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Cuantificación de Legionella
mediante real time PCR.
Resultados de un estudio
experimental.
Gemma Saucedo.
Laboratorio Aguas de Barcelona
22-23 de noviembre de 2006
Introducción
PCR: Polymerase Chain Reaction
Técnica de Biología Molecular inventada en 1985 por Kary B. Mullis
(Premio Nobel de Química, 1993)
Objetivo de la PCR: amplificación del material genético para hacer
posible su detección. Aplicaciones múltiples.
Cada organismo tiene una secuencia genética única, pero comparte
genes con los organismos de su especie, género, etc..
ADN de Legionella
Selección de una región
de su ADN
Región de un gen
específico de Legionella
Realización de múltiples
copias
Introducción
Muestra
DNA/RNA
Preparación
muestra
Extracción
Retro
Amplificación
ácidos nucleicos transcripción
Máxima variabilidad de los resultados
cDNA
Producto
Detección
Equipos, técnicas y reactivos
estandarizados
¿Cómo funciona la PCR?
• Técnica de amplificación selectiva
de una región de DNA escogida.
Reacción cíclica de síntesis.
• Reactivos necesarios: DNA + Enzima
TaqPol
+ nucleótidos + primers
específicos
• Pasos: 1) Desnaturalización de la
doble cadena de DNA
2) Hibridación de los primers
(annealing)
3) Amplificación (elongation)
• Es cualitativa
PCR product compared with DNA ladder
in agarose gel. DNA ladder (lane 1), the
PCR product in low concentration (lane
2), and high concentration (lane 3).
Image published with permission of
Helmut
W.
Klein,
Institute
of
Biochemistry, University of Cologne,
Germany
From Nupedia
¿Cómo funciona la PCR cuantitativa?
• Mide
la
relación
entre
la
cantidad de ácidos nucleicos
diana iniciales y la cantidad de
producto amplificado durante
la fase exponencial
• Un reactivo más: las sondas
(probes)
• Es real time.
• Permite calcular la Tm
(temperatura de melting)
EL CICLO EN EL QUE SE INICIA EL
INCREMENTO DE FLUORESCENCIA
POR ENCIMA DEL UMBRAL ES
PROPORCIONAL A LA
CONCENTRACIÓN INICIAL DE DNA
By Qiagen
¿Cómo funciona la reverse transcriptase PCR?
Transcriptasa
inversa
Aplicaciones
http://www.cytochemistry.net/Cell-biology/
• Obtención de cDNA a partir del cual se puede hacer real time
PCR (cuantitativa)
• Recuento de viables (mRNA)
• Recuento de la mayoría de virus
El RNA es extremadamente sensible a la degradación por RNAsas
¿Por qué la PCR?
VENTAJAS
• Rapidez: plazo de obtención de resultados muy reducido
• Especificidad, fiabilidad, sensibilidad, reproducibilidad y robustez
• Complementaria a las técnicas tradicionales
• Posibilidad de analizar diferentes microorganismos de varias muestras en un mismo
análisis
• Análisis de microorganismos para los cuales no existen metodologías tradicionales
de detección
• Unificación de las técnicas de detección y cuantificación de diferentes
microorganismos
• Posibilidad de estandarización y de automatización de análisis
• Apertura de nuevas líneas de investigación
• Económicamente viable con una relativa inversión inicial
INCONVENIENTES
• Métodos no incluidos como métodos oficiales en la legislación vigente
• Posibles falsos positivos
• Inhibiciones de la reacción
• Es necesario acondicionar el laboratorio de biología molecular
Comparación entre métodos de detección
1 criobola
250 ml medio de
cultivo líquido (variante
CYE): 10 g/l extracto
levadura + cisteína +
hierro + antibióticos
Cepa de L.
pneumophila
ambiental o de
colección
BHI infusión
0,5 ml
Inocular: 10 µl
(duplicado)
Variables:
• Crecimiento en agitación
• A temperatura ambiente
Análisis:
• Recuento de cultivables: siembra directa de 100 µl
por duplicado
Tiempo:
• Recuento de viables por Chemscan.
•0h
• PCR cuantitativa
• 24 h
• (DO)
• 48 h
• 72 h
• 7 días
• 10 días
• 15 días
Resultados obtenidos con diferentes métodos
de detección
Datos logarítmicos de los diferentes métodos
Día
0
1
2
3
6
Promedio
Cultivables (UFC/ml)
1,83
1,75
1,32
1,15
0*
1,21 ± 0,73
Viables (viables/ml)
4,56
4,52
4,45
4,32
4,06 4,38 ± 0,20
PCR 16S multicopia
5,29
5,19
5,19
5,29
5,09 5,21 ± 0,08
4,54
4,52
4,46
4,50
4,33 4,47 ± 0,08
(copias / ml)
PCR mip monocopia
(copias genoma /
ml)
*: log (n+1)
Comparación numérica entre métodos de
detección (diferencias logarítmicas)
Día
0
1
2,73
2,77
3,13 3,17 4,06 3,17 ± 0,54
PCR 16S vs cultivo 3,45
3,44
3,87 4,14
16S vs Viables
0,73
0,67
0,74 0,97 1,02 0,83 ± 0,16
mip vs Viables
-0,02
0
16S vs mip
0,75
0,67
Viables vs cultivo
2
3
0,01 0,18
6
5
0
Promedio
4,00 ± 0,68
0,09 ± 0,13
0,73 0,79 0,76 0,74 ± 0,04
Comparación gráfica entre métodos de
detección
6
Log resultado
5
Cultivo
4
Viables
3
PCR16S
2
PCR MIP
1
0
0
1
2
Días
3
6
Detección de Legionella por real time PCR
• Norma AFNOR XP T 90-471 “Qualité de l’eau – Détection et
quantification
des
Legionella
et/ou
Legionella
pneumophila
amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation
(PCR)”
• Informe técnico sobre Normalización de métodos moleculares de
análisis
microbiológico
de
alimentos
y
aguas.
Comisión
Normalización de la Sociedad Española de Microbiología (SEM).
de
Resultados q-PCR en muestras reales
• Aguas tratadas y Torres Refrigeración
Tabla con los resultados de q-PCR de L. pneumophila
(16S, gen MIP) y Legionella spp. en aguas tratadas y
torres de refrigeración
Tipo muestra
Aguas
Tratadas
n
70
Positivas para
L. pneumophila 16S
8
11,4%
11
52,4%
Positivas para
L. pneumophila mip
6
8,6%
10
47,6%
Positivas para el
género Legionella
37
52,9%
21
100%
%
Torres
refrigeración
%
21
Comparación qPCR vs. cultivo
• Aguas tratadas
Tabla con los resultados de q-PCR y de cultivo de L. pneumophila y
Legionella spp. (16S) en aguas tratadas
Análisis
Legionella
pneumophila
Legionella spp
Cultivo
PCR (copias/litro)
Cultivo (UFC/litro)
Cultivo (UFC/litro)
Género Legionella
PCR (copias/litro)
n
%
Promedio
69
99%
<lq
1
1%
Pres/20ml
62
89%
<lq
8
11%
472
69
99%
<lq
1
1%
142
68
97%
<lq
2
3%
142
33
47%
<lq
37
53%
8
22%
119.630
29
78%
177
Resultados cultivo y q-PCR en muestras reales
• Aguas tratadas
Tabla comparativa resultados de cultivo y de q-PCR de L. pneumophila
(16S, gen mip) y Legionella spp. en aguas tratadas
Cuantificación por cultivo (UFC/l)
Cuantificación por PCR (copias/litro)
Muestras
aguas
tratadas
L. pneumo
1
L. pneumo
2-14
Leg. spp
16s ARN
L.pneumophila
MIP gene
L. pneumo
16s ARN
gén. Legion.
1
<1
<1
<1
290
105
320
2
<1
<1
<1
548
105
626
3
<1
<1
<1
666
188
598
4
<10
<10
<10
710
Negativo
674
5
<50
<50
<50
328
Negativo
864
6
<1
<1
<1
292
118
334
7
-
-
Positivo
3,4E+03
568
3,50E+03
8
-
-
105
1,3E+03
128
1,27E+03
9
<50
<50
-
Negativo
-
1,81E+03
10
<50
<50
<50
Negativo
-
4,18E+04
11
<50
<50
<50
Negativo
-
1,38E+03
Resultados cultivo y q-PCR en muestras reales
• Aguas de torres de refrigeración
Tabla comparativa resultados de cultivo y de q-PCR de L. pneumophila
(16S, gen MIP) y Legionella spp. en torres refrigeración
Cuantificación por cultivo (UFC/l)
Muestras
torres
refrigeración
L. pneumo
1
L. pneumo
2-14
1
550
Cuantificación por PCR (copias/litro)
16s ARN
L. pneumophila
MIP gene
L. pneumo
16s ARN
gén. Legion.
1.100
2,1E+05
1,3E+04
2,42E+05
2
24.000
1,5E+05
9,8E+03
1,56E+05
3
60
1,0E+04
804
6,84E+03
Leg. spp
4
<2.000
6,6E+06
9,9E+04
6,77E+06
5
<20
1,8E+03
Negativo
3,67E+03
3,7E+04
3,1E+03
3,87E+04
4,8E+03
387
4,47E+03
1,9E+04
8,27E+02
2,52E+04
7,0E+07
7,53E+06
1,75E+08
5.300
6
7
500
16.000
8
9
40.000
10
50
7,0E+02
3,33E+01
1,51E+03
11
30
1,3E+05
5,90E+04
8,60E+04
CONCLUSIONES
• La concentración de la muestra y la extracción del DNA son pasos
básicos en la eficiencia del proceso global
• Las técnicas moleculares y concretamente la qPCR ya son una
herramienta básica para los laboratorios de análisis
• La cuantificación de una cepa de colección de Legionella en medio
líquido por qPCR (gen 16S) es del orden de 4 logaritmos superior
que la cuantificación por cultivo
• Tanto con muestras reales como en cepas de colección la PCR
cuantitativa es mucho más sensible que el cultivo
• La cuantificación de Legionella por qPCR utilizando el gen 16S es
más sensible que el gen mip (0,74 logaritmos superior)
• Un 88,6% de las muestras de aguas tratadas analizadas son
negativas para Legionella pneumophila por qPCR. Sólo un 47,1% lo
son para el género Legionella
AGRADECIMIENTOS
LABORATORIO MICROBIOLOGÍA
AGUAS DE BARCELONA
• Ingrid Salazar
• Belén Galofré
• Anna Terradillos
• Ferran Ribas
EMATSA
A USTEDES POR SU ATENCIÓN
Enzima Taq polimerasa
Thermus aquaticus, denominado también Thermophilus aquaticus,
es una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes
de agua caliente (de 50 a 80 °C).
Thermus aquaticus fue descrito por Thomas Brock en 1969 en una
fuente del parque de Yellowstone. Es una bacteria gram-negativa,
aerobia y heterótrofa.
Esta bacteria vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 °C,
debido a que su cóctel enzimático resiste tales condiciones.
Normalmente a esas temperaturas, las proteínas constitutivas de la
mayoría de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser
funcionales. Es por ello por lo que, una de sus enzimas, la ADN
polimerasa de Thermus aquaticus, la Taq polimerasa, es
ampliamente utilizada por sus propiedades de termo resistencia en
las reacciones de PCR. En efecto, esta enzima tiene una
temperatura óptima de funcionamiento alrededor de los 75 °C.