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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ Silenciamiento génico para el control del hongo causal de escoba de bruja Ana Cristina Caribé dos Santos, DSc Guayaquil 25 a 28 de agosto, 2014 QUE ES RNAi Conjunto de procesos mediados por pequeños RNAs regulatorios conservado entre eucariotas Protege el genoma de patógenos y transposones Regula el programa celular de expresión génica y desenvolvimiento Previene el acumulo de mRNAs não funcionales COMO FUNCIONA APLICACIONES DE RNAi EN LA CIENCIA Estudio funcional de genes Defensa contra patógenos Control de la expresión génica experimentalmente POR QUE UTILIZAR RNAi VENTAJAS PTGS Degradación del mRNA, por tanto, no altera la estructura del gen endógeno Su eficiencia no es comprometida por la presencia de núcleos no transformados o de genes POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS Silenciamiento de alta especificidad Silenciamiento simultáneo de secuencias conservadas (familias multigénicas) POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS Silenciamiento sistémico Plamodesmatas Diliporo Proteínas transmembranas Plantas Basidiomicetos C. elegans POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS Amplificación del silenciamiento LO QUE YÁ HICIMOS Determinación de la operacionalidad del silenciamiento génico por RNAi en M. perniciosa, usando o gen gfp, como modelo PROYECTO DE SECUENCIAMIENTO DEL GENOMA DE Moniliophthora perniciosa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura) Cerca de 39 Mbp y 14.000 genes predichos Secuencias identificadas en el banco de dados del genoma de M. perniciosa que tienen homología con genes vinculados al mecanismo de RNAi Gene Organismo c/ homologia Proteína Valor E Qde-1 N. crassa RdRP 2e-04 QDE3 N. crassa qde-3 6e-15 (RecQ DNAhelicase) CAF Arabidopsis CAF 3e-12 (endoribonuclease dicer homolog) SDE3 Arabdopsis RNA helicase 4e-24 Producción de una linaje transgénica de M. perniciosa que expresa el gen heterólogo gfp Vector usado en la transformación de M. perniciosa hph pHSP70-SG (Spellig et al. 1996) Dra. Regine Kahmann, Munchen, Germany Transfixión del vector pHSP70-SG para protoplastos de M. perniciosa por el método PEG/CaCl2 B A C D E A. Protoplastos, micrografía de fase de contraste 400X. B Hifa parecida con tubo de germinación saliendo directamente de una simple célula esférica. C e D. Algunos protoplastos agregados en el proceso de regeneración, contribuyendo para la formación de micelio. E. Desenvolvimiento de hifas en un estado mas avanzado. Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp Expresión de gfp - linajes control y transformante Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp Expresión de gfp – linaje transformante Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp Expresión de gfp – linaje transformante SILENCIAMIENTO DEL GEN gfp POR RNAi Estrategia para síntesis de dsRNAs lacZ ddt ddt T7 promoter gfp sense NcoI MCS EcoRI lacZ ddt MCS EcoRI MCS gfp antisense NcoI ddt T7 promoter MCS Plasmid Template - Estrategia para obtención de gfp (Plasmid Template) en las orientaciones senso y antisenso para síntesis de gfpdsRNAs, usando o MEGAscript RNAi Kit transcription reaction. Silenciamiento del gen repórter gfp por RNAi A CT . T1 B T3. T2 T4 T5. T6 Diagnóstico del silenciamiento usando RT-qPCR. Expresión relativa de gfp en linajes transgénicas de M. perniciosa tratadas con gfpdsRNA (51 – 97%). LO QUE YÁ HICIMOS Silenciamiento de genes endógenos de M. perniciosa por RNAi, visando análisis funcional SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyD DE M. perniciosa POR RNAi PARA ESTUDIO FUNCIONAL SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd Estrategia para síntesis de dsRNAs lacZ MpHYD3 antisense T7 promoter SalI SalI SalI SalI MCS lacZ T7 promoter MCS MpHYD3 sense Sp6 MCS Sp6 SalI SalI MCS Plasmid Template - Estrategia para obtención de MpHyd en las orientaciones senso y antisenso para la síntesis de MpHyddsRNAs usando o MEGAscript RNAi Kit transcription reaction. SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd 2,0 Expresión relativa de MpHyd en linajes control y tratadas con MpHyddsRNA vía PEG/CaCl2 (18 a 97%) 1,0 0,5 Hd5 Hd5 Hd5 Hd5 Hd5 Hd4 Hd4 Hd4 Hd4 Hd4 Hd2 Hd2 Hd2 Hd2 Hd2 Hd1 Hd1 0,0 Hd1 Hd1 Hd1 RQ 1,5 CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CP T1 T2 H3T10 Lines M. perniciosa SILENCIAMENTO DO GENE MpHyd 2,0 RQ 1,5 1,0 0,5 Hd5 Hd5 Hd5 Hd5 Hd4 Hd4 Hd4 Hd4 Hd2 Hd2 Hd2 Hd2 Hd1 Hd1 Hd1 Hd1 0,0 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 Lines M. perniciosa Expresión relativa de MpHyd en linajes control y tratadas con Fenotipo MpHyddsRNA vía electroporación (89 a 97%) SILENCIAMENTO DO GENE MpPrix1 POR RNAi Estrategia para síntesis de dsRNAs T7 PDNR-LIB MpPRIX1 sense MpPRIX1 MpPRIX1 antisense PDNR-LIB T7 Estrategia para obtener MpPrix1 (PCR Template) en las orientaciones senso y antisenso para síntesis de MpPrix1dsRNAs, usando MEGAscript RNAi Kit transcription reaction. Silenciamiento del gen MpPrix1 por RNAi Expresión relativa de MpPrix1 en linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA (23 a 87%). Actividad de la enzima 1 cys-peroxidase en linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA Curva de sobrevivencia de linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA expuestas a H2O2 LO QUE ESTAMOS HACIENDO Proyecto “Rede Cacau Renorbio – Vassoura de Bruxa” Proyecto interinstitucional (FINEP, FUNPAB, CEPLAC, UESC, CENA-USP, CENERGEN-EMBRAPA, UNICAMP) Coordinador: Dr. José Luis Pires (CEPLAC) Vice-coordinador: Dr. Raúl René Valle (CEPLAC) Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi Coordinadora: Dra. Ana Cristina Caribé (UESC) Investigadores: Dres. Raúl René Valle (CEPLAC), Carlos Pirovani (UESC); Dras. Karina Gramacho (CEPLAC), Acássia Pires (UESC), Virginia Soares (UESC), Fátima Alvim (UESC) Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopa-tógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi Producir biofungicida a base de moléculas de RNA duplo filamento (dsRNAs) homólogos a genes esenciales a procesos relacionados al desenvolvimiento patogenicidad de M. perniciosa y Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi Acción de Pesquisa 1. Realizar identificación y silenciamiento por RNAi de genes de M. perniciosa esenciales a: infección, crecimiento, nutrición, reproducción y patogenicidad Genes candidatos a silenciamiento por el método dsRNA. Gen Organismos Función probable Síntesis de quitina - pared Sintase de quitina (CHS3) Pleurotus, Agaricus celular de fungos Laccaria, Coprinopsis Formación de septos Septina (SEP/CDC/SPR) Trehalose fosfato sintase Síntesis de trehalose - azúcar Pleurotus, Grifola (TPS1/TPS2) que regula turgencia. Previene la acumulación de Aspergillus Catalasa (CTA1/CTT1) niveles tóxicos de H2O2 Moniliolisinas (Mp-AaPri1 Pleurotus, Agrocybe Formación del hongo e MpPri2) Coprinopsis, Postia Glucanasa (EGT) Degradación de celulosa Formación de película Coprinopsis, Hidrofobinas (CoH1) hidrofóbica en la superficie Lentinula de hifas Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo 1. Síntesis de microesferas de quitosana: Síntesis de microesferas de quitosana utilizando el método de coacervación (ARAL et al., 2000; BERTHOLD et al., 1996). 2. Síntesis de liposomas: Síntesis de vesículas unilamelares grandes (LUVs), a partir de la extrusión de la dispersión lipídica del lipidio catiónico bromato de dioctadecildimetilamonio (DODAB) en solución acuosa conteniendo el dsRNA albo. Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo 3. Síntesis de cápsides virales: técnica de VIGS (vírus-induced gene silencing) Vectores virales - El genoma viral será modificado removiendo genes de patogenicidad y insiriendo genes o secuencias que codifiquen moléculas de dsRNA correspondientes a los albos a ser silenciados Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopatógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de dsRNAs homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento o patogenicidad de M. perniciosa Producción de la formulación del biofungicida, suspensión concentrada(SC) Establecimiento del procedimiento para aplicación del biofungicida a base de dsRNAs: por aspersión o inyección (concentración del fungicida; equipo para aplicación; período y condiciones climáticas para aplicación, etc.) Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de dsRNAs homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento o patogenicidad de M. perniciosa Prueba de eficiencia del fungicida en invernadero con clones de cacao con padrones de resistencia y susceptibilidad e inoculados con basiodiosporas de M. perniciosa (1,0X105 basiodiosporas viables/mL) Observación y análisis del desenvolvimiento del hongo y síntomas producidos GRACIAS