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CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN A.C.
SOBREXPRESION CONTROLADA DEL GEN NPR1 EN PAPAYA
UTILIZANDO UN PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL: UNA
ESTRATEGIA BIOTECNOLOGICA PARA EL CONTROL DE LA
ANTRACNOSIS
Jorge M. Santamaría,, Virginia Herrera-Valencia, Gabriela Fuentes,
Mariana Menéndez, Fabio Idrovo, Miguel Angel Vallejo-Reyna, Santy
Peraza-Echeverría .
CIBIOGEM, 2 Agosto 2012
1.
Porque papaya?
• Un alimento con un alto contenido nutricional (Jiménez, 2002;
USDA, 2008). Vitamina C, Vitamina A, polifenoles, licopenos
100gr de Papaya fresca contienen:
Fuente: USDA, 2008
PORQUE PAPAYA ?
PAPAYA, PRODUCCION
En el 2010 Se sembraron a nivel mundial 438 mil has que produjeron 11 millones
de tons, con un valor de $3 mil millones de USD
En México, se sembraron 14 mil has produciéndose un total de 616 mil
tons, con un valor de la producción de $174 millones USD
México ocupó el quinto lugar mundial en producción después de India, Brasil, Nigeria
e Indonesia
1 India
2 Brazil
3 Nigeria
4 Indonesia
5 Mexico
tons
4,7 millones
1,8 millones
7 millones
695 mil
616 mil
USD (millones)
1.3 mil
531
199
197
174
3
• PAPAYA,
EXPORTACION
•México, primer exportador a nivel mundial por arriba de Brasil y USA,
exportándose 100 mil tons anualmente,
con un valor de 55 millones de USD
País
Cantidad (TM) Valor (10x103 USD)
México
101306
55327
Brasil
32267
34404
EUA
9604
17715
4
PORQUE ANTRACNOSIS?
•Producida por el hongo Colletotrichum gloeosporioides
Reduce la calidad del fruto en postcosecha
Pérdidas hasta del del 99% en épocas favorables al desarrollo de la
enfermedad.
• Papaya es un fruto climatérico, es decir madura fuera del árbol. Como parte
fundamental de este proceso de maduración poscosecha se libera etileno. Sin
embargo dicho etileno actúa también como señal, para estimular al hongo y
propagar la enfermedad ya que favorece la germinación de esporas, micelio y
apresorios.
Manners , (1993) . Principles of plant pathology. Prusky y Plumbley, (1992). Colletotrichum Dodd et al., (1992). Colletotrichum. (Flaishman
yKolatukkudy,1994). Tatagiba et al., (2002). Fitopatologia BrasileiraLiberato y Zambolin (2002). Controle de doenças de plantas fruteiras.
5
Esta enfermedad postcosecha se presenta cuando el
etileno dispara el proceso de maduración del fruto.
Esto ocurre a los 4 días de ser removido del árbol.
De manera que se empacan frutos aparentemente
sanos y se exportan, pero en muchas ocasiones
pueden regresar el contenedor, ya que se recibe
lleno de antracnosis
6
LA ENFERMEDAD SE CONTROLA CON
Fungicidas QUIMICOS
Sin embargo los fungicidas químicos causan
problemas ecológicos y su aplicación representa del
30 al 40 % del costo de producción (entre $20 y 40
mil pesos por ha al año) Guzmán et al., (2009).
Mas aún, los fungicidas se aplican además en postcosecha,
durante el empacado del fruto, 12 días antes de ser
consumidos¡
7
Guzmán et al.,(2009). Academia Journals 30:6
CLARAMENTE, SE REQUIERE UNA
ESTRATEGIA ALTERNATIVA
• Estrategia biotecnológica alterna para el control del patógeno
•SOBRE-EXPRESAR GENES QUE INCREMENTEN LA RESISTENCIA DE LA
PLANTA AL PATOGENO (NPR1, TGA)
•HACERLO EN FORMA CONTROLADA, SISTEMA ALC
•INDUCIR LA EXPRESION EN EL FRUTO COSECHADO POR LO QUE LA PLANTA
NO EXPRESA EL TRANSGEN EN LA PLANTACIÓN
8
El genoma completo de papaya está
disponible Ming et al 2008, Nature
¿PORQUE NPR1?
NPR1 (No expresivo de genes PR-1)
Es el regulador maestro de la resistencia
sistémica adquirida (SAR)
Su sobre-expresión ha resultado en plantas
de varias especies, con mayor resistencia a
patógenos
10
Metil
salicilato
Inducción de la expresión de
genes relacionados a la
patogénesis (PR) en tejidos
distantes a la zona de ataque
Patógeno
Efectores
A
S
Ácido
Salicílico
(AS)
Zona de
ataque
Señal que viaja
a través del
floema y activa
la
Resistencia
Sistémica
Adquirida
(SAR)
Activación de
una muerte
celular
programada
en el sitio de
ataque
Respuesta
Hipersensible
(HR)
Modificado de Pieterse and van Loon (2004).
Clonación de ADNc completos
de NPR1 reportados
Especie
Referencia
Arabidopsis thaliana
Cao et al. 1997
Nicotiana tabacum
Liu et al. 2002
Helianthus annuus
Ekergren et al. 2003
Lycopersicon esculentum
Chern et al. 2005
Oryza sativa
Radwan et al. 2005
Malus x domestica
Malnoy et al. 2007
Vitis vinifera
Henanff et al. 2009
Glycine max
Sandhu et al. 2009
La familia génica de NPR1 en
Arabidopsis thaliana
Regulador
positivo
de la SAR
Cao et al. 1997
Cell, Vol. 88
57–63
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Reguladores
negativos
de la SAR
Desarrollo
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Liu et al. 2005
The Plant Journal,
Vol 41, 304–318
Zhang et al., 2006
The Plant Journal,
Vol.48, 647–656
Sobre-expresión de NPR1 = mayor
resistencia a patógenos
Especie
Patógeno
Fenotipo
Referencia
Arabidopsis thaliana
Psm ES4526
Peronospora parasitica
Resistente
Cao et al. 1998
Oriza sativa
Xanthomonas oryzae pv oryzae
Resistente
pleitropía
Fitzgeald et al.
2004
Lycopersicon esculentum
Resistente
Lin et al. 2004
Oriza sativa
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,
Stemphylium solani
Phytophthora infestans
X. campestris pv. Vesicatoria Ralstonia
solanacearum
Cucumber Mosaic Virus (CMV)
Tomato Mosaic Virus (ToMV)
Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV)
X. oryzae pv oryzae
Resistente
pleitropía
Chern et al
2005
Triticum sp.
F. graminearum
Resistente
Makandar et al.
2006
Malus × domestica
Venturia inaequalis
Erwinia amylovora
Gymnosporangium juniperi-virginianae
Resistente
Malnoy et al.
2007
¿COMO LOGRAR UNA EXPRESION
CONTROLADA?
• Sistema ALC
16
PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL, GEN alc
Plant Physiology Volume 129(3):943-948, JulyTubérculo
1, 2002
Actividad de GUS en tubérculos maduros
(100 mL de agua o disolución de etanol 0.7
M). Sweetman et al., (2002), Plant
Physiology
.
+
Basado en Tomsett et al., (2004) TRENDS in Plant Science
17
Potato tuber
SOBREXPRESION CONTROLADA DEL GEN NPR1 EN PAPAYA
UTILIZANDO UN PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL:
UNA ESTRATEGIA BIOTECNOLOGICA PARA EL CONTROL DE
LA ANTRACNOSIS
Ciencia Básica del CONACYT
CB 83829
2009-2012
18
Objetivos
• General
– Caracterizar la estructura, filogenia y expresión del juego completo de los genes
tipo NPR1 de Carica papaya L., var. Maradol. Sobreexpresar uno de los genes
NPR1 mas prometedores en callos embriogénicos, regenerar plantas y evaluar
si frutos de platas que sobreexpresen dicho gen aumentan su resistencia a
antracnosis
• Particulares
– Caracterizar in silico la estructura de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.
Caracterizar las relaciones filogenéticas de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.
– Evaluar los patrones de expresión basal de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.
y en respuesta a SA (inductor de SAR).
– Transformar callos embriogénicos con uno de los genes NPR1 mas
prometedores, regenerar plantas y evaluar si frutos de las plantas que
sobrexpresen dicho gen aumentan su resistencia a antracnosis
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
20
Resultados
21
Porcentajes de identidad de las secuencias
homologas tipo NPR1 (4) encontradas en papaya
vs las 6 secuencias reportadas en A. thaliana
22
Características de NPR1
• Presenta dos dominios de interacción proteína-proteína.
– un dominio BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac /
Poxvirus Zinc finger) .
– un dominio ankyrin-repeat formado de 4 dominios ANK
(Ankyrin).
• Cisteínas (Cys) que permiten la oligomerizacion de la
proteína.
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Motivo Fosfodegron
Tipo IĸB
AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
DSxxxS
 
----MDTTIDGFADSYEISSTSF-VATDNTDS-SIVYLAAEQVLTGPDVSALQLLSNSFE
MATTTTTTTARFSDSYEFSNTSG-NSFFAAES-SLDYP--TEFLTPPEVSALKLLSNCLE
----MDYRTG-TSDSNDISNNSS-TCCVATNTDTLSHP--LEPLTTPEISGLQLLSRNLL
-------MATLTEPSSSLSFTSS-HFSYGSIGSNHFSSSS---ASNPEVVSLTKLSSNLE
------MAATAIEPSSSISFTSS-HLSNPSPVVTTYHS-----AAN-----LEELSSNLE
-------MANSAEPSSSLSFTSSSHLSNCSASHNFSSSSCHETGPNLEVISLSRLSSNLE
-------MENGSEMSSSLSFASS-NLSSSSSSLSHDPCTS---LEN---LSLNKLSCNLE
-------------------------------------------MSS-LEESLRSLSLDYL
-------------------------------------------MSN-LEESLRSLSLDFL
-------------------------------------------MSNTFEESLKSMSLDYL
BTB
AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
•El motivo fosfodegron tipo IĸB (Spoel et al., 2009) de seis
55
SVFDSPD-DFYSDAKLVLSD-GREVSFHRCVLSARSSFFKSALAAAKKE----------aminoácidos
se encuentra en Asp10 - Ser15.
57
53
50
44
54
47
17
17
SVFDSPE-TFYSDAKLVLAG-GREVSFHRCILSARIPVFKSALATVKEQ----------TIFDSSDFDFFSDARLMLGS-GREIPVHRCILSSRSPFFKAIFSGSAFK----------QLLSNSD-CDYSDAEIIVDG--VPVGVHRCILAARSKFFQDLFKKEKKI----------QLLTNPD-CDYTDAEIIIEEEANPVSVHRCVLAARSKFFLDLFKKDKDS----------RLLIDST-CDYSDADIIVEG--ISVGVHRCILAARSKILN----KVKHS----------NLLFHSE-YDYSDAEIVVED--KPVAVHRCILAARSQFFHQLFSKGVVK----------NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGPDPP---PGLDPT-G
NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGTDSPQPVTGIDPT-Q
24
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
1 -------------------------------------------MSS-LEESLRSLSLDYL
1 -------------------------------------------MSN-LEESLRSLSLDFL
1 -------------------------------------------MSNTFEESLKSMSLDYL
BTB

AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
55
57
53
50
44
54
47
17
17
18
SVFDSPD-DFYSDAKLVLSD-GREVSFHRCVLSARSSFFKSALAAAKKE----------SVFDSPE-TFYSDAKLVLAG-GREVSFHRCILSARIPVFKSALATVKEQ----------TIFDSSDFDFFSDARLMLGS-GREIPVHRCILSSRSPFFKAIFSGSAFK----------QLLSNSD-CDYSDAEIIVDG--VPVGVHRCILAARSKFFQDLFKKEKKI----------QLLTNPD-CDYTDAEIIIEEEANPVSVHRCVLAARSKFFLDLFKKDKDS----------RLLIDST-CDYSDADIIVEG--ISVGVHRCILAARSKILN----KVKHS----------NLLFHSE-YDYSDAEIVVED--KPVAVHRCILAARSQFFHQLFSKGVVK----------NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGPDPP---PGLDPT-G
NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGTDSPQPVTGIDPT-Q
NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCESDPSQ—PGAEPANQ
BTB

AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
102
104
101
96
92
96
93
69
72
72
--KDSNNTAAVKLELKEIAKDYEVGFDSVVTVLAYVYSSRVRPPPKGV---SECADENCC
--KSS---TTVKLQLKEIARDYEVGFDSVVAVLAYVYSGRVRSPPKGA---SACVDDDCC
--ERT-----AKFRLKELAGDYDVGFDALVAVLAYLYTGKVWPLPKGV---CVCVDEECS
--SKTE---KPKYQLREMLPYGAVAHEAFLYFLSYIYTGRLKPFPLEV---STCVDPVCS
--SEK----KPKYQMKDLLPYGNVGREAFLHFLSYIYTGRLKPFPIEV---STCVDSVCA
--ANN--------------------------------------------------------EGK-----PRYLMSELVPFGVVGYEAFSVFLNYLYTGKLRPSPPEV---STCVDLTCN
SRMSPG-AARG----AGVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW
HGSVPASPTRGSTAPAGIIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW
TGSGARAAAVG-----GVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPHKHEPRSNCGDRGCW
BTB

AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
157
156
151
148
143
99
143
124
132
127
HVACRPAVDFMLEVLYLAFIFKIPELITLYQRHLLDVVDKVVIEDTLVILKLANICGKAC
HVACRSKVDFMVEVLYLSFVFQIQELVTLYERQFLEIVDKVVVEDILVIFKLDTLCGTTY
HVGCRPAVDFLVEVLYVAFTFQISELVALYQRHLLDIIDKVETDNILVILSVANICGKVC
HDCCRPAIDFVVQLMYASSVLQVPELVSSFQRRLCNFVEKTLVENVLPILMVAFNC--KL
HDSCKPAIDFAVELMYASFVFQIPDLVSSFQRKLRNYVEKSLVENVLPILLVAFHC--DL
--------------------------TNSLGRRLLNFTGKAMVEHVLPILVVAFHC--QL
HDACGPAITYALELMYASATFQVKELVLLLQRRLLDFVEKAFVEDVIPILVAAFHC--QL
HTHCTSAVDLALDTLAAARYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
HTHCSAAVDLALDTLAASRYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
HTHCTAAVDLSLDILAAARYFGVEQLALLTQKHLTSMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM
AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
217 MKLLDRCKEIIVKSNVDMVSLEKSLPEELVKEIIDRRKELGLE----VPK----------
• El216
dominio
BTB (Hepwort et al., 2005) en Ser65 - Val194,
KKLLDRCIEIIVKSDIELVSLEKSLPQHIFKQIIDIREALCLE----PPK---------211 DRLLGRCMDIIVKSDVDAVTLDKSLPLSIVKQIMDLRAECDTQ----GPEG--------206 TQLLDQCIERVARSDLYRFCIEKEVPPEVAEKIKQLRLISPQDEETSPKIS---------
25
1er ANTKYRIN
2º ANTKYRIN
AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
263
262
258
257
248
182
252
242
243
236
---------VKKHVSNVHKALDSDDIELVKLLLKEDHTNLDDACALHFAVAYCNVKTATD
---------LERHVKNIYKALDSDDVELVKMLLLEGHTNLDEAYALHFAIAHCAVKTAYD
------RSFPDKHVKRIHRALDSDDVELVRMLLKEARTNLDDAHALHYAVAYCDAKTTIE
------EKLLER-IGKILKALDSDDVELVKLLLTESDITLDQANGLHYSVVYSDPKVVAE
------DKSIER-TGKVLKALDSDDVELVKLLLTESDITLDQANGLHYAVAYSDPKVVTQ
------DPFREKRVRRIHKALDSDDVELVKLLLTESNISLDDANALHYAVAYCDPKVVSE
------DAVDEKSIKKIHMALDSDDVELVNRLLSESNITLDKAYALHYAAAYCDPKVVKE
HDLSAAADLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDEALALHYAVENCSREVVKA
HDLSVAQDLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDESLALHYAVESCSREVVKA
HDLTSTLDLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDESLALIYAVENCSREVVKA
2º ANTKYRIN
3er ANTKYRIN
4º ANTKYRIN

AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
314
313
312
310
301
236
306
302
303
296
LLKLDLADVNHRN-PRGYTVLHVAAMRKEPQLILSLLEKGASASEATLEGRTALMIAKQA
LLELELADVNLRN-PRGYTVLHVAAMRKEPKLIISLLMKGANILDTTLDGRTALVIVKRL
LLDLGLADVNHRN-SRGYTVLHIAAMRKEPKLIVSLLTKGARPSDLTPDGRKALQISKRL
ILALDMGDVNYRN-SRGYTVLHFAAMRREPSIIISLIDKGANASEFTSDGRSAVNILRRL
VLDLDMADVNFRN-SRGYTVLHIAAMRREPTIIIPLIQKGANASDFTFDGRSAVNICRRL
VLCLGLADVNLRN-SRGYTVLHIAAMRKEPSILVSLLTKGASASELTLDGQSSVNICRGL
LLRLGLADLSLRN-PRGLTVLHVAARRKEPSLLMALLTEGASVSGTTLDGQTAVAICRRL
LLELGAADVNFPAGPAGKTPLHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVRTVDGVTPLDILRTL
LLELGAADVNYPAGPAGKTPLHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVRTVGGITPLDILRTL
LLELGAADVNYPAGPTGKTALHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVQTVDGITPLDILRTL
4º ANTKYRIN
AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
373
372
371
369
360
295
365
362
363
356
TMAVECNNIPEQCKHSLKG--RLCVEILEQEDKREQI-PRDVPPSFAVAADELKMTLLDL
TKADDYKTSTEDGTPSLKG--GLCIEVLEHEQKLEYLSPIEASLSLPVTPEELRMRLLYY
TKAADYYNTTEEGKAAPKD--RLCVEILEQAERRDPL-LGEASLSLAKAGDDFRMKLLYL
TNPKDYHTKTAKGRESSKA--RLCIDILEREIRKNPMVL-DTPMCSISMPEDLQMRLLYL
TRPKDYHTKTSR-KEPSKY--RLCIDILEREIRRNPLVSGDTPTCSHSMPEDLQMRLLYL
TRPKDYHAKMEQGQETNKD--RICIDILEREMRRNPMAG-DVSMNSHTVADDLHMKLLYL
TRLKDYNKNIEQGQVSHKD--RICIGILEREMG-NSVSG-NVPISSPMNTDDLQRTLDYL
TSDFLFKGAVPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAALVISREE---AGSVNAPTSTAIYPPMSE
TSDFLFKGAVPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAAMVISREEGNNSNNQNNDNNTGIYPHMNE
TSDFLFKGAIPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAALVISREE---GNNNSNDNNTMIYPRMKD
los 4 dominios Ankyrin de la región N-terminal (Cao et al., 1997)
26
• la localización nuclear de la proteína NPR1 se señalan con una flecha ()
• y los relacionados con la interacción con TGA´s con un asterisco (),
•aquellos que intervienen en la transactivación con signo de mas ()
•aquellos que intervienen en la fosforilación con un punto negro ().

AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
TGA



489 EHQSRLKALSKTVELGKRFFPRCSAVLDQIM---NCEDLTQLACGEDDTAEKRLQKKQRY
489 KHLSRLRALCKTVELGKRYFKRCS--LDHFM---DTEDLNHLASVEEDTPEKRLQKKQRY
-----------------------------------------------------------484 RLLTRMVALMKTVETGRRFFPYGSEVLDKYMAEYIDDDILDDFHFEKGSTHERRLKRMRY
477 RMLTRMKALMKTVETGRRYFPSCYEVLDKYMDQYMDEEIPDMSYPEKGTVKERRQKRMRY
408 RLLSRVESLMKTVNMGRRFFPHCSEVLDR----FMEDDLPDLFYLEKGTPDEQRRKRTRF
540 RLQLQLQKLHKTVETGRRYFPHCSDVLDN---FLEDAEMPDSLFLEKGTPEEQKLKKRRF
470 TMYHHSHDF--------------------------------------------------481 TMYHHHHQHHF------------------------------------------------458 TMYHHHHHHF--------------------------------------------------
NLS

AtNPR1
AtNPR2
CpNPR1
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
CpNPR4
CpNPR5
AtNPR5
AtNPR6
546 MEIQETLKKAFSEDNLELGNSSLTDSTSSTSKSTGGKRSNRKLSHRRR-----------544 MELQETLMKTFSEDKEECGKS-------STPKPTSAVRSNRKLSHRRLKVDKRDFLKRPY
-----------------------------------------------------------544 RELKDDVQKAYSKDKESKIARSCLSASSSPSSSSIRDDLHNTT----------------537 NELKNDVKKAYSKDK---VARSCLSSSSP--ASSLREALENPT----------------464 MELKDDVQKAFIKDK---ARSSCSGLSSSSSSSSLKDAVT-------------------597 MELKEDVQKAFNKDME--NKRS-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
la señal de localización nuclear (NLS por sus siglas en inglés)
(Kinkema et al., 2000) que va de Lys537- Lys554.
27
Estructura tridimensional de NPR1
en papaya y arabidopsis
BTB/POZ
ANKYRIN REPEATS
AtNPR1
CpNPR1
Fig. 2 Predicted three-dimensional structure of BTB/POZ and ankyrin domains from papaya and Arabidopsis. The 3D models were
generated using the SWISS-model workspace (Bordoli et al. 2009).
aya
the
rap
only
Análisis filogenético
AAM62410 N.t.
ABG38308 C.a
AAT57637 L.e.
AAT57640 B.v.
XP 002281475 V.v.
CpNPR1C.p.
XP_002308281 P.t.
ABI93182 M.a.
ABL63913 M.a.
CAJ19095 H.v.
AP002537 O.s.
AtNPR1 A.t.
AtNPR2 A.t.
CpNPR4 C.p
XP_002300863 P.t
AtNPR3 A.t
AtNPR4 A.t.
AAT57642 H.a.
CpNPR3 C.p.
ABK62792 P.p.
ACJ45013 G.m.
ACJ45015 G.m.
XP_001757508 P.p.
XP_001759240 P.p.
ABE11621 O.s.
AtNPR6 A.t.
XP_002308905 P.t.
XP_002323261 P.t.
AtNPR5 A.t.
CpNPR5 C.p.
Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree of papaya
NPR1 homol ogues (black circles). Numbers on the
branches indicate the percentage of 1000 bootstrap
replications supporting the particular nodes and only
those with >50% support are shown.
29
.
MISMA FUNCION
EN PAPAYA?
Reguladores
negativos de la
SAR
Zhang et al., 2006
The plant Journal, Vol.48
647–656
AtNPR3
AtNPR4
CpNPR3
Clado1
CpNPR4
AtNPR2
AtNPR1
Clado2
CpNPR1
AtNPR5
CpNPR5
Clado3
Regulador
positivo de la
SAR
Cao et al. 1997
Cell, Vol. 88
57–63
AtNPR6
Desarrollo
Hepworth et al, 2005.
The Plant Cell, Vol. 17,
1434–1448
Expresión basal de las 4 secuencias tipo NPR1 de
papaya en diferentes tejidos
31
Cambios en la expresión de
CpNPR1 en respuesta a SA
32
Sobre-expresión del gen
candidato (NPR1) en callos
embriogénicos de papaya
Avances
33
DESARROLLAMOS UN PROTOCOLO DE EMBRIOGENESIS
SOMATICA EFICIENTE
A
E
H
B
C
D
F
G
I
J
INTEGRACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN
35S::AlcR::GUS EN Agrobacterium tumefaciens
Fragmentos esperados para los productos de
la doble digestión con HindIII y EcoRI de los
plásmidos pRB35SAlcRGUS y pB35SAlcR.
Gel de los productos de PCR para el cassette de
expresión 35S::AlcR::GUS y el control positivo el
gen uidA (GUSPlus) que presentaron una banda
única de 1200 pb
35
TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EN
hojas DE PAPAYA MARADOL
Expresión transitoria de uidA
(GUSPlus) en hojas (con
peciolo) de plántulas de
papaya
Maradol
de
aproximadamente 21 días de
edad
provenientes
de
invernadero
Controles negativos hojas y
tallos de plantas de papaya
Maradol no transformadas,
controles positivos hojas de
N. tabaccum transformadas
de forma estable con el gen
reportero uidA (GUSPlus)
I con infiltración al vacío,
N sin infiltración al vacío.
36
TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA DE CALLOS
DE PAPAYA MARADOL
Expresión transitoria de
uidA en callos no
embriogénicos
de
papaya Maradol.
I con infiltración al
vacío,
N sin infiltración al
vacío.
Controles negativos
callos
de
papaya
Maradol
no
transformados,
Controles
positivos
hojas de N. tabaccum
transformadas
de
forma estable con el
gen reportero uidA
(GUSPlus)
37
EXPRESION DE pRB35SAlcRGUS REGULADA POR ETANOL
EN CELULAS EN SUSPENSIÖN DE PAPAYA MARADOL
┼E
┼
┼E
┼
┼
a) callos embriogénicos de papaya
Maradol en suspensión en
medio líquido MS al 50% con 10
mg mL-1 de 2,4-D b) callos
embriogénicos
transformados
con
el
plásmido
pRB35SAlcRGUS en medio MS
al
100%
c)
vista
al
estereomicroscopio de callos
transformados con el plásmido
pRB35SAlcRGUS inducidos con
etanol
d) e) y f) controles positivos, callos
transformados con el plásmido
pCAMBIA 1305.1 f) vista al
estereomicroscopio
control
positivo inducido con etanol,
g) y h) controles negativos, callos
transformados con el plásmido
pRB35SAlcR
i) y j) controles negativos, callos sin
transformar
E inducido con etanol,
39
S no inducidos con etanol.
EXPRESION DE pRB35SAlcRGUS REGULADA POR
ETANOL EN CALLOS TRANSFORMADOS DE
PAPAYA MARADOL
Callos no embriogénicos de papaya maradol transformados transitoriamente con el plásmido
pRB35SAlcRGUS. Callo no inducido (concentración de etanol 0.0 % v/v) y callos inducidos con
diferentes concentraciones de etanol
40
Conclusiones
1. Se encontraron 4 secuencias tipo NPR1 en el
genoma de C papaya.
2. Tienen alta homología con las 6 secuencias
reportadas en A thaliana
3. Filogenéticamente, al menos una secuencia de C
papaya se agrupa en los mismos 3 clados en los
que se agrupan las de A thaliana
4. Las 4 secuencias presentan expresión basal en
diferentes tejidos de plantas comerciales de C
papaya variedad maradol
5. NPR1 aumenta su expresión al ser retada con SA
41
Trabajo en progreso
• Sobrexpresar NPR1, con el sistema inducible
por etanol, en papaya y evaluar si los frutos de
plantas que sobrexpresen el gen, al ser
tratados con vapores de etanol, aumentan su
resistencia a patógenos como Colletotrichum
gloesporioides, disminuyendo las pérdidas por
antrcnosis
• Nos interesa sobre-expresar el gen NPR1 para que
active la respuesta sistémica adquirida (SAR) de
manera temporal. Simulando lo que ocurre de
manera natural en el momento mas vulnerable a
antracnosis del fruto.
• Hay que tomar en cuenta que el gen NPR1 se
expresa de manera basal en papaya, la hipótesis es
que un aumento en su expresión, conducirá a la
activación de SAR aumentando su resistencia a
antracnosis
43
Transformar embriones somáticos con
NPR1 y TGA (con el sitema Alc) y regenerar
plantas
a)
Embrión
cigótico original,
b y c) al 5 día d)
a los 15 días e) a
los 30 días,
b) f)
71
días
posteriores a la
siembra inicial
g) a los 86 días
h)
estructuras
verdes
y
elongadas a los
142 días
i) explantes con
raíz, hojas y tallo
visibles a los 145
días j) a los 157 días
k) a los 164 días.
44
Los frutos de aquellas plantas que sobrexpresen NPR1, se
retarán con esporas del hongo Colletotrichum gloeosporoides
para definir si aumentó su resistencia a antracnosis
DIA CERO
Transformados
DIA NUEVE
Sin transformar
Escala: 30 cm
Comentario Final
De comprobarse que los frutos de papaya que sobre-expresen
NPR1 confieren resistencia a antracnosis, el presente
proyecto puede tener un gran impacto.
Loa anterior, debido a que el transgen no se expresará en el
campo de cultivo, sino que sólo se expresará en la
empacadora, cuando los frutos cosechados sean expuestos a
vapores de etanol.
46
Parte de los resultados del presente proyecto fueron
publicados recientemente en: Genes and Genomics,
2012
47
También publicamos este año la caracterización la
familia de un factor de transcripción ligado a NPR1
(TGA de C. papaya) que puede ser buen candidato
para transformar. PPB, Enero (2012).
• .
48
Productos del proyecto
•
•
•
•
1 tesis de doctorado
2 tesis de maestría en Ciencias
2 Publicaciones Internacionales
1 posible patente
49
El equipo…
Jorge M. Santamaría, Virginia Herrera-Valencia, Gabriela Fuentes, Mariana
Menéndez, Fabio Idrovo, Miguel Angel Vallejo-Reyna, Santy Peraza-Echeverría
AGRADECIMIENTOS
MC. Anabel Solís. Lab. De Fisiología Molecular y
Personal del Lab.Fitopatología Molecular y Biotecnología de
Cultivos Tropicales, por apoyo técnico en el mantenimiento
de callos embriogénicos
Sr. José Arjona, “Rancho Alegre” por donar material de
papaya para los trabajos de expresión
CONACYT por el financiamiento al presente proyecto
CB 83829
Becas por el financiamiento de las becas PNPC a
FI y MMC
51