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Detección de
patógenos en alimentos
Consuelo Vanegas / Johanna Rojas
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HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004
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Detección de
patógenos en alimentos
Consuelo Vanegas / Johanna Rojas
A diario consumimos diferentes alimentos que son la principal fuente
de energía para realizar las actividades de nuestra vida, pero estos alimentos pueden causar enfermedades
si no han sido elaborados bajo normas de higiene adecuadas. Este tipo
de enfermedades se conocen con el
nombre ETAs –Enfermedades Transmitidas por Alimentos–. A nivel mundial las ETAs son una de las causas
más preocupantes en salud pública ya
que ocurren de 24 a 81 millones de
casos y más de diez mil muertes por
consumo de alimentos contaminados.
Los síntomas típicos de la gastroenteritis causada por estos microorganismos son dolor de cabeza,
náuseas, diarrea, vómito, dolor abdominal y, en algunos casos, escalofrío o fiebre. El período de incubación
depende del agente etiológico implicado y puede ser muy corto, o hasta de
setenta y dos horas después de ingerido el alimento contaminado. Las ETAs,
además de causar la gastroenteritis, ameritan especial atención porque pueden generar complicaciones y secuelas como meningitis, artritis, desórdenes auto inmunes, enfermedades cardiovasculares, neoplasias, y abortos.
Por otra parte los gastos económicos causados por incapacidades laborales
y por pérdidas industriales debido al rechazo de productos contaminados
con estos patógenos son bastante altos. Por estas razones, es necesario que
Los alimentos y el agua pueden ser
la vía de transmisión de bacterias, parásitos, virus, priones –causantes del
mal de las vacas locas–, toxinas de
bacterias y hongos. En Colombia se
ha reportado que los alimentos potencialmente dañinos son aquellos
con alto contenido proteico, baja acidez y alta humedad tales como la carne, mariscos, lácteos, huevos, arroz
y pastas. Entre los factores de riesgo
asociados con la presentación de estas enfermedades tenemos deficientes
hábitos higiénicos, el manejo inapropiado de temperaturas –enfriamiento,
calentamiento, descongelamiento– y
almacenamiento inadecuado.
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Los grupos de mayor riesgo son los
niños, ancianos, mujeres embarazadas y pacientes inmunosuprimidos,
aunque se presenten casos en población sana entre quince y cuarenta y
cuatro años. Según reportes de la Secretaria Distrital de Salud de Bogotá,
los lugares en los cuales se ha presentado la mayoría de casos son en
casas, colegios, escuelas, hogares infantiles, restaurantes escolares y sitios turísticos.
HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004
Figura 1.
Casos de ETAs en Colombia de 1998 a 2001. Datos tomados de SIVIGILA,
consultados en http://www.col.ops-oms.org/sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8
de noviembre de 2004
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Figura 2.
Placa de electroforesis de productos de amplificación
del gen para la identificación de cepas de Salmonella
spp. Los números de las columnas corresponden a:
0 y 11-escala DNA Ladder; 1- Salmonella typhi ATCC
6539. 2-9. Cepas de Salmonella sp. aisladas de
alimentos. 10. Control
Figura 3.
Placa de electroforesis de productos de 235 pares de
bases que identifican a las cepas de Listeria
monocytogenes. Los números de las columnas
corresponden a: 0 y 13-escala DNA Ladder; 1-L.
monocytogenes ATCC 7644. 2-10 Cepas de Listeria sp.,
–las columnas 6 y 7 no fueron identificadas como L.
monocytogenes–; 11-Control Negativo: S .aureus ATCC
25923. 12. En blanco
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se preste la atención adecuada a esta problemática y se
optimicen los métodos de detección de estos microorganismos en los laboratorios de microbiología.
En Colombia, como en otros países del mundo, han aumentado las ETAs bacterianas debido a que no se ha logrado controlar efectivamente la contaminación de los
alimentos (figura 1). Estos reportes no muestran la dimensión real del problema, las estadísticas pueden ser
mayores debido a que falta mejorar el registro de la información ante las entidades pertinentes, ya que el consumidor se automedica y desconoce la magnitud de la
enfermedad. Además, los médicos no siempre ordenan
los exámenes adecuados para determinar el agente causante de la sintomatología. Por lo tanto, es necesario
desarrollar la investigación en esta área e implementar
métodos de microbiología más sensibles y específicos
para detectar los patógenos en los alimentos.
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Para una explicación de las técnicas de PCR y de electroforesis, se
recomienda el artículo “Detectives del Mal de Chagas” en Hipótesis No. 1
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Detección de los microorganismos
Para aislar e identificar bacterias de alimentos en el laboratorio se han utilizado, tradicionalmente, métodos de
microbiología clásica en los cuales los protocolos tardan mucho tiempo en generar resultados y son poco sensibles, permitiendo el crecimiento de otras bacterias, lo
que dificulta la detección del patógeno. Por esta razón y
teniendo en cuenta la necesidad de detectar con rapidez
los microorganismos en los alimentos, para evitar que
estos salgan a la venta contaminados, se está implementando el uso de la reacción en cadena de la polimerasa,
PCR, que permite identificar de manera más rápida y específica los microorganismos productores de ETAs en
alimentos destinados al consumo humano.
Esta técnica permite multiplicar el fragmento de un gen
específico de la bacteria patógena, para que se evidencie
su presencia al observarlo por el método de electroforesis. Este método permite identificar el gen al compararlo
con un patrón de escala (DNA-Ladder) que indica el número de pares de bases del gen1. (Figuras 1 y 2).
Figura 4.
Curvas generadas por la PCR en tiempo real de la detección de Salmonella enteritidis
El Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos,
LEMA, de la Universidad de los Andes, ha realizado estudios para identificar dos de las bacterias más importantes dentro del grupo de productoras de ETAs: Salmonella
spp., causante de gastroenteritis y fiebre tifoidea y Listeria
monocytogenes causante de abortos y meningitis.
Para Salmonella se estandarizó la técnica de PCR mediante identificación de un fragmento del gen invA, que
permite la invasividad de la bacteria en las células epiteliales del intestino. Mediante esta técnica se han confirmado cincuenta cepas de Salmonella spp. aisladas de
diferentes tipos de alimentos como pollo, tocineta y jamón de cerdo, entre otros. (Figura 2).
Para Listeria monocytogenes se amplificó el gen que
codifica para la Listeriolisina O, que es el factor de virulencia que inicia la infección. Se trabajaron sesenta cepas de L. monocytogenes, provenientes de derivados
lácteos, las cuales fueron identificadas por la banda de
amplificación de 235 pares de bases (figura 3). Los alimentos estaban disponibles para su venta en plazas de
mercado de Bogotá.
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A pesar de que la PCR es una técnica rápida, se ha desarrollado una modificación
a ésta, en la cual no se realiza electroforesis, de tal forma que los resultados se
obtienen simultáneamente con la amplificación del gen. Esta técnica se conoce
con el nombre de “PCR en tiempo real” y
se realiza utilizando un marcador, como
SYBR GREEN-I, que produce fluorescencia al unirse al ADN de cadena doble, con
un equipo que la detecta y genera una curva de la intensidad de fluorescencia contra temperatura. El pico de la curva indica
la temperatura de fusión –melting peak–,
en la cual el 50 por ciento del ADN se encuentra en doble cadena. De esta manera, cada cepa bacteriana genera una
temperatura de fusión específica que indica su presencia.
En la figura 4 se observan los picos de amplificación obtenidos para la detección de
Salmonella enteritidis. Esta bacteria genera una temperatura de fusión de 86.47°C
mientras las otras cepas evaluadas, utilizadas como controles negativos (véase la
tabla de la figura 4), expresan temperaturas de fusión diferentes, indicando que no
son Salmonella enteritidis. Esto demuestra la alta especificidad de la prueba.
En el Laboratorio de Ecología Microbiana y
de Alimentos, LEMA, de la Universidad de
los Andes, se está utilizando la técnica de
PCR en tiempo real para la detección de
Salmonella enteritidis en muestras de pollo
a la venta en supermercados de Bogotá,
Listeria monocytogenes en leches crudas
distribuidas en Boyacá, y Campylobacter,
utilizando menudencias de pollo distribuidas en Bogotá.
El uso de estos métodos permite obtener
resultados más rápidos y seguros, por lo
cual deberían utilizarse en la industria para
tener un control de calidad más estricto y
reducir el riesgo de distribución y venta
de alimentos contaminados. De esta forma se podría disminuir la circulación de
bacterias patógenas en los alimentos y
reducir la generación de infecciones e intoxicaciones.
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HIPÓTESIS / APUNTES CIENTÍFICOS UNIANDINOS No. 4 / Dic. 2004
> Referencias
[1]
D. De Medici, L. Croci, E. Delibato, D. Pasquale, E.
Filetici & L. Toti. Evaluation of DNA extraction
methods for use in combination with SYBR Green
I real-time PCT to detect Salmonella enterica
serotype Enteritidis in poultry. Applied
Environmental Microbiology 69(6), 3456–3461
(2003).
[2]
C. Jaramillo, A. Diaz. Detectives del mal de
Chagas. Revista Hipótesis No. 1, 42–49 (2003).
[3]
A. D. Sails, A. J. Fox, D. R. Wareing & D.L.
Greenway. A real-time PCR assay for the detection
of Campylobacter jejuni in foods after enrichment
culture. Applied Environmental Microbiology
69(3): 1383–1390 (2003).
[4]
J. S. Way, K. L. Josephson, S. D. Pillai, M.
Abbaszadegan, C. P. Gerba & L. I. Pepper. Specific
Detection of Salmonella spp. by multiplex
polymerase chain reaction. Applied Environmental
Microbiology 59(5), 1473–1479 (1993).
[5]
Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pública.
Enfermedades transmitidas por alimentos en
Santa Marta durante la temporada de vacaciones.
Boletín epidemiológico Semanal. Semana
Epidemiológica No. 6. febrero 03 a 09 de 2002.
Consultado en http://www.col.ops-oms.org/
sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8 de noviembre
de 2004.
> Reseña de los autores
María Consuelo Vanegas López.
[email protected]
Profesora asistente, Microbiología. Directora del
Laboratorio de Ecología Microbiana y de Alimentos,
LEMA, Universidad de los Andes.
Johanna Rojas. Microbióloga.
[email protected]
Asistente graduada, Laboratorio de Ecología
Microbiana y de Alimentos, LEMA. Estudiante de
Maestría en Ciencias Biológicas con énfasis en
Microbiología de Alimentos en la Universidad de los
Andes.
> Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias y a
Roche-Diagnóstica por el apoyo financiero prestado
para la realización de estas investigaciones.