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 Patología Molecular
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
La FISH es una tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluoróforo para
detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá de
la capacidad de resolución de la citogenética de rutina. La señal emitida por la sonda se
observa mediante un microscopio de fluorescencia y así la muestra de DNA se puede clasificar
según la presencia o ausencia de la señal. El FISH sobre células en interfase se utiliza para
determinar el número de copias de uno o varios cromosomas, así como para detectar algunas
reorganizaciones específicas que son características de ciertos tipos de cáncer. Su ventaja
principal es que no requiere cultivo celular, por lo que se puede realizar en 24 horas si es
preciso.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
La técnica de PCR se basa en la amplificación de material genético (ADN o ARN) mediante la
utilización de polimerasas y ciclos de calor. El producto amplificado por PCR convencional se
visualiza mediante técnicas de electroforesis (agarosa o acrilamida). Otras técnicas basadas en
la reacción en cadena de la polimerasa son:
PCR Cuantitativa o a Tiempo Real (RQ-PCR)
La RQ-PCR utiliza además moléculas de fluorocromos para poder monitorizar paso a paso y de
manera cuantificable el proceso de amplificación de un segmento específico de ADN.
Entre otras muchas aplicaciones, mediante la RQ-PCR podemos analizar la presencia o
ausencia de un determinado gen de fusión (originado como consecuencia de una translocación
cromosómica), así como determinar el número exacto de copias de dicho gen presentes en la
muestra de un paciente.
La PCR cuantitativa es una técnica de gran sensibilidad ya que es capaz de detectar una célula
maligna entre 100.000 células, lo que permite realizar estudios de enfermedad mínima residual
(EMR) en pacientes con distintos tipos de leucemia.
PCR Alelo Específica (ASO-PCR)
La PCR Alelo Especifica (ASO-PCR) es un sistema de PCR que utiliza cebadores o “primers”
específicos de forma que permite amplificar exclusivamente un alelo concreto y no el resto de
alelos posibles. De este modo tendremos solamente producto amplificado en el caso de que
exista una mutación concreta en el ADN del paciente.
Utilizando esta variante de la PCR convencional conseguimos aumentar la sensibilidad, lo que
permite detectar mutaciones que están poco representadas en la muestra problema.
PCR marcada con fluorescencia y electroforesis capilar
Esta PCR utiliza cebadores (“primers”) específicos marcados con fluorocromos para poder
detectar la amplificación de un segmento específico de ADN utilizando un analizador
automático. Estos analizadores, basados en electroforesis capilar y detección inducida por
láser, permiten realizar análisis genéticos utilizando fluorescencia para detectar los fragmentos
generados.
Secuenciación automática
La secuenciación es una técnica que permite descifrar la composición y el orden de los
nucleótidos, es decir, la secuencia de una determinada molécula o fragmento de ADN.
La secuenciación del ADN utilizando equipos automáticos se basa en la detección de
fluorescencia en cadenas de ADN (marcadas en los extremos 3'-OH con dideoxinucleótidos
biotinilados) que se separan mediante electroforesis capilar.
El análisis de la secuencia del ADN permite identificar polimorfismos y mutaciones puntuales
como inserciones, deleciones o sustituciones de una o varias bases nucleotídicas, asociadas a
diferentes tipos de tumores.