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Enfermedades genéticas
Desórdenes genéticos
Mutaciones
Rearreglos genómicos
Variación en número de cromosomas
Congénitos
Desórdenes genéticos
Línea germinal
somáticos
Aparecer en algún momento post nacimiento
cancer
Monogenéticas, heredables en forma mendeliana.
Enfermedades
genéticas
Poligenéticas o complejas, no heredables en forma
mendeliana.
Somáticas (en algunos casos con predisposición
heredable).
2
Estrategias para la identificación de la/s alteraciones genéticas responsables o que se
asocian con una enfermedad genética (identificación de marcadores para diagnóstico)
Clonado de un gen candidato
Alteraciones
cromosomales
(número y rearreglos)
dada una enfermedad genética
analizar síntomas y parámetros
que caracterizan la enfermedad.
Buscar gen candidato
Observación al
microscopio
Análisis de ligamiento y clonado
posicional del gen
Comparación de genomas
Comparación de transcriptomas
Proteómica
Patrones de metilación de ADN
o histonas.
Especialmente en cáncer
Si dos genes están localizados en el
mismo cromosoma, en forma cercana
uno del otro es muy probable que se
hereden en forma conjunta
Estudios de asociación
en una población
Aplicable a enfermedades
Complejas.
Marcadores usados: SNP´s
Diabetes, asma, autismo,
transtornos mentales, lupus,
migraña, hipertensión,
epilepsia, Alzheimer, etc.
Aplicable a enfermedades monogenéticas,
algunos cánceres en los que el gen que
predispone se hereda en forma mendeliana (gen de
Retinoblastoma).
Marcadores de posicionamiento usados: ≠ genes conocidos
RFLP, SSLP´s
3
Marcadores de
posicionamiento
RFLP
4
Polimorfismos de microsatélites (MSPs): Secuencias repetidas de 2 nucleótidos en
tandem. El número de repeticiones es altamente variable. La mayoría es repetición de (dC-dA)n
o (dG-dT)n en la cadena complementaria.
Ocurre en promedio 1/50 kb en el genoma humano. Microsatélites con 20 o más repeticiones
Son altamente polimórficos (10-15 diferentes alelos en la población para cada uno). Se
amplifican por PCR, se diferencian por su tamaño en geles de agarosa. Los oligos son
complementarios a las secuencias flanqueantes del microsatélite.
Existen mapas de RFLPs y de MSPs (2000 marcadores cada 3 cM) para todos los
cromosomas humanos.
Se estudia en un pedigrí la asociación de un marcador con el fenotipo de la enfermedad.
FQ
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Estrategias para la identificación de la/s alteraciones genéticas responsables o que se
asocian con una enfermedad genética (identificación de marcadores para diagnóstico)
Clonado de un gen candidato
Alteraciones
cromosomales
(número y rearreglos)
dada una enfermedad genética
analizar síntomas y parámetros
que caracterizan la enfermedad.
Buscar gen candidato
Observación al
microscopio
Análisis de ligamiento y clonado
posicional del gen
Comparación de genomas
Comparación de transcriptomas
Proteómica
Patrones de metilación de ADN
o histonas.
Especialmente en cáncer
Si dos genes están localizados en el
mismo cromosoma, en forma cercana
uno del otro es muy probable que se
hereden en forma conjunta
Estudios de asociación
en una población
Aplicable a enfermedades
Complejas.
Marcadores usados: SNP´s
Diabetes, asma, autismo,
transtornos mentales, lupus,
migraña, hipertensión,
epilepsia, Alzheimer, etc.
Aplicable a enfermedades monogenéticas,
algunos cánceres en los que el gen que
predispone se hereda en forma mendeliana (gen de
Retinoblastoma).
Marcadores de posicionamiento usados: RFLP, SSLP´s
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Cancer
El desarrollo y evolución
de algunos tumores
requiere múltiples
alteraciones genéticas
Proto-oncogenes: por mutación se convierten en oncogenes
Participan en crecimiento celular
(regeneración de la piel, sangre, etc.)
No es más regulable,
Estimula sin freno el
Crecimiento:
Bcl-2, ciclina
Inhibe apoptosis
Los genes cuya
alteración
contribuye
estimula crecimiento
Genes supresores de tumor: normalmente mantiene bajo
el número de células por inhibición del ciclo celular o por
promover la apoptosis. Su mutación provoca que no haya más
inhibición del crecimiento o que no haya apoptosis de
células malignas (p53, gen que codifica para la proteína retinoblastoma)
Genes de inestabilidad: normalmente controlan la tasa de
angiogenesis
mutación genética (genes de reparación de mismatch). Su
mutación hace que ocurran mutaciones en proto-oncogenes o en
genes supresores.
Genes que regulan la mitosis: problemas en segregación de
cromosomas y rearreglos
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Estrategias para la identificación de la/s alteraciones genéticas responsables o que se
asocian con una enfermedad genética (identificación de marcadores para diagnóstico)
Clonado de un gen candidato
Alteraciones
cromosomales
(número y rearreglos)
dada una enfermedad genética
analizar síntomas y parámetros
que caracterizan la enfermedad.
Buscar gen candidato
Observación al
microscopio
Análisis de ligamiento y clonado
posicional del gen
Comparación de genomas
Comparación de transcriptomas
Proteómica
Patrones de metilación de ADN
o histonas.
Especialmente en cáncer
Si dos genes están localizados en el
mismo cromosoma, en forma cercana
uno del otro es muy probable que se
hereden en forma conjunta
Estudios de asociación
en una población
Aplicable a enfermedades
Complejas.
Marcadores usados: SNP´s
Diabetes, asma, autismo,
transtornos mentales, lupus,
migraña, hipertensión,
epilepsia, Alzheimer, etc.
Aplicable a enfermedades monogenéticas,
algunos cánceres en los que el gen que
predispone se hereda en forma mendeliana (gen de
Retinoblastoma).
Marcadores de posicionamiento usados: RFLP, SSLP´s
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Enfermedad determinada por alteraciones genéticas: estudios que se pueden realizar
A nivel de proteínas
A nivel de ARNm
A nivel de ADN
Detección de apoptosis
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A nivel de proteínas:
Búsqueda de marcadores: Proteómica, fago display
Diagnóstico: Diagnóstico por inmunocitoquímica, inmunohistoquímica
Detección por Western blot de proteínas alteradas en tamaño
Utilización de Citometría de Flujo
10
Proteómica: análisis de proteínas en gran escala
Comparar perfiles de proteínas entre células sanas y enfermas o células enfermas tratadas con
distintas drogas
Estudiando los datos obtenidos encontrar marcadores que puedan servir para diagnóstico, inferir
mecanismo de desarrollo de la enfermedad, encontrar nuevos blancos de drogas y para otro tipo
de intervención terapéutica, clasificación de tumores.
Bases de datos
http://www.expasy.org/ch2d/2d-index.html
11
Phage display:
péptidos o anticuerpos que se unen especificamente a células de un tumor:
Uso: búsqueda de ligandos de marcadores para subsiguiente uso en diagnóstico o en terapia.
Biblioteca de péptidos en fago
Previamente adsorbida con células normales
Células cancerosas
células normales
Péptido
seleccionado
Péptido
control
negativo
Amplification
And purification
E. coli
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Aptámeros
SELEX:Sistemática evolución
de ligandos por enriquecimiento
exponencial
13
A nivel de proteínas:
Búsqueda de marcadores: Proteómica, fago display
Diagnóstico: Diagnóstico por inmunocitoquímica, inmunohistoquímica
Detección por Western blot de proteínas alteradas en tamaño
Utilización de Citometría de Flujo
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Citometría de Flujo
Inmunofenotipificación:
Identificación de distintas poblaciones celulares y determinación de su estado funcional.
ERM
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Detección de apoptosis
Muerte celular programada:
cambios morfológicos característicos
Aumenta en algunas enfermedades degenerativas
Disminuye en algunos cánceres
Detección de fragmentos de ADN
Detección de células apoptóticas por marcación de
extremos de ADN
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A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación:
Muestra: in situ (localización física), amplificación de ADN de muestra, extracción de ADN, microdisección
con rayo laser.
Técnicas:
Se utilizan para detectar:
Rearreglos cromosómicos
variación en número de cromosomas: FISH, CGH, MLPA
Pérdidas o ganancias cromosomales o de
porciones de cromosomas
Rearreglos cromosomales: FISH
Mutaciones puntuales y polimorfismos
PCR, RT-PCR (algunas translocaciones) Grado de metilación
Ganancia o pérdida de genes: MLPA, CGH
detección de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de
ligación de oligonucleótido, SNuPE (primer extension de un
único nucleótido), OSA (hibridación con oligonucleótidos
específicos), PASA (amplificación alelo específica),
alineamiento competitivo de oligonucleótidos, RFLP, MLPA.
Real time PCR. Microarray, secuenciación
detección de mutaciones desconocidas: Secuenciación,
SSCP, RNAsa, clivaje químico, PCR-DGGE. Real time PCR.
Permiten:
Detección y diagnóstico de desórdenes genéticos que
determinan la enfermedad
Diagnóstico de individuos portadores de mutación
recesiva
Diagnóstico prenatal
Diagnóstico preimplante en fecundación in vitro (PGD).
Mutaciones o alteraciones somáticas: determinación de
la base genética de la enfermedad, diagnóstico,
clasificación de tumores, ERM, prognosis).
Identificación de SNP´s asociados a enfermedades
complejas.
Determinación de grado de metilación de ADN
17
FISH
Utilización de sondas
fluorescentes
Diagnóstico preimplante, prenatal, cancer
Rápida diagnosis de alteración en número de
cromosomas:
trisomía 21 (Síndrome de Down).
trisomía 13
trisomía 18
cantidades anormales de X o Y
Generalmente se marcan regiones grandes del cromosoma (70 kb)
PRINS (primed in situ labeling, síntesis con iniciadores in situ)
Se utiliza preferentemente para genes.
Elongación de ADN utilizando ADN polimerasa,
oligonucleótido específico, dNTP de los cuales uno está marcado.
XY
XX
18
Diagnóstico de rearreglos cromosomales
Linfoma: t(14;18)
Leucemia mieloide crónica: t(9;22)
Leucemia promielocítica aguda: t(15;17)
Linfoma de células de Mantle: t(11;14)
Se generan genes híbridos que dan lugar en ocasiones
a nuevos mensajeros
2R2G
1R1G2F
2R1G1F
Otra forma de detectar: PCR, RT-PCR (algunas translocaciones)
ERM (enfermedad residual mínima): PCR ó RT-PCR para translocaciones
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CGH
Diagnóstico y búsqueda de marcadores
Cambio en el número de copias en el ADN (Ganancia o pérdida)
Variación en número de cromosomas
duplicación
Se puede también hacer sobre un microarray
20
MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification
Diagnóstico
Cambio en el número de copias en el ADN (Ganancia o pérdida)
Número de cromosomas
Cambio para la sonda A = Valor del picoA normalizado para muestra paciente
Promedio de valor del picoA normalizado para muestra normal
Area o altura del pico
Suma de las áreas o alturas de todos los picos de la muestra
21
Número de cromosomas
Ganancia o perdida de genes
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A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación:
Muestra: in situ (localización física), amplificación de ADN de muestra, extracción de ADN, microdisección
con rayo laser.
Técnicas:
Se utilizan para detectar:
Rearreglos cromosómicos
variación en número de cromosomas: FISH, CGH, MLPA
Pérdidas o ganancias cromosomales o de
porciones de cromosomas
Rearreglos cromosomales: FISH
Mutaciones puntuales y polimorfismos
PCR, RT-PCR (algunas translocaciones) Grado de metilación
Ganancia o pérdida de genes: MLPA, CGH
detección de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de
ligación de oligonucleótido, SNuPE (primer extension de un
único nucleótido), OSA (hibridación con oligonucleótidos
específicos), PASA (amplificación alelo específica),
alineamiento competitivo de oligonucleótidos, RFLP, MLPA.
Real time PCR. Microarray, secuenciación
detección de mutaciones desconocidas: Secuenciación,
SSCP, RNAsa, clivaje químico, PCR-DGGE. Real time PCR.
Permiten:
Detección y diagnóstico de desórdenes genéticos que
determinan la enfermedad
Diagnóstico de individuos portadores de mutación
recesiva
Diagnóstico prenatal
Diagnóstico preimplante en fecundación in vitro (PGD).
Mutaciones o alteraciones somáticas: determinación de
la base genética de la enfermedad, diagnóstico,
clasificación de tumores, ERM, prognosis).
Identificación de SNP´s asociados a enfermedades
complejas.
Determinación de grado de metilación de ADN
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Detección de mutaciones desconocidas
Secuenciación
Clivaje
Clivaje con RNAsa
Clivaje químico
C
T
Clivaje con endonucleasa
24
SSCP:
polimorfismo
conformacional
de simple cadena
25
DGGE: Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización
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A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación:
Muestra: in situ (localización física), amplificación de ADN de muestra, extracción de ADN, microdisección
con rayo laser.
Técnicas:
Se utilizan para detectar:
Rearreglos cromosómicos
variación en número de cromosomas: FISH, CGH, MLPA
Pérdidas o ganancias cromosomales o de
porciones de cromosomas
Rearreglos cromosomales: FISH
Mutaciones puntuales y polimorfismos
PCR, RT-PCR (algunas translocaciones) Grado de metilación
Ganancia o pérdida de genes: MLPA, CGH
detección de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de
ligación de oligonucleótido, SNuPE (primer extension de un
único nucleótido), OSA (hibridación con oligonucleótidos
específicos), PASA (amplificación alelo específica),
alineamiento competitivo de oligonucleótidos, RFLP, MLPA.
Real time PCR. Microarray, secuenciación
detección de mutaciones desconocidas: Secuenciación,
SSCP, RNAsa, clivaje químico, PCR-DGGE. Real time PCR.
Permiten:
Detección y diagnóstico de desórdenes genéticos que
determinan la enfermedad
Diagnóstico de individuos portadores de mutación
recesiva
Diagnóstico prenatal
Diagnóstico preimplante en fecundación in vitro (PGD).
Mutaciones o alteraciones somáticas: determinación de
la base genética de la enfermedad, diagnóstico,
clasificación de tumores, ERM, prognosis).
Identificación de SNP´s asociados a enfermedades
complejas.
Determinación de grado de metilación de ADN
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detección de mutaciones conocidas
Alteración en sitios de restricción
28
29
ASO:uso de oligonucleótidos alelo
específicos para análisis de hibridación
PCR-ASO
30
31
Amplificación alelo específica (PASA o ARMS)
Homocigota
normal
Heterocigota
Homocigota
afectado
Taq polimerasa no corrige 3´ 5´ y no elonga si no hay complementaridad
32
c
b
33
34
Mutation
PCR-OLA:
Ensayo de ligación de
oligonucleótidos
T
35
MLPA
Fibrosis quística
36
Multiplex PCR
PCR por Supresión (Broude et al., 2001) fibrosis quística
amplificación alelo específica
37
Primer extension de un
solo nucleótido (SNuPE)
Maldi Toff MS
Hibridación alelo específica
Alteración en sitio de restricción
Amplificación alelo específica (específicidad en el 3´ y competitiva)
SNuPE (primer extensión de un único nucleótido)
Amplificacion de sonda ligada
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A nivel de ADN: Hibridación, PCR, ligación:
Muestra: in situ (localización física), amplificación de ADN de muestra, extracción de ADN, microdisección
con rayo laser.
Técnicas:
Se utilizan para detectar:
Rearreglos cromosómicos
variación en número de cromosomas: FISH, CGH, MLPA
Pérdidas o ganancias cromosomales o de
porciones de cromosomas
Rearreglos cromosomales: FISH
Mutaciones puntuales y polimorfismos
PCR, RT-PCR (algunas translocaciones) Grado de metilación
Ganancia o pérdida de genes: MLPA, CGH
detección de mutaciones conocidas: PCR-OLA (ensayo de
ligación de oligonucleótido, SNuPE (primer extension de un
único nucleótido), OSA (hibridación con oligonucleótidos
específicos), PASA (amplificación alelo específica),
alineamiento competitivo de oligonucleótidos, RFLP, MLPA.
Real time PCR. Microarray, secuenciación
detección de mutaciones desconocidas: Secuenciación,
SSCP, RNAsa, clivaje químico, PCR-DGGE. Real time PCR.
Permiten:
Detección y diagnóstico de desórdenes genéticos que
determinan la enfermedad
Diagnóstico de individuos portadores de mutación
recesiva
Diagnóstico prenatal
Diagnóstico preimplante en fecundación in vitro (PGD).
Mutaciones o alteraciones somáticas: determinación de
la base genética de la enfermedad, diagnóstico,
clasificación de tumores, ERM, prognosis).
Identificación de SNP´s asociados a enfermedades
complejas.
Determinación de grado de metilación de ADN
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