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Marzo ‐ Abril de 2009 Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR Detección de patógenos por PCR: importancia de las dianas
genéticas
secuencia de un mismo gen de virulencia. No
obstante, por la propia historia natural entre
sus portadoras y el hospedador, es sabido que
estos genes tienen una fuerte tendencia a la
mutación lo que explica su elevada variabilidad
interna (figura1): la secuencia genética de una
diana de virulencia presenta casi siempre nutrol, pues está forzado a usar un sistema de merosas posiciones variables incluso entre
oligonucleótidos que viene predefinido por el aislados de un mismo lugar.
fabricante.
Además, al tratarse de genes funcionales, las
“La detección es la Introducción La detección es la tercera y última fase del proparte del análisis
tocolo de análisis de alimentos por PCR, tras la
en la que el analista preparación de la muestra y la extracción del
tiene menos capa- ADN. A pesar de la sencillez en la preparación y
ejecución de la PCR, se trata de la parte en la
cidad de control... ” que el analista tiene menos capacidad de con-
Un juego de reactivos para la detección de patógenos por PCR consiste, básicamente, en un
tampón que contiene los elementos necesarios
para la PCR (sales, nucleótidos activados, polimerasa) más un juego de cebadores para la
síntesis en ambos sentidos y, en su caso, las
sondas o los informadores de fluorescencia
necesarios para la monitorización a tiempo real
del progreso de la reacción.
“…las variaciones
o mutaciones presentes en el gen
diana son la principal fuente de resultados falsos negativos... ” mutaciones llamadas silenciosas tienden a
acumularse en la tercera base del triplete codificante o codón. Esto no produce efectos fenotípicos pero convierte a nuestra diana en algo
“móvil” y difícil, por tanto, de acertar.
Inclusividad y falsos negativos. Entendemos por inclusividad la capacidad de
un método de PCR de dar positivo con el máximo número posible de cepas (≥ 50) del organismo a detectar. Cualquier cepa que se quede
Criterios de selección de las dianas. Los oligonucleótidos que contienen los kits de fuera del sistema de detección producirá un
PCR están diseñados para ser complementarios falso negativo.
de un gen concreto identificativo de la bacteria La razones por las que una o varias cepas de
a detectar, conocido también como “gen diana”. una especie bacteria a detectar no den positivo
En el caso de las bacterias patógenas, se han en el análisis por PCR pueden ser básicamente:
usado tradicionalmente genes de virulencia
como dianas, lo que posee la ventaja de la ex- (a) que el gen diana presente mutaciones justo
clusividad, pues es difícil que dos especies bac- en la zona de hibridación con los oligonucleótiterianas distintas compartan completamente la dos, o
Figura 1. Alineamiento realizado con ClustalX de 20 secuencias del gen dotA , usado en algunos sistemas de detección de Legionella pneumophila por PCR a tiempo real, a partir de cepas de este organismo obtenidas en la misma zona de muestreo. Las zonas conservadas se muestran en azul , mientras que las posiciones con cambios se muestran más claras. ‐ 1 ‐ Newsletter Microbial
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(b) que el gen diana no esté presente en el genoma de la bacteria a detectar.
35
16S rRNA
30
)
b
(p
e 25
e
r
g
e
d
n 20
io
t
a
vr
e
s 15
n
o
C
Conservation degree (pb)
La PCR a tiempo real opera a unas condiciones térmicas que
aseguran la máxima especificidad. Ello significa que un solo
fallo o mismatch en la complementariedad entre sondas y
diana se traduce en un resultado negativo. Por tanto, las variaciones o mutaciones presentes en el gen diana son la principal
fuente de resultados falsos negativos. En consecuencia, debemos asegurarnos que la diana genética a la que apunta nuestro
sistema de detección es invariable.
Idoneidad de los genes dianas Las secuencias de los oligonucleótidos usados en PCR a tiempo real suelen ser fijas, por lo que también deben serlo las
zonas complementarias del gen diana. Por su parte, la longitud de un cebador para PCR a tiempo real oscila entre los 20 y
los 25 nucleótidos, mientras que la de una sonda para el sistema Taqman® puede llegar a 30. Por este motivo, un buen
sistema de detección de patógenos basado en PCR debe contener cebadores complementarios a regiones génicas muy conservadas, la amplitud de las cuales deben ser cuanto menos
iguales o superiores a la longitud del cebador o sonda. En este
sentido, podemos clasificar estas dianas como idóneas, adecuadas, o deficientes, en función de si existen o no estas zonas
conservadas (figura 2).
Esta clasificación no depende del tamaño del gen, sino del tipo
de función que éste codifica. Así por ejemplo, el gen invA usado comúnmente para detectar Salmonella no contiene fragmentos conservados de longitud superior a 16 pares de bases. ¿Cómo son las dianas de Microbial? Salmofast
Legiofast
invA
mip
10
Ideal
Adecuado
Deficiente
5
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Thermodynamic stability (Kj/mol)
Figura 2. Grados de idoneidad de los genes diana analizados en función de la amplitud de las regiones conservadas. Se ha considerado como adecuadas aquellas que oscilan entre 21 y 26 bases de conservación absoluta, lo que asegura la ausencia de fallos de los cebadores y sondas. El gen 16S rRNA es ideal por su alto grado de conservación aunque su capacidad de discernir por debajo del género es limitada. Los genes dianas usados comúnmente para Salmonella (invA) y para Legionella (mip) están claramente por debajo de lo se podría considerar adecuado y ofrecen dudas sobre su utilidad para todas las cepas de estas dos bacterias. Recomendaciones
A diferencia del resto de fabricantes de Kits, Microbial busca Cuando adquirimos un sistema de detección de patógenos por
dianas específicas y exclusivas de las bacterias a detectar con PCR, debemos ser capaces de responder a una serie de preun elevado grado de conservación, lo que reduce prácticamen- guntas:
te a cero la posibilidad de un falso negativo por variación en el
• ¿En qué gen diana se basan?
gen diana.
• ¿Cuál es el grado de conservación de esa secuencia en
la bacteria que se va a detectar?
Para ello se incluyen sondas específicas complementarias de
amplias regiones conservadas de genes reguladores, puesto
• ¿Qué riesgo hay de obtener falsos negativos?
que la mayoría de genes de virulencia carecen de estas regio- La respuesta a estas cuestiones aportará información valiosa
nes al menos en la amplitud necesaria (21 bases) para diseñar sobre la fiabilidad de la herramienta que se va a utilizar.
un cebador o una sonda. Los genes reguladores, en cambio,
muestran secuencias únicas para cada especie bacteriana y Conclusión
además son muy conservados.
La estabilidad genética y grado de conservación del gen diana
son factores clave para asegurar la especificidad y la inclusiviComo resultado, Microbial ofrece la mayor inclusividad del dad de un sistema de detección de patógenos por PCR. Por
mercado y la tranquilidad absoluta del responsable del labora- esta razón es crucial elegir correctamente qué juego de oligotorio respecto a los resultados negativos. nucleótidos se va a emplear en la reacción. © Microbial SL
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