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“Vectores basados en poxvirus”
Gabriela Calamante
Instituto de Biotecnología
CICVyA – INTA Castelar
Vectores virales
• Son virus genéticamente atenuados o incapaces de completar
su ciclo replicativo en el animal a inmunizar, por lo que no
producen enfermedad clínica
• Son virus modificados que llevan genes foráneos o secuencias
integradas en posiciones que no son esenciales para la
replicación viral ni para la infectividad.
• El virus es el vehículo y el gen foráneo es el gen de interés
contra el cual se quiere desarrollar la vacuna.
• Ventajas de los vectores virales no replicativos
- Inocuidad
- Expresión de glicoproteínas
- Estabilidad
Diseño de
un vector
viral
1- es necesario estudiar el genoma del vector para
identificar al menos una región donde insertar el material
genético foráneo
2- los genes de interés deben estar establemente
integrados en el genoma del vector
3- la inserción del gen foráneo debe realizarse de tal
manera que se garantice su correcta expresión (cantidad,
plegamiento, destino final, modificaciones post-traduccionales)
El 1er reporte
de un vector
viral fue a
principios de
los ´80
Se demostró que el virus vaccinia podía ser
ingenierizado para portar y expresar genes foráneos
Desde entonces la tecnología se aplicó en diferentes
familias de virus y para una gran diversidad de genes
foráneos (incluyendo los que codifican para antígenos
de patógenos)
Poxvirus
Familia Poxviridae
Subfamilias
- Chordopoxvirinae (vertebrados) 8 géneros
Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus,
Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus y Yatapoxvirus.
- Entomopoxvirinae (invertebrados)
Características
• Son virus envueltos complejos que replican en el citoplasma de
células de vertebrados e invertebrados.
• Su genoma está formado por una molécula de ADN de doble
cadena lineal de 130-375 kpb, bajo contenido G+C (30-40%).
• La partícula viral contiene enzimas que sintetizan los ARNm
tempranos.
Ciclo de
replicación
Citoplasma
Etapa temprana
Etapa
intermedia
Etapa tardía
Célula vecina
Poxvirus
recombinantes
• Usos de los poxvirus recombinantes
- Estudios sobre la biología molecular de los poxvirus
- Estudios de patogenicidad (ECTV en ratones)
- Producción y caracterización funcional de proteínas in vitro
- Producción de vacunas de nueva generación
• Ventajas de su utilización como vacunas de nueva
generación
- Estabilidad de la vacuna desecada, bajo costo, fácil administración
- Administración de la vacuna por diferentes vías
- Inducción de respuestas humorales y celulares contra el antígeno foráneo
junto con inmunidad duradera después de una única inoculación
- Creación de vacunas multivalentes debido a la flexibilidad
de empaquetamiento del genoma
- Diferenciación entre animales naturalmente infectados y
vacunados
- Inmunización se consigue en ausencia de replicación
(seguridad)
- No se manipula el agente patógeno en la producción de las
vacunas
Diseño de los vectores de transferencia para
obtener poxvirus recombinantes
Vector de transferencia
pE- X - t
Sitio blanco
de inserción
poxvirus
recombinación
homóloga in vivo
poxvirus recombinante
pE- X - t
pE: promotor temprano de poxvirus
X: gen de interés.
t: terminador de transcripción y traducción
Obtención de
poxvirus
recombinantes
Ingeniería
genética
1- Diseñar el vector de transferencia
Cultivo
2- Infección de un cultivo celular con el virus salvaje
Virología
1’- Subclonar el gen de interés en el vector de transferencia
2´- Transfección del vector de transferencia a las células
infectadas
recombinación
homóloga in vivo
(frecuencia 0,4 %)
Cultivo
Virología
Biología
molecular
Inmunología
3- Seleccionar los poxvirus recombinantes
4- Obtener un stock puro
5- Caracterizar genética y biológicamente los
recombinantes seleccionados
6- Evaluar su capacidad de inducir respuestas inmunes
específicas en animales (vacunas)
Elección del
sitio blanco
de inserción
1- Genes no esenciales para la replicación en cultivos
celulares
a) de función conocida
Virus vaccinia (1º generación) genes de las enzimas timidina kinasa y
hemoaglutinina
MVA (2º generación) pueden usarse los mismos genes como blancos de
inserción.
b) de función desconocida
Virus canarypox orf C5 (ALVAC comercializados por Merial)
Análisis bioinformático de secuencias disponibles y búsquedas bibliográficas.
c) de función conocida evasión de respuesta inmune (3º generación)
receptores solubles de citoquinas (IL-1, IFNg, IL-18, etc)
Elección del
sitio blanco
de inserción
(cont.)
2- Deleción de genes esenciales para la replicación en cultivos
celulares
El virus sólo puede crecer si el gen o su producto son provistos en trans
El virus sólo replica in vitro en una línea celular que exprese el producto
del gen delecionado
A principios de los ´90: Blasco y Moss caracterizaron la proteína de envoltura p37 de
vaccinia (codificada por el gen F13L)
La deleción de F13L no afecta la formación de partículas infectivas intracelulares
VAC-∆F13L no ocurre la adquisición de la membrana del Golgi ni la fusión a membrana
plasmática no egresa defectivos en diseminación y no forma placas de lisis a los 2 dpi, sin
embargo forma placas de lisis diminutas a los 5-7 dpi
VAC-∆
∆F13L
(receptor, NO FORMA
PLACAS DE LISIS)
VAC-recombinante
F13L+
FORMA PLACAS DE LISIS
Vector de transferencia
Elección del
sitio blanco
de inserción
(cont.)
3- Virus de replicación limitada
El virus se puede crecer in vitro en cultivos celulares de una especie
El virus se usa como vector en otra especie en la cual es incapaz de
completar el ciclo replicativo pero es capaz de expresar el gen foráneo
Avipoxvirus (CNPV y FWPV)
MVA y NYVAC
BHK-21
FEP
Expresión gen marcador
GUS células BHK-21
infectadas con CN-GUS
Elección de
los
promotores
La expresión del gen de interés debe estar
dirigida por regiones regulatorias de poxvirus
a)
Promotores
b)
Terminadores de transcripción y traducción
1) Vector viral replicativo VV en ratones o FWPV en pollos
Se pueden usar indistintamente promotores tempranos o tardíos de
poxvirus
pE/L sintético, p7.5, p11, pATI, pATI-(7.5)3-4
2) Vector viral no replicativo avipox o MVA en mamíferos
Sólo se pueden usar promotores tempranos de poxvirus
pH6, pE/L sintético, p7.5
pEL
t
SMC
pEL
Gen de interés
t
La recombinación homóloga ocurre en dos pasos
Sustitución alélica por
doble recombinación
homóloga
5’
Vector de
transferencia
VV
Inserción del plásmido originada por un
solo evento de recombinación homóloga
en la región 5’ del gen del VV
3’
5’
Gen no esencial
Inserción del plásmido originada por un
solo evento de recombinación homóloga
en la región 3’ del gen del VV
3’
5’
Gen no esencial
3’
Gen no esencial
salvaje
VV recombinante estable
VV
5’
3’
VV recombinante inestable 3´
VV recombinante inestable 5´
5´ 5’
3’
5’
3´
5´
3’
5’
3’
3´
recombinante
2do evento de
recombinación
intramolecular
VV salvaje
2do evento de
recombinación
intramolecular
VV recombinante estable
VV salvaje
Selección de
los
poxvirus
recombinantes
Teniendo en cuenta que:
la eficiencia de transfección es del 0.4%
la frecuencia de ocurrencia de doble recombinación no se
puede cuantificar
el virus salvaje replica normalmente
Es fundamental disponer de un sistema que permita
seleccionar los virus recombinantes con una alta eficiencia
Métodos de
selección de
los
poxvirus
recombinantes
1) Selección por resistencia a un compuesto químico
a) resistencia a antibiótico (neo) no aplicable para el área de vacunas (a menos
que se utilice sistema loxP-cre)
b) resistencia a ácido micofenólico selección de poxvirus recombinantes que
poseen el gen bacteriano gpt (enzima xanthine-guanine phosphoribosyltransferase)
MPA bloquea la ruta biosintética de purinas interfiere con la replicación viral
Expresión de XGPRT en presencia de MHX sustratos alternativos (X /H) y
resistencia a MPA
Sólo los virus recombinantes replican y forman placas de lisis
Se seleccionan los eventos de simple y doble recombinación
c) resistencia a BrdU selección de VV recombinantes TKEn presencia de la enzima TK activa, fosforilación de BrdU e incorporación al DNA
viral provoca mutaciones letalidad
Posibilidad de mutación espontánea a TK- (10-4) falsos positivos
Se combina con un método de screening
Se seleccionan los eventos de doble recombinación (reemplazo alélico)
2) Screening por actividad de una enzima marcadora
Actividad de las enzimas β-galactosidasa o β-glucuronidasa codificada por
los genes bacterianos lac Z o uid A, respectivamente.
Screening
por
actividad
GUS
Vector de transferencia
pH6- GUS- t
pE/L-XX - t
Gen no Poxvirus
esencial
recombinación homóloga in vivo
pH6-GUSPoxvirus
t recombinante
pE/L -XX - t
200X
Número de
pasaje
% placas de lisis
azules
1er
0,1%
2do
30-70%
3ro
70-90%
4to
90-100%
5to
100%
Métodos de
selección de
los
poxvirus
recombinantes
(cont.)
3) Selección por fenotipo tamaño de placa de lisis
Identificación de genes que codifican para proteínas que:
a) no son esenciales para la replicación en cultivo celular
b) son esenciales en las etapas finales de la morfogénesis viral (liberación del virus)
VAC p37K , 14K, B5R, H3L, entre otras
Caracterización de los
poxvirus
recombinantes
Caracterización molecular de los poxvirus
recombinantes
Aislamiento en FEP de las placas de lisis azules
(stock 100% homogéneo)
1) Análisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados
o no para determinar:
A) Presencia del gen de interés
B) Pureza del stock recombinante
2)
Análisis mediante Southern blot (inserción del gen de interés en el genoma viral)
a partir de ADN total purificado de FEP
3) Evaluación de la expresión del gen de interés en FEP (ARN total o extractos proteicos)
A) RT-PCR
43 kDa
VP2
34 kDa
C) Inmunofluorescencia (anticuerpo específico)
NI
CE
F
VA
M
VA
-V
P2
M
M
W
M
B) Western blot (anticuerpo específico)
IB
DV
Caracterización de los
poxvirus
recombinantes
(cont.)
Caracteri- Caracterización biológica:
zación de los
Cinética de crecimiento inserción no altere capacidad replicativa
poxvirus
Pasajes ciegos (más de 10) para demostrar estabilidad genética
recombi Infecciones de diferentes tipos de cultivos celulares conserva el mismo rango de
nantes
hospedadores
(cont.)
Inoculación en animales susceptibles no modificó su virulencia
Inoculación en animales no susceptibles no produce lesiones
Single - step
Uso de
poxvirus
recombinantes
- Estudios sobre la biología molecular de los poxvirus
- Producción y caracterización funcional de proteínas in vitro
- Producción de vacunas de nueva generación
- Optimización de vectores poxvirales
Estudios
virales
básicos
MORFOGÉNESIS VIRAL
Todos los estudios que determinaron los pasos que ocurren
durante la morfogénesis del virus vaccinia se realizaron
utilizando recombinantes que poseían deleciones de
determinados genes
1- se determinó si el gen era esencial para la replicación en cultivo
2- se determinó en que paso de la formación de las partículas virales está
involucrada la proteína
3- por ensayos de trans-complementación se reconstituía el fenotipo salvaje
VAC-WR
VAC-∆B5R
VAC-∆B5R/B5R
Producción
de proteínas
en cultivo
Utilizando la enzima T7 ARN polimerasa
1)
2)
3)
Enzima activa posee una subunidad
Alta procesividad de transcripción
Especificidad de promotor en citoplasma de células de mamíferos
Es un sistema de 2 componentes no se requiere hacer el poxvirus
recombinante de cada proteína en estudio
FWPV-pEL/T7RNApol
Plásmido
pT7
Evaluación de la
proteína de interés en
forma transitoria
10-30% del ARNm total
Si un gen se expresa
Localización proteínas-tag
Actividad enzimática (prot secretada)
Rescate de
virus
infeccioso
Estudios de genética reversa
Copias completas de genomas virales en plásmidos bajo regulación del
promotor del fago T7
No se hace transcripción in vitro
El ADN se transfecta en células infectadas con FWPV-T7 o MVA-T7
Efecto citopático de FWPV-T7 << MVA-T7 <<< VAC-T7
Se utilizan todo tipo de cultivos (poxvirus expresa T7 RNA pol en ausencia
de replicación)
•Rescate de virus infeccioso (genoma a ARN: norovirus, FMDV, IBDV, HAV,
CSFV, etc.)
•Evaluación de mutaciones/ intercambios genéticos (replicación, atenuación,
patogenia, etc.)
Vacuna
contra la
rabia en
zorros
PRUEBA A CAMPO CON VACUNA BASADA EN VIRUS VACCINIA
Objetivo: erradicar la rabia de los zorros salvajes (reservorio no controlado de virus)
VVTGgRAB: virus vaccinia recombinante que porta el gen de la glicoproteína de
rabia insertado en gen TK (atenuado)
Vacuna:
Vacuna Sobrenadante de cultivo de células BHK infectadas con VVTGgRAB
Cebo:
Cebo
50% carne fresca de pescado, 11% de aceite de pescado, 11% de un polímero sintético hodrofóbico
(produce el agregado)
un sachet de polietileno con 1 dosis de vacuna líquida
contiene un biomarcador de la toma del alimento
Se almacena a 4ºC sin congelar
Posee resistencia mecánica puede lanzarse desde el aire
Campañas de noviembre de 1989, abril y octubre de 1990 en Bélgica.
área de 2200 km2 en el sur de Bélgica
15 cebos/km2
81% de los zorros eran positivos para el biomarcador
No se detectaron casos de rabia en ganado o zorros
Debido al éxito, se continuó usando entre 1991 y 1994
1989
1994
Raboral
V-RG
En EEUU cada año se distribuyen más de 12 millones de dosis
de RABORAL V-RG® para prevenir la dispersión de rabia en
animales silvestres (principalmente mapaches y coyotes).
Existe transmisión pasiva de anticuerpos neutralizantes
Las crías pueden ser vacunadas a partir de los 30 días de edad
Los anticuerpos maternos no interferían con la inducción de protección
Vacunas
basadas en
poxvirus no
replicativos
Sólo replican en un número limitado de tipos celulares
No producen infección en el hospedador
Existe expresión temprana de genes inducen respuestas
inmunes específicas
DERIVADOS DE:
Virus vaccinia:
MVA (virus vaccinia Ankara modificado): atenuado por más de 500 pasajes en FEP
NYVAC: atenuado geneticamente por deleción de 18 genes no esenciales (regulación rta
inmune y rango hospedadores)
Avipoxvirus:
CNPV (virus canarypox)
FWPV (virus fowlpox)
MVA
NYVAC
Son vectores seguros e inmunogénicos para animales y humanos
Utilizando recombinantes que expresan luciferasa se evaluó su biodistribución en
ratones
A diferencia de WRluc, los recombinantes atenuados expresan el gen reportero
transitoriamente (MVA= 24 h, NYVAC= 72 h).
Los niveles de luciferasa en los tejidos infectados con MVAluc alcanzan un pico
antes que los infectados por NYVACluc.
Estos resultados podrian tener relevancia inmunológica cuando se usen como
vacunas.
MVA
Se obtuvieron virus recombinantes que expresan antígenos de diversos patógenos
(de animales o humanos) y se observó la inducción de respuestas inmunes
protectoras.
En los últimos años se los utiliza en esquemas de inmunización del tipo prime-boost,
donde el poxvirus se aplica en la 2da dosis (malaria, leishmania, tuberculosis).
2011 en España finalizó la fase 1 de una vacuna contra HIV
• MVA-B que expresa gp120 (monomérica) y poliproteína Gag-Pol-Nef (GPN)
• 3 dosis i.m.
• 92.3% de respuesta celular T específica (ALTAMENTE INMUNOGENICO)
• respuesta amplia: CD4+ contra Env (aumentó luego de 3° dosis)
CD8+ similar contra Env, Gag y GPN
• Las respuestas se mantuvieron durante 48 semanas (84.6% de los voluntarios)
CNPV
Existen vacunas licenciadas para animales de compañía y caballos en la Unión
Europea y EEUU que utilizan la tecnología del vector de canarypox ALVAC®.
Patógeno blanco
Animal blanco
Nombre comercial
Distribuidor
virus influenza equina
caballo
PROTEQ-FLU (UE) y
Recombitek (EEUU)
Merial
West Nile Virus
caballo
RECOMBITEKEquine
WNV
Merial
Rabies virus
gatos
Purevax Feline Rabies
Merial
Feline leukemia virus
gatos
EURIFEL FeLV
Merial
Canine distemper virus
perros
RECOMBITEK rDistemper
Merial
Fur animals
PUREVAXFerret
Distemper
Merial
Canine distemper virus
No se usan adyuvantes disminuye riesgo reacciones inflamatorias
En algunos casos induce protección luego de 1 dosis importante cuando se
requiere respuesta rápida
Si se requiere booster inmunidad anti-canarypox no altera la performance de
los boosters
Sobrepasa los anticuerpos maternos por ej. los anti-CDV en cachorros
Protección duradera hasta 1 año luego de la vacunación (FeLV, WNV)
Puede incorporarse en formulaciones vacunales combinadas
Se almacena/transporta a 4ºC
FWPV
Para la industria avícola existen vacunas licenciadas que
utilizan la tecnología del vector de fowlpox TROVAC®.
Patógeno blanco
Nombre comercial
Distribuidor
Newcastle disease virus
Vectormune FP-ND
Biomune
Avian influenza virus
Trovac AI H5
Merial
El virus recombinante es una vacuna bivalente: viruela + “antígeno foráneo”
Se puede aplicar a pollitos BB de 1 día
Se puede aplicar a pollos sanos antes de ingresarlos en zona de brote:
provee rápida protección
Vacuna FWPV(r) - influenza aviar H5N2 (HA): usada para el control de influenza
aviar en México (1.000 millones de dosis) en pollitos de 1 día de edad: protección
contra enfermedad y muerte (90-100%), reducción del número de pollos que
excretaron virus de desafío por tractos entéricos y respiratorios (50-75%)
Poxvirus como vacunas para humanos
ALVAC (virus canarypox) vacuna contra HIV
2003-2009 ensayo de Fase III en Tailandia (RV144) 105 millones U$S
>16.000 individuos
Régimen prime-boost
1º inoculación: CNPV gag-protease (clado B) y gp120 (clado E)
2º inoculación: vacuna a subunidad gp120 (AIDS/VAX B/E)
Virus canarypox no es inhibido por inmunidad pre-existencia contra virus vaccinia
(vacuna contra viruela en adultos nacidos antes de 1977)
Disminuyó la tasa de infección de HIV alrededor del 31%
No tuvo efecto sobre la carga viral en infectados después de vacunación
PRIMERA VEZ QUE UN CANDIDATO A VACUNA CONTRA EL SIDA MUESTRA
ALGUNA EFICACIA EN PREVENIR LA TRANSMISION DEL VIRUS
…eficacia es modesta pero primer resultado alentador en más de 2 décadas
Poxvirus
como
vacunas
La inmunidad pre-existente contra el virus vector interfiere con las
dosis refuerzo:
MVA: se aplica estrategia prime-boost (combinando DNA/poxvirus)
CNPV: no, la inmunidad previa no interfiere (intrínseco del vector)
FWPV: en aves puede haber interferencia con anticuerpos maternos anti-viruela
Cantidad de dosis y duración de la respuesta:
hay muchos y variados ejemplos (depende del antígeno y tipo de respuesta )
diferenciar entre blancos de vacunación (animales de compañía vs de producción)
Tipo de respuesta requerida para protección
poxvirus inducen principalmente respuestas CD8+
dependiendo de la compartimentalización del antígeno CD4+ y Acs
variabilidad cepas patógenas (expresar 1 antígeno o varios?)
Mejorar inmunogenicidad
co-expresión de citoquinas (GM-CSF, IL-1, IL-18)
deleción de genes involucrados en evasión de respuesta inmune
Plataformas para poxvirus recombinantes (CNPV, MVA y FWPV)
CNPV:
VP1 de FMDV (citoplasmática)
E2 de BVDV (membrana)
gDs de BoHV-1 (secretada)
VP2 de IBDV (citoplasmática) *
gB de MDV (membrana)
RG de RV (membrana) *
MVA:
gDs de BoHV-1 (secretada) *
VP2 de IBDV (citoplasmática)
poliproteína VPx-VP4-VP3 de IBDV
Ag85A de Micobacterium bovis (MVA y MVA optimizado)
optimizados (deleción de IL18bp)
nef de HIV-1 B/F (MVA y MVA optimizado)
env de HIV B/F
FWPV:
VP2 de IBDV (en curso)
optimizados (deleción de receptor soluble de IFNγ, IL18bp)
- Evaluación de respuesta inmune inducida
- Pruebas de desafío (*)
-Estudio comparativo de los vectores (expresando mismo Ag)
Convenios con empresas o grupos de investigación poxvirus recombinantes
Producción
de FEP
Proveedor de huevos fértiles SPF (libres de patógenos específicos)
Incubación por
10-11 días
(en incubadora
en bioterio Inst.
Biotec.)
Se siembran los recipientes de
cultivo utilizando una densidad
celular de 7 x 105 – 1 x 106
células/ml
Obtención
de poxvirus
recombinantes
Screening de recombinantes: clonado de partículas infectivas bajo agar, en
presencia de X-Gluc (enzima GUS) o bluo-gal (enzima beta-gal)
200X
Caracterización molecular de los stocks virales homogéneos (100% de
placas de lisis azules): PCR, Western blot, etc. determinar presencia y
expresión del gen de interés (antígenos)
NI
CNPV
CN-RG MPM
- 72 kDa
- 55 kDa
-43 kDa
Anticuerpos totales
2x107 ufp de CN-X o CNPV vía
intraperitoneal (2 dosis, cada 21 días)
La presencia de anticuerpos anti-X se detectó
por ELISA a los 20 días de la segunda inmunización
Anticuerpos seroneutralizantes
% p la c a s d e lisis
Determinar
capacidad
inmunogénica
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CNPV-VP2
D78
pre-inmune
0,00001
0,00010
0,00100
Título del suero CN-VP2: 3,37 (reducción al 50%)
Título del suero D78: 4,61 (reducción al 50%)
0,01000
Respuesta celular: ELISPOT IFNg
Evaluación de la respuesta utilizando diseño de
matrices con los peptidos solapantes
Cél secretoras de IFN-g/millon de cél
ELISPOT
ELISPOT
25
20
Pool Total
*
Control
15
10
5
0
ADN/MVA Nef BF
MVA/MVA Nef BF
ADNv/HA-
El esquema prime-boost fue el más efectivo en
generar respuesta celular
8
7
6
5
4
3
2
1
0
pool
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 RPMI
pooles 7, 9 y 10 representa 3 péptidos de mayor
inmunogenicidad: BF4, BF16 y BF22
Determinar capacidad protectiva frente al desafío
Grupo
UI /ml
VeroRab
4,5
Vacuna comercial (purif y
concentrada) SanofiPasteur
CNPV-RG
3,5
Vector viral no replicativo
Referencia
1
Grupo
Poxvirus
Grupo de Poxvirus
Dra. Gabriela Calamante (INTA PP)
Inst.
Biotecnología
Dra. Flavia Zanetti (CONICET Inv Asistente)
CICVyA-INTA
Dra. M. Paula Del Médico Zajac (INTA PNP)
Lic. Romina Cardona (becaria PICT 2008)
Lic. Carlos Federico (becario CONICET)
Lic. Débora Garanzini (becaria MinCyT-ANLIS)
Srta. Marisol Esusy (estudiante ad honorem)
Colaboradores:
Cultivo: Dr. O. Zabal y su equipo
Técnica: M.J. Mónaco
Bioterio: S. Diaz
Virus aviares: Dres. A. Venzano y M. Delamer
Vectores MVA optimizados: Dra. M.M Gherardi (CNRS-UBA)
Financiación (en curso)
ANPCyT PICT 2008 Nº 0400 (2010-2013)
INTA Proyecto Específico AERG 232141 (2009-2012)