marcada con fluoresceína)
PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de
Sondas)
4.Ligamiento
5.Captura y revelado
PCR-OLA (PCR-Ensayo de Ligamiento de
Sondas)
Ac acoplado a la
enzima+ sustrato
Sonda capturada
Estreptavidina
tapizando los wells
WT M
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Se lleva a cabo una reacción de amplificación del ADN en
presencia de los cuatro dNTPs y concentraciones mucho
menores de los cuatro análogos ddNTPs, que dan lugar a la
terminación de la síntesis cuando son incorporados.
Resolución de bandas en geles de
poliacrilamida
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación automática.