Download marcadores moleculares para el diagnóstico temprano de la

MARCADORES MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA
DIABETES MELLITUS
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Jesús Morlett Chávez , Teresa Esquivel , Ivonne Flores Pedraja , Alejandro Zugasti Cruz ,
Guadalupe de la Cruz Galicia2, Ana Cecilia Cepeda Nieto3*
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Laboratorio Análisis clínicos y Diagnóstico Molecular y 2Laboratorio de Inmunología, Facultad De
Ciencias Químicas; 3Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Coahuila Unidad Saltillo Av.
Venustiano Carranza esquina con José Cárdenas. República Oriente. CP 25280. Saltillo Coahuila. Tel: (844)
4169213 Fax: 4390511*[email protected].
1.
RESUMEN
La diabetes es un trastorno crónico de base genética caracterizado por diferentes manifestaciones. El incremento de
personas con diabetes en años recientes se debe a factores genéticos y al incremento de personas obesas. El
conocimiento de mecanismos genéticos es importante porque permite la identificación de las variantes génicas que
influencian la enfermedad. Herramientas moleculares como la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) ha permitido
discernir los genes y sus variantes relacionados a la diabetes. Las personas con ciertos polimorfismos en múltiples
genes puedes ser susceptible a la diabetes; sin embargo, estudios previos has demostrado que los genes CAPN10 y
PPRγ juegan un papel importante para el desarrollo de la diabetes y en consecuencia pudieran ser genes candidatos
para utilizarlos como diagnóstico molecular y proveer así la detección oportuna de esta enfermedad para evitar
complicaciones de la Diabetes como retinopatías, daño renal, daños en el SNC, entre otros.
2.
DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE DIABETES
La palabra diabetes deriva del griego diabeinen “pasar a través” o “salir con fuerza”; mientras que mellitus deriva del latín
y significa “dulce como la miel” (Greespan, 1998). La diabetes mellitus se presenta como un trastorno primario del
metabolismo de carbohidratos, de etiología multifactorial, aunque destaca la influencia genética sobre la susceptibilidad
para la deficiencia absoluta o relativa de insulina, resistencia a esta última o ambas, llevando finalmente a hiperglucemia
con las consecuencias a largo plazo de esta alteración (De Anda-Turati y cols., 2000). Este trastorno crónico se
caracteriza por tres tipos de manifestaciones: a) síndrome metabólico alterado a consecuencia de un déficit absoluto o
relativo de la secreción de insulina, reducción de la actividad biológica de ésta o ambas; que consiste en hiperglucemia,
glucosuria, polifagia, polidipsia y poliuria, además de alteraciones en el metabolismo de lípidos y proteínas, b) síndrome
vascular, macroangiopático o microangiopático, afecta todos los órganos pero especialmente el corazón, la circulación
cerebral y periférica, riñones y retina, y c) síndrome neuropático, autónomo o periférico (Permutt y cols., 2005 y Kumar
Das y Elbien, 2006). Además, la diabetes se considera como una causa fundamental en diferentes problemas de salud,
específicamente en enfermedades cardiovasculares (Dedoussis y cols., 2007). Por su parte, la diabetes se clasifica en:
1) diabetes mellitus tipo 1 (DT1), resulta de la destrucción autoinmune de las células β (productoras de insulina)
provocando la insuficiencia de insulina, 2) diabetes mellitus tipo 2 (DT2), causada por la disminución en la secreción de
insulina y por la resistencia a la insulina en los tejidos blanco (hígado y músculos) (Ding y Triggle, 2005; Lyssenko y
cols., 2005), 3) diabetes gestacional (DG) se define como un estado de intolerancia a la glucosa durante el embarazo y
4) Diabetes juvenil (DJ), se deriva a partir de ciertas cirugías u otras enfermedades (Figura 1) (Permutt y cols., 2005).
Figura 1. Clasificación de la diabetes y características principales de cada uno de los tipos de diabetes.
3.
COMPLICACIONES DE LA DIABETES
Los estadios tempranos de la DT2 se mantienen inciertos y en controversia; sin embargo, se sabe que el estadio tardío
de ésta, está gobernado por el incremento en la producción de glucosa hepática, disminución en la secreción de insulina
y la acción de ésta sobre su tejido blanco está disminuida (Figura 2) (Kumar Das y Elbein, 2006). Como enfermedad
crónica se presenta con graves desenlaces, entre los que sobresalen: insuficiencia renal crónica,´ daño cardiovascular,
´
ceguera resultante de la retinopatía diabética, nefropatía, invalidez y en el peor de los casos, muerte
´ prematura (Garcia
Peña y cols., 1995). Cabe destacar que las complicaciones vasculares asociadas a diabetes son los problemas más
frecuentes que enfrentan los pacientes diabéticos y la principal causa de más de 3 millones de las muertes
cardiovasculares en el mundo (Danael G y cols., 2006).
Figura 2. El incremento de glucosa en plasma está determinado por efectos genéticos, en la dieta y el estilo de vida.
4.
ETIOLOGÍA DE LA DIABETES
Actualmente, se tiene mayor claridad acerca de la predisposición y el desarrollo de la DM2.Para lograr entender las
bases moleculares de este padecimiento no es suficiente conocer solo las alteraciones estructurales o funcionales a nivel
molecular, sino también las interacciones del individuo con el medio ambiente ya que ello conduce a la alteración o al
aumento de la expresión de uno o de varios genes (Panduro y cols., 2001). Como ya se describió previamente, en la
diabetes participan diversos genes y sus productos por lo cual se considera poli-genética (Honeyman y cols., 1995).
Dedoussis y cols. (2007) sugirieron que los genes/proteínas que se expresan y regulan el funcionamiento de las células
pancreáticas pueden ser genes candidatos para desarrollar la diabetes; sin embargo, estos genes pueden ser utilizados
como marcadores para el diagnóstico temprano de ésta. Sin embargo, se creía que los principales generadores de
riesgo genético para desarrollar diabetes se encuentran los genes HLA; los cuales se localizan en el cromosoma 6 y
presentan varios polimorfismos (HLA-A2, Cw1, B56, DR4, DQw8) (Honeyman y cols., 1995; Permutt y cols., 2005). Al
respecto, Florez y cols. (2008) buscaron polimorfismos de un simple nucleótido (SNP por sus siglas en inglés) en el gen
WFS1, éste se localiza en el cromosoma 4p16, codifica para una proteína transmembrana de 100 kilodaltones (KDa) y
se expresa en neuronas y células β pancreáticas. Los resultados indicaron que éste gen puede estar asociado a la
diabetes insípida, mellitus y atrofia óptica (síndrome de Wolfram). Los genes ABCC8 y KCNJ11 (Kir6.2) se localizan en el
cromosoma 11p15.1, presentan SNPs como 74(3p+215), 76(A190) y 77(E23K), estos se asocian a desordenes en la
secreción de insulina. El gen CAPN10, conocido como el gen común de la diabetes, se localiza en el cromosoma 2 y
codifica para la calpaina-10, una cisteína-proteasa. Ciertos polimorfismos en éste gen están relacionados con la diabetes
(Cuadro 1). Otro gen relacionado con la diabetes es el gen PPAR, éste presenta varios subtipos conocidos como
PPARα, PPARβ/δ y PPARγ . Este último es codificado por 3 genes diferentes; PPARγ1, PPARγ2 y PPARγ3. Existe una
variante de este gen conocido como PPARγ2 que se expresa sólo en tejido adiposo, donde regula la diferenciación
adipogénica. En ratones knockout se demostró que mutaciones en PPARγ2 provocan variación en la sensibilidad a la
insulina (Lyssenko y cols., 2005; Permutt y cols., 2005; Dedoussis y cols., 2007; Florez y col., 2007). Otros productos de
los genes que pudieran estar relacionados con la diabetes son los derivados de las citocinas del tejido adiposo, Factor de
necrosis tumoral α (TNFα) e interleucina 6 (IL6). En la mayoría de los casos de diabetes más de un gen está
desregulado; sin embargo, también existe la diabetes considerada como monogenética, en donde existen una o más de
una mutación en sólo un gen, causa la diabetes juvenil (Slingerland, 2006).
El incremento de personas con diabetes en años recientes no sólo se debe a los factores genéticos si no al incremento
de personas obesas (Dedoussis y cols., 2007). Previas investigaciones sugieren que la resistencia a la insulina se debe
al incremento de los ácidos grasos en la célula provocando la inhibición de las vías implicadas en el catabolismo de la
glucosa, además de la deficiencia en el metabolismo de los ácidos grasos en los adipocitos y deficiencia en la oxidación
de estos en las mitocondrias. Sin embargo, la relación molecular y fisiológica entre la diabetes y la obesidad no ésta bien
documentada. En África se observó que el incremento de la mancha urbana provocó el aumento de personas con
diabetes, además, éste hecho también se observó en personas que migraron de África a los Estados Unidos de América
(Permutt y cols., 2005; Dedoussis y cols., 2007).
Cuadro 1. Polmorfismos en genes relacionado con el desarrollo de la diabetes.
Diabetes Gen
Función
SNP, alelo, locus o marcador
DJ1
HNF4A
Factor de transcripción
Mutación en 13 familias
DJ2
GCK
Metabolismo de la glucosa
130 diferentes mutaciones descritas
DJ3
TCF1
Factor de transcripción
120 diferentes mutaciones descritas
DJ4
IPF1
Factor de transcripción
Mutaciones raras y 1 familia descrita
DJ5
TCF2
Factor de transcripción
Mutaciones raras
DJ6
NEUROD1
Factor de transcripción
Mutaciones descritas en dos familas
DT1
HLA
Regulación del sistema inmune
Variantes en múltiples genes
DT1
INS
Relacionado con el metabolismo
VNTR
DT1
CTLA4
Regulación del sistema inmune
T17A
DT1
PTPN22
Regulación del sistema inmune
SNP C1858T
DT2
ABCC8
Regulador de canales de potasio e insulina
SNP’s en varios exones
DT2
CAPN10
Proteasa
SNP’s en varios intrones
DT2
GCGR
Control hepático de producción de glucosa y
regulación de insulina
G40S
DT2
GCK
Metabolismo de la glucosa
Microsatelite en la región 3’
DT2
KCNJ11
Regulación de la secreción de insulina
E23K
DT2
PPARG
Factor de transcripción
P12A
DT2
HNF4A
Factor de transcripción
SNPs en promotor P2
DT2
SLC2A1
Transportador de glucosa
Sitio de restricción Xba1
5.
EPIDEMIOLOGÍA DE LA DIABETES
La Diabetes Mellitus (DM) tipo 2 es un problema de salud a nivel mundial, algunos investigadores la consideran como el
principal problema de salud publica en lo que se refiere a las enfermedades crónico degenerativas ((Panduro y cols.,
2001). Además, se le considera como una pandemia de enormes proporciones, de alto costo social y económico y de
magnitudes ascendente (García Peña y cols., 1995). De acuerdo a la Organización Mundial de Salud (WHO, por sus
siglas en ingles) hay más de 170 millones de personas diagnosticadas con DT2 en el mundo y se estima un incremento
cercano a los 324 millones de diabéticos para el 2025, además, se cree que éste incremento se acentuará en los países
en vías en desarrollo como Asia, África y Latinoamérica. Sin embargo, se sospecha que hay más de 1.2 millones de
millones personas que presentan DT2 y que no han sido diagnosticadas. En el promedio de personas con diabetes en
Estados Unidos se calculó en 18.2 millones, de estos el 33 % son varones y el 39% son mujeres. Sobre la epidemiologia
de la diabetes en México, se observan alarmantes cifras actuales de su prevalencia en nuestra población siendo la
principal causa de muerte, los datos revelan un total de 272, 326 defunciones en hombres y 221, 575 defunciones en
mujeres. Mientras que en el Estado de Coahuila, según cifras de la Subdirección de Salud Pública (2005), esta
enfermedad ocasionó 2,789 muertes, siendo la principal causa de muerte para hombres (940 defunciones) y mujeres
(1,238 defunciones); sin embargo, lo más alarmante es que la estimación de más de 16, 420 casos de diabetes
diagnosticados.
6.
DIAGNÓSTICO DE LA DIABETES
6.1. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Los síntomas como poliuria, polidipsia, polifagia, astenia o cetoacidosis conllevan a la sospecha clínica de la diabetes.
Sin embargo, el diagnóstico de diabetes se confirma mediante determinación de glucosa en sangre, que se realizan ante
situaciones de sospecha clínica o bien en estudios de detección sistemática (diagnóstico de diabetes gestacional y
estudios epidemiológicos); otro método confirmatorio para la diabetes es el diagnóstico la hemoglobina glicosilada
(Hba1c), la cual es una heteroproteína de la sangre que resulta de la unión de la Hb con carbohidratos libres.
Asimismo, los diagnósticos que se han tratado de utilizar como diagnóstico alternativo para la diabetes, es la
determinación de anticuerpos por métodos de ELISA. Los anticuerpos más frecuentes presentes en diabéticos son los:
anticuerpos anti-células de islote (ICA), anticuerpos anti-descarboxilasa del ácido-glutámico (GAD), anticuerpos antiinsulina (IAA), y anticuerpos anti-proteína similar a tirosina fosfatasa (IA-2). Además, se han reportado moléculas
asociadas al daño pancreático, las cuales pudieran servir como marcadores tempranos de desarrollo de la diabetes y
como métodos diagnósticos más oportunos. Sin embargo, estos diagnósticos se pueden realizar tan sólo después que la
enfermedad se presentó, por tal motivo, en las últimas décadas se ha propuesto el empleo de la Biología Molecular para
determinar la relación gen/enfermedad y posteriormente emplear a estos genes y sus variantes polimórficas para el
desarrollo del diagnóstico molecular.
6.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA DIABETES
El trabajo realizado por los investigadores alrededor del orbe ha permitido entender mejor a la DM en lo que respecta a la
etiología, mecanismos fisiopatológicos y la aproximación diagnostica y terapéutica. Con el impresionante desarrollo de la
biología molecular en las últimas décadas, el panorama del conocimiento cambio radicalmente. El diagnóstico molecular
se lleva a cabo por medio de la PCR, empleando ADN extraído del paciente, posteriormente, se amplifica el gen
candidato empleando iniciadores (primers) específicos de éste gen, el cual se le considera un marcador molecular. Un
marcador molecular se define como un gen o una proteína que presenta ciertas características como: a) participa sólo en
una vía de señalización, b) presenta polimorfismos o c) variantes génicas se expresan en cierta condición o enfermedad,
sólo por mencionar algunas características. Por ejemplo, se logró identificar genes/proteínas que participan tanto en la
secreción de insulina en respuesta a una concentración de glucosa plasmática, como en la vía de señalización
intracelular para la acción de esta hormona, por lo que cada uno de esos genes pudiera ser un gen candidato para
considerarlo como un marcador molecular (Chiqueta y cols., 2001). Por ello es de suma importancia el conocimiento de
los mecanismos genéticos ya que permiten la identificación, desde el nacimiento de un ser, de las variantes génicas y
que influyen en el desarrollo de la enfermedad durante toda su vida. Así pues, los estudios que demuestran claramente
que un gen presenta una variante con un efecto significativo sobre el fenotipo relacionado con la enfermedad, indican la
susceptibilidad de un gen. Además, las variantes de genes candidatos que pudieran desarrollar diabetes también han
sido estudiadas, algunos de esos genes se mencionan en el Cuadro 1. Hanis y cols. (1996), analizaron la región
telomérica del cromosoma 2q (2q33-2q37) en 330 México-Americanos, destacando la presencia del gen CAPN10.
Interesantemente, Horikawa y cols. (2000) indicaron que en la misma población México-Americana, el gen que codifica
para la calpaina-10 registró diferentes polimorfismos (SNP-43, SNP-19 y SNP-63) y estos se relacionaron con riesgo a
desarrollar DT2. Por su parte, Lyssenko y cols. (2005) analizaron los SNP-43 y SNP-44 del gen CAPN10 como posible
candidato para predecir el desarrollo de la diabetes. Los resultados demostraron que a partir de estos SNP’s en CAPN10
y en otro gen conocido como PPARγ se puede predecir la presencia de DT2 en personas aparentemente sanas.
Anteriormente, Parikh y Croop (2004) y Memisoglu y cols. (2003) indicaron que la sustitución aminoacídica de la
Pro12Ala en la proteína PPARγ ésta relacionada con mayor riesgo de desarrollar DT2, mientras que la Ala12Pro tiene
mayor sensibilidad hacia la insulina, es decir, disminuye el riesgo de desarrollar DT2.
7.
CONCLUSIÓN
La susceptibilidad genética parece jugar un rol importante en la incidencia a desarrollar DT2 en ciertas poblaciones. Sin
embargo, los cambios en el estilo de vida, como la actividad física disminuida o nula y el consumo de energía, se han
combinado para desarrollar obesidad, el cual es un factor de riesgo importante para la diabetes, además de la influencia
génica. Por otro lado, la importancia del uso de herramientas genómicas radica principalmente en la prevención y en la
oportunidad de identificar a individuos aparentemente sanos candidatos a desarrollar diabetes. Asimismo, nos permitiría
determinar la etiología de la enfermedad, elegir la terapia basada en diagnostico más exacto, a precisar los factores
ambientales que contribuyen al inicio y a la progresión de la enfermedad y sus complicaciones y, por último, a supervisar
la respuesta a la terapia en pacientes diabéticos. En ese contexto, los genes CAPN10 y PPARγ son los candidatos más
prometedores para diagnosticar y prevenir de manera oportuna el desarrollo de la diabetes. Así pues, la investigación y
propuesta de marcadores moleculares tempranos puedan ser de utilidad para el desarrollo de nuevas tecnologías que
puedan emplearse en el diagnóstico de la diabetes o de otras enfermedades para la prevención en pacientes
aparentemente sanos.
8.
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