Download El código oculto de la oxidación

Concepto y fotografía: Omar Gaona,Gimnasio Campestre
28
El Astrolabio
El código
oculto de
la oxidación
29
ARTÍCULO
oRIGINAL
AISLAMIENTO Y SECUENCIACIÓN
DE LA REGIÓN 5´ DE UN GEN
QUE CODIFICA UNA POLIFENOL OXIDASA (PPO)
EN TOMATE DE ÁRBOL
(Solanum betaceum (Cav.) Sendtn.)
Sebastián Ortegón Obando 1 y Mauricio Pulido Jiménez 2
1.Estudiante 11º grado - Investigador CEBM, Gimnasio Campestre.
2. Director CEBM, Gimnasio Campestre.
Correspondencia para el autor: [email protected]
Recibido: 1 de abril de 2011
Aprobado: 29 de abril de 2011
RESUMEN
SUMMARY
Reportamos el aislamiento de la región
5´ de un gen que codifica una polifenol
oxidasa (PPO) de hojas de tomate de
árbol y su secuencia de nucleótidos.
El contenido de guaninas-citosinas del
fragmento es 42.29%, valor que se encuentra dentro del rango que ha sido
determinado para los genes ppo de papa
y tomate. Un fragmento de proteína de
157 aminoácidos se dedujo a partir de
la secuencia nucleotídica determinada.
La secuencia caracterizada muestra similitudes superiores a 80% y 81% a nivel
de nucleótidos y aminoácidos respectivamente con genes y proteínas PPO de
berenjena, papa, tomate, lulo y tabaco.
We report the isolation of 5´ gene region
encoding polyphenol oxidase (PPO) from
tree tomato leaves and their nucleotide
sequence. The guanine-citosine fragment
content is 42.29%, value found within
the rank determined for potato and tomato ppo genes. A protein fragment of
157 amino acids was deduced from the
nucleotide sequence. The characterized
sequence shows similarities upper to 80%
and 81% at nucleotide and amino acid
levels respectively with genes and PPO
proteins from eggplant, potato, tomato,
lulo and tobacco.
Palabras clave: pardeamiento enzimático, polifenol oxidasa, Solanum betaceum, silencia-
miento de genes, RNA antisentido.
Key words: enzymatic browning, polyphenol oxidase, Solanum be
taceum, gene silencing, antisense RNA.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
30
INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol (Solanum betaceum
(Cav.) Sendtn.), perteneciente a la
familia Solanaceae (así como la papa,
el tomate, el tabaco y la uchuva) es una
especie frutal originaria de los Andes
de Colombia, Perú y Ecuador (Heiser,
1985) que comenzó a ser considerada
como promisoria para la exportación a
los mercados de Europa y Estados Unidos
a partir de la década de los 70. Sin
embargo en Colombia la productividad
del cultivo alcanza niveles que están
por debajo del rendimiento potencial
debido a la baja oferta tecnológica
disponible para la especie y a que los
esfuerzos de investigación y fomento se
han canalizado a cultivos tradicionales
relacionados con la seguridad alimentaria
del país, la industria y la generación de
divisas. En 2009 la superficie cultivada
con tomate de árbol en Colombia fue de
7.281 hectáreas, con una producción de
130.400 toneladas y un rendimiento de
17,9 toneladas/hectárea. Actualmente
el área cultivada y la producción crecen
a una tasa promedio anual de 2.9% y 3%
respectivamente. Excluyendo plátano
y banano, en 2010 el tomate de árbol
se constituyó en el séptimo producto
frutícola colombiano de exportación (297
toneladas) después de la uchuva (4.254
ton.), el banano bocadillo (3.855 ton.),
la granadilla (706 ton.) y la pitahaya (326
ton.) (Agronet, 2011). De otro lado, la
comercialización de aproximadamente
el 50% de la producción nacional se ve
considerablemente afectada por los
daños ocasionados por un fenómeno
cuyas características son muy similares
a las del pardeamiento enzimático.
Este evento bioquímico, también conocido como oxidación biológica, es el
principal causante del deterioro de caEl Astrolabio
racterísticas como color, sabor y aroma
en la gran mayoría de frutas y verduras
de importancia agrícola y económica,
hecho que limita de manera significativa
la posibilidad de comercialización del
producto, ya sea para el consumo en
fresco o para el procesamiento industrial
(McEvily, et al., 1992). El fenómeno es
provocado por la actividad de una familia
de enzimas denominadas polifenol oxidasas (PPO) que están confinadas dentro
de los plastidios de las células vegetales
y se liberan al citoplasma una vez se ha
producido daño en la estructura celular
de los tejidos, como consecuencia del
impacto mecánico ocasionado durante la
recolección de la cosecha y la manipulación poscosecha de los frutos (Vaughn
y Duke, 1981, Vaughn, et al., 1988). El
método más ampliamente utilizado para
controlar el pardeamiento enzimático es
la adición de agentes químicos antioxidantes tales como los sulfitos (Martínez y
Whitaker, 1995). Sin embargo, recientes
estudios efectuados por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados
Unidos (FDA) han demostrado que dichas
sustancias representan un riesgo considerable para la salud humana (Timbo,
et al., 2004). Por tal razón, la búsqueda
de alternativas de naturaleza biotecnológica a éste problema ha cobrado gran
importancia a nivel mundial. Para implementar una de tales opciones, conocida
como silenciamiento de genes mediante
RNA antisentido, se requiere aislar un gen
o parte de un gen ppo.
Puesto que en las especies vegetales
económicamente importantes en las
que se observa este hecho se han encontrado genes que codifican proteínas
PPO (Newman, et al., 1993, Thygesen,
et al., 1995, Goldman, et al., 1998), se
presume que la alteración anteriormente
referida en tomate de árbol es pardeamiento enzimático. Sin embargo, no hay
31
evidencias de la presencia de genes ppo
en la especie. En este trabajo se reporta
el aislamiento y caracterización molecular de un fragmento de gen que codifica
una PPO en tomate de árbol.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: El tejido empleado en
el estudio se obtuvo de plantas de tomate de árbol (Solanum betaceum (Cav.)
Sendtn.) y papa (Solanum tuberosum
L., var. Millenia). Semillas de tomate de
árbol provenientes de los bancos de germoplasma de CORPOICA se sembraron en
macetas con turba como sustrato; tanto
la germinación de las semillas como el
desarrollo de las plántulas se dieron bajo
condiciones de invernadero. El material
vegetal de papa se colectó de plantas
pertenecientes a la Colección Central
Colombiana que se encontraban en el
campo.
Cultivo de Escherichia coli cepa DH5α:
La bacteria se cultivó en medio LuriaBertani (LB) líquido a 37 oC y agitación
(250 r.p.m.) durante 8 horas.
Extracción y purificación de DNA genómico de tomate de árbol, papa y E. coli:
El DNA genómico de tomate de árbol y
papa se aisló a partir de hojas jóvenes,
empleando el protocolo reportado por
Doyle y Doyle (1990). El DNA genómico de
E. coli se extrajo utilizando el procedimiento reportado por Chen y Kuo (1993).
Evaluación de la integridad y cuantificación de los DNAs genómicos: Alícuotas
de los DNAs y del marcador de masa molecular High DNA Mass Ladder (Invitrogen,
USA) fueron sometidas a electroforesis
en gel de agarosa 1%. El gel se fotografió
y la imagen se analizó con el programa
GeneTools (Syngene, USA).
Diseño de los iniciadores para PCR: Las
secuencias nucleotídicas de los genes
ppo previamente reportadas en tomate,
papa, tabaco, batata, durazno, manzana, pera y haba se alinearon utilizando el
programa Clustal X versión 2.0.9 (Larkin
et al., 2007), con el fin de identificar la
región hacia el extremo 5´ que mostrara
el mayor grado de conservación posible.
Una vez determinada dicha región, se
utilizaron el gen ppo-F de tomate (como
gen de referencia) y el programa Oligo
versión 6.71 (Rychlik y Rhoads, 1989;
Rychlik, et al., 1990) (Molecular Biology Insights, Inc., USA) para diseñar los
iniciadores que permitieran amplificar
un fragmento de aproximadamente 950
pares de bases (pb.) a partir de DNA
genómico de tomate de árbol. La especificidad del posicionamiento de los
iniciadores sobre la región seleccionada
se verificó analizándolos con el programa
BLAST (Altschul, et al., 1990).
Amplificación por PCR de un fragmento
del gen ppo de tomate de árbol: Para
determinar las condiciones óptimas que
permitieran la amplificación de un fragmento ubicado hacia el extremo 5´ del
gen ppo de tomate de árbol se ensayaron
diversas concentraciones de iniciadores,
cloruro de magnesio (MgCl2) y DNA; de
otro lado se evaluaron programas de
amplificación con diferentes temperaturas de anillaje y períodos de extensión.
Una vez estandarizadas las condiciones
de amplificación, el producto de PCR
se sometió a electroforesis en gel de
agarosa 1% para verificar su tamaño y la
especificidad de la amplificación.
Purificación y cuantificación del fragmento amplificado: El fragmento amplificado por PCR fue purificado empleando
el sistema Wizard SV Gel and PCR CleanUp System (Promega, USA). La concentraInvestigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
32
ción del mismo se determinó utilizando
el método descrito anteriormente.
Secuenciación del fragmento aislado:
La secuencia de nucleótidos del
fragmento aislado se obtuvo empleando
el método de terminación de cadena con
dideoxinucleótidos (Sanger, et al., 1977)
y los mismos iniciadores diseñados para
producirlo (SupPPO-F y SupPPO-L). El
fragmento se secuenció dos veces por
cada extremo con el fin de confirmar las
secuencias logradas.
Secuencia consenso del fragmento
aislado: Las secuencias correspondientes tanto a la cadena positiva como a la
negativa del fragmento aislado fueron
alineadas empleando el programa CodonCode Aligner versión 2.0.4 (CodonCode
Corporation, USA) para generar una secuencia consenso definitiva.
Identificación de marcos de lectura
abiertos en el fragmento secuenciado:
Para identificar los posibles marcos de
lectura abiertos en el fragmento aislado
se utilizó el programa ORF Finder (NCBI,
USA).
Análisis de similitud con genes y proteínas PPO previamente reportadas: La
secuencia de nucleótidos consenso y la
secuencia de aminoácidos derivada de
la primera fueron comparadas con las
bases de datos empleando el programa
BLAST con el fin de determinar el grado
de similitud de éstas respecto a los genes
y proteínas PPO previamente reportados
en otras especies.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Iniciadores para PCR
Los trabajos sobre la estructura de los
genes ppo en papa (Hunt, et al., 1993)
y tomate (Newman, et al., 1993) han
señalado que el tamaño de estos oscila
entre 1300 y 1900 pb. y que las secuencias que flanquean los extremos 5´y 3´
muestran un alto grado de divergencia
incluso entre genes pertenecientes a
la misma especie. Considerando la variabilidad existente en los extremos de
la región que se pretendía amplificar y
buscando iniciadores cuyas características permitieran un posicionamiento
altamente específico en los sitios previamente determinados, se diseñaron
oligonucleótidos con degeneración en
varias posiciones.
Para amplificar por PCR el fragmento de
DNA localizado hacia el extremo 5´ del
gen ppo de tomate de árbol se diseñaron los iniciadores SupPPO-F (directo)
(5’ CTCCTAYWCCAYCYCCTGATCT 3’) y
SupPPO-L (reverso) (5’ AGAAYTCNGAGTTCAACCAATC 3’). Las características de los
iniciadores diseñados se muestran en la
tabla 1. Teniendo en cuenta las particularidades de los genes ppo anteriormente
referidas, el iniciador directo SupPPO-F
fue diseñado para que se posicionara
aproximadamente a 260 pb. del sitio de
Iniciador
Longitud (pb.)
Posición degenerada
% G-C
Tm (oC)
SupPPO-F
22
nucleótidos 7, 8, 12 y 14
45.5
66.6
SupPPO-L
22
nucleótidos 5 y 8
36.4
65.2
Tabla 1. Características de los iniciadores diseñados para amplificar un fragmento ubicado hacia el extremo 5´ del gen ppo de
tomate de árbol.
El Astrolabio
33
Especie
Gen
Tamaño Gen
(pb.)
Lugar posicionamiento
iniciadores
Tamaño producto PCR
(pb.)
Tomate
ppo-A
1893
263 - 1180
939
Tomate
ppo-B
1791
263 - 1183
942
Tomate
ppo-C
1881
251 - 1168
939
Tomate
ppo-D
1776
251 - 1168
939
Tomate
ppo-E
1764
263 - 1159
918
Tomate
ppo-F
1758
260 - 1153
915
Papa
ppo-POT 32
1794
242 - 1186
966
Papa
ppo-POT 33
1800
272 - 1192
942
Papa
ppo-A
1752
251 - 1147
918
Papa
ppo-B
1767
266 - 1162
918
Tabaco
ppo
1781
271 - 1176
927
Tabla 2. Sitios de posicionamiento de los iniciadores diseñados para este estudio sobre genes ppo de diferentes especies y
tamaño de los productos de PCR que permiten generar.
inicio de la secuencia codificante.
El análisis BLAST hecho para los dos iniciadores diseñados permitió determinar
las posiciones en las cuales estos se ubican en los genes ppo de otras especies
y el tamaño del producto de PCR que
permiten obtener (Tabla 2).
Los resultados del anterior análisis demuestran que los sitios en los cuales
se posicionan los dos iniciadores varían
incluso en los genes ppo de la misma
especie; ello implica que la longitud de
los fragmentos que se pueden amplificar
con estos iniciadores también presenta
diferencias. Aunque el tamaño de los
genes ppo oscila entre 1300 y 1900 pb. y
muestran un nivel considerable de divergencia en la secuencia de la región 5´ el
análisis muestra que también presentan
variaciones en otras regiones. De otro
lado, el hecho que los iniciadores diseñados para este estudio encuentren en el
DNA de tomate, papa y tabaco secuencias
pertenecientes a genes ppo sobre las
cuales puedan posicionarse de manera
muy específica demuestra que el método
utilizado para el diseño de éstos es muy
efectivo. De todo lo anterior se deriva
que el uso de esta pareja de iniciadores
sobre los genomas de tomate de árbol
y otras especies vegetales garantiza la
amplificación exclusiva de fragmentos
correspondientes a genes ppo.
Amplificación del fragmento correspondiente al gen ppo de tomate de árbol
Los análisis de PCR virtual realizados con
el programa Oligo 6.71 permitieron establecer que el tamaño del producto de
amplificación debía estar entre 915 y 960
pb. Los iniciadores SupPPO-F y SupPPO-L
permitieron amplificar un fragmento
de aproximadamente 950 pb. (Figura 1)
a partir de los genomas de tomate de
árbol y papa. Después de evaluar diferentes concentraciones de magnesio con
el fin de optimizar la amplificación del
fragmento, se determinó que el valor
óptimo era 3.8 mM. Los ensayos de estandarización de la temperatura de anillaje
cubrieron el rango entre 60 y 68 oC. Los
mejores resultados se obtuvieron utilizando
65 oC. Las condiciones de reacción óptimas bajo las cuales se logró amplificar el
fragmento se presentan en la tabla 3. El
programa de ciclaje utilizado se presenta
en la tabla 4.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
34
1
2
3
4
5
950pb.
1000 pb.
Figura 1. Productos de amplificación por PCR de 950 pb. correspondientes a genes ppo. Línea 1: blanco; Línea 2: genoma de
E. coli (control negativo); Línea 3: genoma de papa; Línea 4: genoma de tomate de árbol; Línea 5: marcador de peso molecular.
Reactivo
Concentración Inicial
Concentración Final
Volumen/Reacción
-
-
8.76 μL
5X
1X
5.00 μL
MgCl2
25 mM
3.8 mM
3.80 μL
dNTP’s
2.5 mM
0.2 mM
2.0 μL
Iniciador SupPPO-F
10 μM
0.25 μM
0.62 μL
Iniciador SupPPO-L
10 μM
0.25 μM
0.62 μL
-
-
4.00 μL
5 U/μL
-
0.20 μL
H 2O
Buffer PCR
DNA (dil 1:10)
Taq Polimerasa
Volumen final
25.0 μL
Tabla 3. Condiciones de reacción utilizadas en la amplificación por PCR del fragmento de 950 pb. del gen ppo a partir de DNA
genómico de tomate de árbol.
Etapa
Denaturación Inicial
Temperatura / Tiempo
Número de Ciclos
94 C X 4 min.
1
o
Amplificación
45
Denaturación
94 oC X 1 min.
Anillaje
65 oC X 45 seg.
Extensión
72 oC X 75 seg.
Extensión final
72 oC X 7 min.
1
Tabla 4. Programa de ciclaje utilizado en la amplificación por PCR del fragmento de 950 pb. del gen ppo a partir de DNA genómico de tomate de árbol.
Secuencia del fragmento de gen ppo de
tomate de árbol
El método de terminación de cadena con
dideoxinucleótidos permitió determinar
una secuencia de 551 nucleótidos (Figura 2). La diferencia observada entre el
tamaño del fragmento amplificado por PCR
(950 pb. aprox.) y el resultado arrojado
El Astrolabio
por el procedimiento de secuenciación
(551 pb.) obedece a que la técnica no
logra resolver eficientemente los nucleótidos de los extremos de las cadenas de
DNA que se producen durante la reacción
de secuencia. La longitud total de las
dos regiones que no se identificaron con
claridad es de aproximadamente 200
nucleótidos.
35
ATCTCTCATCTTGTAGTAGAGCCAAGATTACTGAAACTGAGGAGGTGTCATACAGTTGTTG
CGCTCCCAGGCCCGATGATTTGAATAAAGTTCCATATTACAAGTTCCCTTCTATGACTAAGCTC
CGTATTCGTCAGCCTGCTCATGCTGCTGATGAGGAGTATATTGCCAAGTACAATTTGGCTATTA
GCAAAATGAAAGATGTTGATAAGACGCAACCTTCAAACCCTATTGGCTTCAAGCAACAAG
CCAATATACATTGTGCTTATTGTAACGGTGCTTACGTAATTGATGGCAAAGTGTTACAAGTTC
ATAACTCATGGCTTTTCTTCCCGTTCCATAGATGGTACATGTACTTCTATGAGAGAATCTTG
GGATCACTCATCGATGACCAACTTTCGCTTTGCCATACTGGAATTGGGACCATCCAAAGGGC
ATGCGTTTTCCTCCAATGTTCCATCGTAAAGGCTCTGCCCTTTACGACAAAAGACGTAATCA
GGAAATTCCATAATGGAACCGTAATGGATCCTTGGTTCTTTCGGACACCAAAC
Figura 2. Secuencia de nucleótidos correspondiente al fragmento del gen ppo identificado en tomate de árbol (551 pb).
Especie
Gen
Tamaño gen (pb.)
Adenina
Citosina
Guanina
Timina
% G+C
Tom. Árbol
ppo
551
155
123
110
163
42.29
Tomate
ppo A
1893
530
379
420
564
42.20
Tomate
ppo B
1791
519
370
399
503
42.94
Tomate
ppo C
1881
529
365
437
550
42.63
Tomate
ppo D
1776
513
366
409
488
43.64
Tomate
ppo E
1764
498
379
374
513
42.69
Tomate
ppo F
1758
491
365
382
520
42.49
Papa
pot 32
1794
517
366
401
510
42.75
Papa
pot 33
1800
537
376
377
510
41.83
Papa
pSP32
1325
375
251
311
388
42.41
Papa
ppo A
1752
501
367
378
506
42.52
Papa
ppo B
1767
507
367
377
516
42.10
Papa
pSRP33
1315
391
251
297
376
41.67
Tabaco
ppo
1781
491
409
389
492
44.80
Batata
ppo
1767
420
523
475
349
56.48
Batata
ppo -1
1767
419
525
478
345
56.76
Durazno
ppo
1794
485
512
437
360
52.90
Pera
ppo
1359
350
351
367
291
52.83
Haba
ppo -1
1821
602
353
338
528
37.94
Manzana
ppo -1
1782
463
462
475
382
52.58
Manzana
ppo -2
1782
462
472
459
389
52.24
Tabla 5. Contenido de nucleótidos y porcentaje de guaninas y citocinas (%GC) en genes ppo de especies económicamente importantes pertenecientes a las familias Solanaceae, Rosaceae y Fabaceae.
El fragmento de 551 pares de bases está
constituido por 155 adeninas (28.13%),
123 citosinas (22.32%), 110 guaninas
(19.96%) y 163 timinas (29.58%). El contenido de guaninas-citosinas (%GC) de
este fragmento es 42.29%, valor que se
encuentra dentro del rango que ha sido
determinado previamente para los genes
de solanáceas como papa y tomate, que
oscila entre 40% y 45% (Rensink, et al.,
2005). El %GC específico para genes que
codifican PPO (Tabla 5) en tomate y papa
oscila entre 41.67% y 43.64%; en tabaco
es 44.80%, levemente superior al mostrado en las dos especies anteriores, y
para el caso de manzana, pera, durazno
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
36
y batata (las tres primeras pertenecientes a la familia Rosaceae y la última a
la familia Convolvulaceae) los valores
se encuentran entre 52.24 y 56.48%
respectivamente. El valor más bajo encontrado en la comparación corresponde
a haba (37.94%), especie perteneciente
a la familia Fabaceae. El alineamiento
de los genes ppo de tomate y papa con
el segmento de 551 pb. identificado
en tomate de árbol, permitió precisar
que hacia el extremo 5´ de éste hay un
fragmento de aproximadamente 280 pb.
cuya secuencia aún está por determinar.
Este hecho coincide con lo presupuestado
inicialmente en el diseño del iniciador
directo. La diferencia observada puede
ser la consecuencia de la inserción en
el fragmento de tomate de árbol o la
deleción en los genes de tomate y papa
de aproximadamente 20 pb.; todo ello
concuerda con las observaciones sobre la
notable variabilidad de la secuencia de
los genes ppo en esta región (Newman,
et al., 1993).
La comparación de la secuencia de 551 pb.
encontrada en tomate de árbol con los
genes ppo de otras especies reveló valores de identidad elevados no sólo con
los genes de especies pertenecientes a
la familia Solanaceae, sino con los de familias filogenéticamente distantes (Tabla
6). El porcentaje de identidad que arrojó
el análisis BLAST, definido como el grado
de invariabilidad que presentan dos secuencias (de nucleótidos o proteínas) al
ser comparadas, puede ser asumido como
una medida de la similitud existente entre las mismas (Altschul, et al., 1990).
El grado de similitud existente entre la
secuencia encontrada en tomate de árbol y los genes ppo-A, ppo-B y ppo-D de
tomate, ppo-1 de berenjena y los alelos
POT32 y POT33 de papa osciló entre 84%
y 88%, mientras que con los genes ppo de
tabaco y lulo fue de 80%. Con respecto
El Astrolabio
a los genes ppo-E y ppo-F de tomate,
ppo-A y ppo-B de papa y el de caqui
(Diospyros kaki L.), especie frutal de la
familia Ebenaceae, la similitud estuvo
en el rango entre 76% y 78%. El análisis
de alineamiento de secuencias reveló
además valores de identidad entre 70%
y 75% con genes ppo de especies pertenecientes a las familias Fabaceae como
haba y alfalfa (Sullivan, et al., 2004),
Rosaceae como albaricoque (Chevalier,
et al.,1999), ciruela del Japón y penacho de apache, Papaveraceae como la
adormidera, Salicaceae como el álamo
de California, Euphorbiaceae como el
ricino y Zygophyllaceae como el chaparro. En esta última especie el gen ppo
codifica una polifenol oxidasa que cumple un papel central en la biosíntesis de
lignanos (metabolitos secundarios de las
plantas), sustancias polifenólicas cuyos
representantes, tales como el ácido
nordihidroguaiarético y sus congéneres
tienen potentes propiedades antivirales,
anticancerígenas y antioxidantes (Cho,
et al., 2003).
En la tabla 6 se observa que los valores
E arrojados por el análisis BLAST se presentan en orden numérico ascendente
mientras que los porcentajes de identidad se muestran en aparente desorden.
Ello responde a que el valor E representa
el número de alineamientos que se puede
esperar que ocurran por azar entre la
secuencia en estudio y cualquiera otra
de las existentes en la base de datos.
Por lo tanto, entre más cercano a cero
sea el valor E, más significativo es el
alineamiento entre la secuencia que
se analiza y la secuencia relacionada
(Altschul, et al., 1990). Los valores E
más bajos que arrojó la comparación de
la secuencia estudiada con la base de
datos de genes correspondieron a los alineamientos con los genes ppo reportados
37
Descripción del gen
Valor E
% Identidad
0.0
88%
ppo alelo POT32 papa (Solanum tuberosum)
1e-153
85%
ppo-A tomate (Solanum lycopersicum)
4e-150
84%
ppo-1 berenjena (Solanum melongena) ppo-C tomate (Solanum lycopersicum)
2e-148
73%
ppo alelo POT33 papa (Solanum tuberosum)
1e-145
87%
ppo-D tomate (Solanum lycopersicum)
1e-140
84%
Precursor ppo-1 berenjena (Solanum melongena)
1e-139
86%
ppo tabaco (Nicotiana tabacum)
1e-131
80%
ppo-B tomate (Solanum lycopersicum)
1e-125
85%
5e-110
78%
3e-107
76%
3e-107
76%
ppo-E tomate (Solanum lycopersicum)
1e-104
78%
ppo-F tomate (Solanum lycopersicum)
7e-102
77%
ppo-A papa (Solanum tuberosum)
ppo-B papa (Solanum tuberosum)
ppo caqui (Diospyros kaki) ppo lulo (Solanum quitoense)
1e-100
80%
ppo-3 álamo de California (Populus trichocarpa)
5e-28
75%
ppo ricino (Ricinus communis)
1e-23
74%
ppo penacho de apache (Fallugia paradoxa)
1e-23
70%
ppo chaparro (Larrea tridentata)
4e-23
72%
ppo adormidera (Papaver somniferum)
1e-22
73%
ppo (Medicago truncatula)
1e-22
72%
ppo ciruela del Japón (Prunus salicina)
6e-21
73%
6e-21
73%
ppo alfalfa (Medicago sativa)
2e-20
73%
ppo haba (Vicia faba)
7e-20
70%
ppo albaricoque (Prunus armeniaca)
Tabla 6. Valores de identidad entre la secuencia de 551 pb. identificada en tomate de árbol y genes ppo reportados en otras
especies.
LNKVPYYKFPSMTKLRIRQPAHAADEEYIAKYNLAISKMKDVDKTQPSNPIGFKQQANIHCAYCNGAYVI
DGKVLQVHNSWLFFPFHRWYMYFYERILGSLIDDQLSLCHTGIGTIQRACVFLQCSIVKALPFTTKDVIRK
FHNGTVMDPWFFRTPN
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir del fragmento de 551 pb. identificado en tomate de árbol.
en berenjena, papa y tomate, especies
cercanamente relacionadas con tomate
de árbol; sin embargo, llama la atención
que se presente un valor E bastante bajo
frente al caqui, especie perteneciente a
una familia que hace parte del orden de
las Ericales, filogenéticamente distante
de las solanáceas.
El programa ORF Finder permitió determinar que dentro de la secuencia
nucleotídica identificada hay un marco
de lectura abierto de 471 nucleótidos
en la cadena positiva, que se inicia en
la posición 81 y se extiende hasta la posición 550. La proteína deducida tiene
157 aminoácidos (Figura 3).
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
38
El análisis BLAST para la secuencia de
aminoácidos deducida del fragmento
de 551 pb. reveló valores de similitud
que oscilan entre 82 y 89% con la gran
mayoría de las proteínas PPO de tomate,
berenjena y papa y del 78% con las
presentes en lulo y tabaco (Tabla 7). Tal
como en el análisis de la secuencia de
nucleótidos, el fragmento de proteína
hipotética de tomate de árbol muestra
niveles de similitud inferiores al 65% con
las PPO de especies pertenecientes a las
familias Rosaceae, Fabaceae y Salicaceae.
Ello responde a la distancia filogenética
que hay entre la familia Solanaceae
y las tres familias antes referidas,
pertenecientes a los órdenes Rosales,
Fabales y Malpighiales respectivamente.
Estos tres órdenes están mucho más
relacionados entre sí que cualquiera
de ellos con el orden Solanales, el cual
incluye a la familia Solanaceae. Aunque
especies como tabaco, tomate de árbol,
papa, berenjena, tomate común y lulo
pertenecen a la familia Solanaceae, la
primera hace parte del género Nicotiana
mientras que las demás se encuentran
incluidas en el género Solanum. Lo
anterior explica que el porcentaje de
identidad entre tomate de árbol y tabaco
sea menor que el encontrado entre
tomate de árbol y los otros miembros
de la familia.
La notable cercanía entre el fragmento
de proteína deducido de la secuencia
encontrada en tomate de árbol y la
PPO de caqui, una especie de la familia
Ebenaceae que a su vez pertenece al
orden Ericales puede ser el reflejo de la
relativa proximidad filogenética de los
órdenes Ericales y Solanales.
Descripción de la proteína
Valor E
% Identidad
prePPO-C tomate (Solanum lycopersicum)
2e-52
89
prePPO-A tomate (Solanum lycopersicum)
4e-51
89
PPO berenjena (Solanum melongena)
5e-51
89
PPO-A tomate (Solanum lycopersicum)
2e-50
89
PPO POT33 papa (Solanum tuberosum)
2e-49
85
PPO-B tomate (Solanum lycopersicum)
2e-49
84
PPO POT32 papa (Solanum tuberosum)
2e-49
85
PPO-D tomate (Solanum lycopersicum)
5e-48
82
PPO-P2 tomate (Solanum lycopersicum)
1e-43
78
PPO-E tomate (Solanum lycopersicum)
1e-43
78
PPO-F tomate (Solanum lycopersicum)
3e-43
78
prePPO-A papa (Solanum tuberosum)
7e-43
77
PPO lulo (Solanum quitoense)
1e-42
78
PPO tabaco (Nicotiana tabacum)
2e-42
78
prePPO-B papa (Solanum tuberosum)
2e-42
76
PPO caqui (Diospyros kaki)
4e-37
78
Tabla 7. Valores de similitud entre la proteína hipotética derivada del fragmento de 551 pb. identificado en tomate de árbol y
polifenol oxidasas reportadas en otras especies.
El Astrolabio
39
CONCLUSIONES
Aunque una de las características que
distingue a todos los genes ppo conocidos
es la divergencia en la secuencia de su
extremo 5´, los iniciadores utilizados en
este estudio permitieron evidenciar que
existen variaciones a lo largo de toda la
secuencia de los genes ppo encontrados
en las especies de la familia Solanaceae.
Los análisis BLAST demuestran que el
diseño de los iniciadores les confiere la
capacidad de amplificar exclusivamente
genes ppo, hecho que abre la posibilidad
de que sean utilizados para estudios
similares en otras especies. La elevada
similitud del fragmento identificado
tanto a nivel de nucleótidos como de
aminoácidos con los genes y proteínas
PPO de berenjena, tomate, papa, lulo y
tabaco, junto con un %GC situado dentro
del rango esperado para los genes de
solanáceas se constituyen en evidencia
de que el fragmento de DNA identificado corresponde a un gen ppo. De otro
lado, los porcentajes de similitud entre
la secuencia encontrada en tomate de
árbol y las secuencias homólogas en
otras especies (a nivel de nucleótidos
o de aminoácidos) refleja de manera
clara la distancia filogenética existente
entre los individuos comparados. El aislamiento y la caracterización molecular
de la secuencia codificante restante del
gen ppo de tomate de árbol permitirán
reunir más evidencias y hacer análisis de
tipo estructural y filogenético que respalden las pruebas presentadas en este
estudio respecto a la existencia de por
lo menos un gen ppo en esta especie. Si
bien el examen de un fragmento de DNA
en términos de su secuencia de nucleótidos, el nivel de homología respecto a
otros genes y la existencia de secuencias
que codifiquen algún tipo de proteína
pueden aportar información valiosa, la
prueba definitiva de la existencia de proteínas PPO en tomate de árbol consiste
en expresar el gen aislado, purificar la
proteína obtenida y evaluar su actividad
sobre sustratos específicos (Cary, et al.,
1992; Eicken, et al., 1998) con el fin de
determinar su capacidad para catalizar
las reacciones de oxidación de ortodifenoles a orto-diquinonas.
LISTA DE REFERENCIAS
Agronet. (2010). Análisis-Estadísticas. Recuperado
el 14 de enero de 2011 de http://www.agronet.
gov.co/agronetweb/AnalisisEstadisticas/tabid/73/
Default.aspx.
Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. &
Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search
tool. J. Mol. Biol. 215, pp. 403-410.
Cary, J.W., Lax, A.R. & Flurkey, W.H. (1992). Cloning and characterization of cDNAs coding for Vicia
faba polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol. 20, pp.
245-253.
Chen, W. & Kuo, T. (1993). A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial
DNA. Nucl. Acids Res. 21, 2260.
Chevalier, T., de Rigal, D., Mbeguie-A-Mbeguie, D.,
Gauillard, F., Richard-Forget, F. & Fils-Lycaon, B.R.
(1999). Molecular cloning and characterization of
apricot fruit polyphenol oxidase. Plant Physiol. 119,
pp. 1261-1270.
Chi,M.H., Moinuddin,S.G., Helms, G.L., Hishiyama,
S., Eichinger,D., Davin, L.B. & Lewis, N.G. (2003).
(+)-Larreatricin hydroxylase, an enantio-specific
polyphenol oxidase from the creosote bush (Larrea tridentata). Proc. Natl. Acad. Sci. USA.100,
10641-10646.
Doyle, M. & Doyle, A. (1990). Isolation of DNA
from small amounts of plant tissues. BRL Focus 12,
pp.13-15.
Eicken, C., Zippel, F., Buldt-Karentzopoulos, K. &
Krebs, B. (1998). Biochemical and spectroscopic
characterization of catechol oxidase from sweet
potatoes (Ipomoea batatas) containing a type-3
dicopper center. FEBS Lett. 436, pp. 293-299.
Goldman, M.H., Seurinck, J., Marins, M., Goldman,
G.H. & Mariani, C. (1998). A tobacco flower-specific
gene encodes a polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol.
36, pp. 479-485.
Investigación y Ciencia del Gimnasio Campestre
40
Heiser, C.B. (1985). Ethnobotany of the Naranjilla
(Solanum quitoense) and its relatives. Econ. Bot.
39, pp. 4-11.
Hunt, M.D., Eannetta, N.T., Yu, H., Newman, S.M. &
Steffens, J.C. (1993). cDNA cloning and expression
of potato polyphenol oxidase. Plant Mol. Biol. 21,
pp. 59-68.
Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P., Chenna,
R., McGettigan, P.A., McWilliam, H., Valentin, F.,
Wallace, I.M., Wilm, A., López, R., Thompson,
J.D., Gibson, T.J. & Higgins, D.G. (2007). Clustal
W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23,
pp. 2947-2948.
Martínez, M.V. & Whitaker, J.R. (1995). The biochemistry and control of enzymatic browning.
Trends Food Sci. Technol. 6, pp. 195-200.
McEvily, A.J., Iyengar, R. & Otwell, W.S. (1992).
Inhibition of enzymatic browning in foods and beverages. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 32, pp. 253-273.
Newman, S.M., Eannetta, N.T., Yu, H., Prince,
J.P., de Vicente, M.C., Tanksley, S.D. & Steffens,
J.C. (1993). Organisation of the tomato polyphenol oxidase gene family. Plant Mol. Biol. 21, pp.
1035-1051.
Rensink, W.A., Lee, Y., Liu, J., Iobst, S., Ouyang, S.
& Buell, C.R. (2005). Comparative analyses of six
solanaceous transcriptomes reveal a high degree of
sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics 6, 124. Recuperado el 2 de
noviembre de 2010 en http://www.biomedcentral.
com/1471-2164/6/124
Rychlik, W. & Rhoads, R.E. (1989). A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter
hybridization, sequencing and in vitro amplification
of DNA. Nucl. Acids Res. 17, pp.8543–8551.
Rychlik, W., Spencer, W.J. & Rhoads, R.E. (1990).
Optimization of the annealing temperature for
DNA amplification in vitro. Nucl. Acids Res. 18, pp.
6409 – 6412.
Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977). DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.
Natl. Acad. Sci. U S A. 74, pp. 5463-5467.
Sullivan, M.L., Hatfield, R.D., Thoma, S.L. & Samac,
D.A. (2004). Cloning and characterization of red
clover polyphenol oxidase cDNAs and expression
of active protein in Escherichia coli and transgenic
alfalfa. Plant Physiol. 136, pp. 3234-3244.
Timbo, B., Koehler, K.M., Wolyniak, C. & Klontz,
K.C. (2004). Sulfites: a food and drug administration
El Astrolabio
review of recalls and reported adverse events. J.
Food Prot. 67, pp. 1806-1811.
Thygesen, P.W., Dry, I.A. & Robinson, S.P. (1995).
Polyphenol Oxidase in potato. A multigene family
that exhibits differential expression patterns. Plant
Physiol. 109, pp. 525-531.
Vaughn, K.C. & Duke, S.O. (1981). Tentoxin-induced
loss of plastidic polyphenol oxidase. Physiol. Plant.
53, pp. 421-428.
Vaughn, K.C., Lax, A.R. & Duke, S.O. (1988). Polyphenol oxidase: The chloroplast oxidase with
no established function. Physiol. Plant. 72, pp.
659-665.