Download Tecnicas para mutaciones puntuales 2014

Técnicas moleculares aplicadas en
Bioquímica Clínica-2014
Dra. María Gabriela Lacoste
Alelle-specific oligonucleotide (ASO)-PCR
PCR con Sondas Alelo Específicas
El análisis de mutaciones puntuales utilizando
la hibridación de sondas ASO se basa en el
principio de que la presencia de UN SOLO
ERROR DE APAREAMIENTO entre un
nucleótido de la sonda y el ADN blanco es
suficiente para desestabilizar el híbrido.
Una de las primeras técnicas utilizadas para
el
análisis
de
mutaciones
puntuales
CONOCIDAS sobre fragmentos amplificados
de ADN.
SONDAS
Oligonucleótidos cortos (15-17 nucleótidos).
30-50% contenido G/C.
El nucleótido discriminante en el medio de la sonda.
Los errores de apareamiento A:A, T:T, C:T y C:A tienen un
efecto más desestabilizante.
Evitar secuencias que contengan polimorfismos cercanos a la
mutación ya que pueden desestabilizar el híbrido.
Marcación
radioactiva o no radioactiva
interna o externa
Marcación Interna
Desplazamiento de mella
Random primers
(nick translation)
Marcación Externa
Polinucleótido quinasa (marcación en
extremo 5’, utiliza γ[32P]-ATP)
Transferasa terminal
(marcación en extremo 3’,
utiliza α [32P]-ATP)
Marcaciones Radioactiva
y No Radioactivas
PCR-ASO
1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.
PCR-ASO
2. Dot Blot: transferencia de los productos amplificados a una
membrana.
El producto de PCR
se
desnaturaliza
(NaOH 2N y 95 °C).
Se añade a los
pocillos donde el
vacío
impulsa
el
pasaje de la solución
a través de la
membrana (nylon o
nitrocelulosa).
La membrana se
seca entre filtros
durante una hora a
80° C en estufa (o
por cross – linker).
PCR-ASO
3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas y
complementarias para la secuencia de interés.
Pre-hibridación: solución de SDS y ADN
de esperma de salmón desnaturalizado.
Bloquea la membrana para evitar
reacciones inespecíficas (2h a 37°C).
Hibridación: sonda normal y mutada (8h
a 37°C).
PCR-ASO
4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada.
5. Interpretación e informe.
Interpretación e informe:
Individuo
Individuo
Individuo
Individuo
Individuo
Individuo
Individuo
Individuo
1: +/- : Heterocigota para la mutación.
2:-/- : No presenta la mutación.
3:+/+: Homocigota para la mutación.
4:+/- : Heterocigota para la mutación.
5:-/- : No presenta la mutación.
6:+/+: Homocigota para la mutación.
7:-/- : No presenta la mutación.
8:+/+: Homocigota para la mutación.
PCR-ASO
Anemia Falciforme
PCR-ASO
Β-Talasemia
1 2 3 4 5 6 7 8
7: control negativo de la PCR
8: control negativo de hibridación (gen de
tiroglobulina)
1: portador de la mutación 1 –1
2: portador de la mutación 1 –1
3: portador de la mutación 1 - 110
4: portador de la mutación 39
5: portador de la mutación 39
6: normal
PCR-ASO es muy útil cuando un gran número de muestras es
examinado para un pequeño número de alelos mutantes.
PCR-ASO necesita de sondas marcadas diferentes para cada alelo y
condiciones de hibridación diferentes para cada sonda.
¿¿Y si necesito analizar múltiples
mutaciones???
PCR-ASOREVERSA
PCR-ASO-REVERSA
1. Inmoviliza la sonda ASO en la membrana (linkers en el extremo 5´).
2. Se hibrida el producto amplificado y marcado por PCR.
Screening de genes con numerosos alelos mutantes : α-talasemia,
β-talasemia y fibrosis cística.
VENTAJAS
La PCR-ASO, en especial el su formato reverso, es una técnica
simple para el genotipaje simultáneo de un gran número de
mutaciones y polimorfismos.
No requiere instrumentos especializados para su realización.
Puede ser aplicado a casi cualquier variación de secuencia
CONOCIDA.
LIMITACIONES
El diseño de sondas que funcionen bajo las mismas condiciones de
astringencia e hibridación puede ser engorroso.
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
La metodología se basa en la posibilidad de introducir mutaciones
puntuales durante la reacción de PCR.
Los cambios de secuencia se eligen de modo que generen sitios de
reconocimiento para enzimas de restricción sólo en un alelo
específico.
La técnica fue introducida por Haliassos et al (1989) en Francia
para la rápida detección de mutaciones en el oncogen ras y fue
aplicada al diagnóstico de fibrosis cística por Friedman et al (1991).
Uno de los problemas que presenta es la posibilidad de falsos
negativos cuando la enzima, por diferentes razones, no corta
(controles).
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Mutación ΔF508 en el gen del CFTR
Utiliza un cebador 5’ con un cambio puntual en una base que limita
con la mutación ∆F508.
Este cambio introduce un sitio para la enzima Mbol (5’GATC3’) en el
alelo sano, pero no aparece en el alelo con la deleción ∆F508 por no
completarse la secuencia de corte.
Para el extremo 3’ se buscó un cebador que permitiera abarcar en el
producto de amplificación un sitio de corte constitutivo para que
sirviera como control interno de la actividad de la enzima de
restricción.
MboI
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Sin MboI
Normal: 262 pb
Mutado: 259 pb
Con MboI
Normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb
Mutado: 215 pb y 44 pb
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Sin corte con la enzima de restricción
Normal: 262 pb
Mutado: 259 pb
El tamaño del gel y las condiciones de corrida no son suficientes para detectar esta
pequeña diferencia.
Heterodúplex: formados por la hibridación de una hebra sana y una mutada durante la PCR.
La falta de una adecuada complementariedad de bases debido a la deleción hace que los
heterodúplex migren con dificultad en los geles.
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Con corte con la enzima de restricción
Normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb
Mutado: 215 pb y 44 pb
Los heterodúplex no presentan sitio de corte para Mbol en la hebra con la delección, por lo
tanto no son cortados y migran por encima del homodúplex
Multiplex Allele Specific-PCR
PCR Multiplex Alelo Específica
MAS-PCR
Es la amplificación, en un único tubo, de múltiples fragmentos de
una determinada secuencia.
Elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a
fragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmente
resueltos en una única línea de corrida de un gel.
Los primers usados son alelo-específicos.
Distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, β-talasemia y
fibrosis cística
MAS-PCR
Detección de ΔF508 y G542X
MAS-PCR
Master Mix NORMAL
2 REACCIONES
Master Mix MUTADA
Primers:
Forward: CF-W1468-N
Reverse: CF-508 RP
Primers:
Forward: Δ508
Reverse: CF-508 RP
Forward:5´IVS-11
Reverse:G542X-N
Forward:5´IVS-11
Reverse:G542X-M
20 μl Master
Mix
5 μl ADN
MAS-PCR
WT (139 pb), ΔF508 (136 pb) y G542X (174 pb)
Análisis del gen de la distrofina por PCR multiplex, detección de
deleciones. Los números superiores corresponden a cada pacientes. Los
números de la derecha corresponden a los exones amplificados. N: Control
normal con todos los exones. Paciente 2 presenta deleciones en los exones
50 y 52. Paciente 1 presenta deleciones en los exones 50, 47 y 52.
Paciente 10 presenta deleción en el promotor Pm. Paciente 7 presenta
deleción en el exón 52. Paciente 4 presenta deleción en los exones 3 y 6.
Paciente 5 presenta deleción en los exones 43, 13 y 47.
Amplification Refractory Mutation System-PCR
Sistema de Mutación Refractario a la
Amplificación por PCR
ARMS-PCR
Detección de mutaciones puntuales.
Fundamento: la amplificación del ADN será ineficiente o completamente
refractaria si hay un error de apareamiento (mismatch) entre el nucleótido
del extremo terminal 3´ del cebador y su correspondiente nucleótido en
ADN molde.
Se requiere un apareamiento de bases complementario en el extremo 3´
del cebador para que la Taq ADN polimerasa pueda amplificar
eficientemente el fragmento de ADN deseado, permitiendo mayor
especificidad y discriminación por parte de la enzima.
ARMS-PCR
El alelo deseado es amplificado fácilmente mientras que el otro no es
amplificado o lo es escasamente.
Para incrementar la especificidad se introduce en ellos un cambio de una
base adicional en el segundo al cuarto (2º-4º) nucleótido del extremo 3’, de
este modo se asegura que cada cebador permita únicamente la amplificación
del alelo para el que su nucleótido 3’ terminal es complementario.
ARMS-PCR
Master Mix 1
Cebador alelo específico N
Cebador común
2 REACCIONES
Master Mix 2
Cebador alelo específico M
Cebador común
Puede utilizarse también un par de primers control, que amplifican un
segmento de ADN diferente, no relacionado a la mutación buscada y que no
interfiera con la amplificación del segmento de interés.
ARMS-PCR
control
ARMS-PCR
Genotipificación de ApoE
Cebadores Alelo
Específicos
Cebador común
Cebador control
interno
2 REACCIONES
Cebadores Alelo Específicos
Cebador común
Cebador control interno
ARMS-PCR
Genotipificación de ApoE
E2: Cys112 y Cys158
E3: Cys112 y Arg 158
E4: Arg112 y Arg 158
ARMS-PCR
VENTAJAS:
Relativamente sencillo, rápido y confiable.
No requiere equipo especial (sólo termociclador).
Distingue entre heterocigotos y homocigotos.
No requiere digestión ni secuenciación.
Análisis mediante
poliacrilamida.
electroforesis
en
geles
de
agarosa
o
Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)
Paso a Paso:
1. Seleccionar la secuencia de interés
2. Seleccionar y diseñar los cebadores
-Fragmentos de diferente tamaño
-Cebadores
T°annealing).
con
características
similares
(contenido
GC,
tamaño,
3. Desarrollar la PCR con cada fragmento por separado
-Concentraciones equimolares de los cebadores.
4. Adicionar los cebadores secuencialmente
Ajustar las concentraciones de los cebadores (0,04-0,6 µM).
-El amplicón más corto suele amplificarse preferencialmente.
-Si la intensidad del amplicón es débil, aumentar el primer y si es muy
fuerte, disminuirlo.
-Concentraciones muy bajas disminuyen el rendimiento y muy altas,
aumentan la inespecificidad.
Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)
Paso a Paso:
6. Ajustar los componentes de la reacción
-Mg2+ (1-2 mM) concentraciones bajas disminuyen el rendimiento y
concentraciones altas aumentan la especificidad y los errores de
incorporación.
-dNTPs (200-400 µM) concentraciones más bajas aumentan la fidelidad y
la especificidad, pero disminuye el rendimiento.
-Taq
-Cantidad de ADN molde: mucho ADN causa productos inespecíficos o
inhibición de la PCR y poco ADN, bajo rendimiento.
Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)
6. Ajustar los componentes de la reacción
-Tiempos: extensión se puede aumentar para completar la síntesis de
todos los fragmentos.
annealing se puede acortar para aumentar la especificidad.
-Temperatura annealing: temperaturas altas son más específicas pero
pueden disminuir el rendimiento
temperaturas bajas producen
inespecíficos por apareamiento inespecífico de los cebadores.
-Ciclos: 28-30
-Aditivos: DMSO, Tritón X-100 (disminuye inespecíficos)
productos
CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD
DISMINUIR
Mg2+
[dNTPs]
Tiempo de los ciclos
Número de ciclos
[primer]
AUMENTAR
T° annealing