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Mecanismos de apoptosis producidos por el Malatión en
Ovocitos de Sus scrofa madurados in vitro
Zayil Salazar Campos*1, Alejandro Domínguez Campuzano1, Patricia López Arellano1, Miguel
Betancourt Rule1, Humberto González-Márquez1, Yvonne Ducolomb Ramírez1, Eduardo Casas
Hernández1, Edmundo Bonilla González 1
1
*
+
Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, Av. San
Rafael Atlixco 186, Col Vicentina, Iztapalapa. México D.F. C.P. 09340.
Zayil Salazar Campos.
Edmundo Bonilla González; Tel.: +01-55-5804-6557; Fax: +01-55-5804-4729 Laboratorio de
expresión génica. Departamento Ciencias de la Salud. UAM-Iztpalapa
Área del Conocimiento: Mecanismos de Toxicidad
Resumen en Español: La maduración in vitro de óvulos (MIV) es una rutina en los laboratorios
de producción in vitro de embriones. La sobrevivencia de los embriones depende de la calidad del
óvulo, por lo que el origen y medio en el que los ovocitos crecen y maduran son factores
determinantes para su desarrollo. Si un ovocito se compromete en un proceso apoptótico
seguramente no presentará desarrollo embrionario. Entre los principales insecticidas usados en
nuestro país se encuentra el Malatión, el cual se ha demostrado que a dosis no colinérigas puede
inducir cambios en la expresión de genes nucleares y mitocondriales. El objetivo de este trabajo
fue determinar si el Malatión induce apoptosis durante la MIV mediante la tinción con Anexina V
y el análisis de expresión de los genes de Bax, y Bcl-XL. Los resultados mostraron que la dosis a
la cual se produce el 50% de óvulos positivos a la Anexina V fue de 470μM, resultado que
coincide con la dosis previamente reportada para la inhibición de la fertilización. Los óvulos
expuestos al Malatión expresaron al gen antiapoptótico Bcl-XL mientras que no lo hicieron con el
gen proapoptótico Bax. Esto último puede deberse a la respuesta a un agente estresante en la que
Bcl-XL se expresa para interrumpir o evitar la expresión de Bax tal como se ha visto en otros
estudios. Es necesario hacer una caracterización completa de las vías de activación y de los
efectores de la apoptosis en óvulos durante la maduración incluyendo la expresión de otros genes
proapoptóticos y efectores.
Palabras Clave: Apoptosis; Malatión; IVM; Ovocitos
Resumen en Inglés: In vitro maturation has become a routine in various studies and reproduction
technologies for in vitro embryo production of livestock species. It is well established that oocyte
quality determines the embryo’s developmental potential after fertilization therefore the
environmental conditions on which an oocyte grows and mature are essential for its competence
and further development as an embryo. Malathion is one of the more frequently used
organophosphorothioate insecticides in México and Central America. At noncholinergic doses,
Malathion has shown deregulate the expression of nuclear and mitocondrial genes in mammal
oocytes and embryos and also has been implicated in the apoptosis of cells in vitro cultured. The
aim of this work was to evaluate by Annexin V binding, and the expression of Bax and Bcl-XL
genes if during oocyte in vitro maturation, Malathion can elicit apoptosis. The apoptotic dose
(AP50) determined by Annexin V binding was 475μM and correlates with the dose of inhibition
of fertilization previously reported. However, Oocytes exposed to Malathion did not express the
proapoptotic Bax gene. This could be explained by the over-expression of Bcl-XL gene to nullify
the expression product of Bax as previously reported. Nevertheless to identify the process by
which Malathion exerts apoptosis is necessary a broader characterization of the genes implied in
the apoptotic pathways
Keywords: Apoptosis; Malathion; Oocytes; IVM
1. Introducción
En México como en otros países de América Latina, África e incluso Estados Unidos el
insecticida Malatión es usado extensivamente en labores agrícolas y domésticas [1]. La razón por la
que este organofosforado es ampliamente usado se debe a su relativa baja toxicidad en los mamíferos,
alta selectividad con los insectos y moderada persistencia en el ambiente [2].
Sin embargo, se ha comprobado que a dosis no colinérgicas, el Malatión afecta rutas bioquímicas que
no involucran la participación de la acetil colinesterasa [3]. Por ejemplo, provoca aberraciones
cromosómicas [4], estrés oxidativo e inmunotoxicidad [5] y participa como inductor de la apoptosis en
células cultivadas in vitro [3, 6].
En los ovocitos de mamíferos, la regulación de la apoptosis durante la maduración es crucial para su
sobrevivencia y el posterior desarrollo embrionario. La apoptosis es un proceso en el que las células
mueren siguiendo un patrón definido y evitando la respuesta inflamatoria del organismo. Puede
iniciarse por la vía intrínseca, regulada por el complejo BCL-2, también conocida como la ruta
mitocondrial debido al papel que este organelo juega en el proceso, y es estrictamente controlada por la
familia de proteínas del grupo BCL-2 que conducen a la activación de la caspasa 9. La ruta extrínseca
es disparada por la unión a los receptores celulares de la familia del TNF los cuales contienen un
dominio intracelular que puede reclutar y activar la caspasa 8. Este reclutamiento causa la subsecuente
activación en cascadas de las caspasas 3 6 y 7 sin que las proteínas BCL-2 estén involucradas. En
algunas células la ruta extrínseca puede coincidir o intersectar la ruta intrínseca a través de la
activación de la caspasa 8 mediante la proteína pro-apoptótica del grupo BH3, BID. Cuando BID
carece de su extremo carboxi (tBID), se trasloca a la mitocondria y promueve la activación de caspasas
(caspasa 9, y las caspasas efectoras 3, 6 y 7) a través de la activación de la ruta intrínseca. En estas
situaciones, la perdida de BID o la sobre-expresion de BCL-XL inhibe la apoptosis [7].
Actualmente se investiga sobre el efecto que este plaguicida puede tener en la salud reproductiva de
los mamíferos ya que cambia la permeabilidad de la membrana mitocondrial, disminuye la
concentración de espermatozoides y afecta la expresión de genes mitocondriales de ovocitos y
embriones cultivados in vitro [8, 9].
El objetivo de este trabajo fue determinar si el Malatión produce apoptosis en ovocitos porcinos
expuestos a este pesticida durante su maduración in vitro y determinar si la apoptosis sucede por la vía
intrínseca.
2. Materiales y Métodos
Reactivos
El Malatión utilizado de fórumla comercial emulsionado en agua. La solución stock se preparó al
10mM y de ahí se prepararó una disolución 1mM en medio de maduración para preparar las
concentraciones y diluciones respectivas (100, 200, 350 y 500M)
Maduración in vitro.
El siguiente método es una modificación al método de Abeydeera et al. [10] Se colectaron ovarios de
hembras de Sus scrofa y fueron transportados al laboratorio en una solución salina (NaCl al 0.9%,
Penicilina-G Potásica 75 ug/ml, y sulfato de estreptomicina 50 ug/ml) a temperatura ambiente. Los
ovocitos se recuperaron a partir de folículos de 3 a 6 mm de diámetro a través de aspiraciones
sucesivas con jeringa de 5 ml y aguja de 18G X 38 mm. Bajo el microscopio se seleccionaron aquéllos
ovocitos que aparecían rodeados por una masa folicular compacta y presentaran un citoplasma granular
regular. Estos ovocitos fueron lavados 3 veces en medio de maduración TCM-199 con Bicarbonato y
sales de Earle (In Vitro México) suplementado con PVA 0.1%, Glucosa 3.05mM y Piruvato de sodio
0.91mM, cisteina 0.57mM y EGF Factor de crecimiento epidérmico10ng/ml) para posteriormente
colocar de 40 a 50 ovocitos por caja en una gota de 500ul con el mismo medio y suplementado con las
hormonas Folículo estimulante y Luteinizante (FSH y LH), este medio previamente es cubierto con
aceite mineral y equilibrado con CO2 al 5% en una incubadora a 38.5oC y humedad a saturación. Para
que la maduración de los ovocitos seleccionados suceda, se dejan pasar de 44 a 48 horas en incubación
bajo las condiciones anteriormente mencionadas.
Tinción con Anexina V
Los ovocitos madurados en las distintas condiciones fueron denudados y lavados 3 veces en una
solución de PBS antes de ser teñidos con el Kit Annexin-V- Fluos Staining Kit (Roche) de acuerdo a
las instrucciones del fabricante y visualizados en el microscopio de fluorescencia (Zeiss HBO 50) a
una frecuencia de 360nm. El conteo se realizó considerando células verdes como no apoptóticas,
células verde fluorescente apoptóticas y rojas como necróticas.
Extracción del RNA
Se realizó con el kit SV Total RNA Isolation System (Promega) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. El RNA obtenido de cada muestra fue concentrado mediante la adición de acetato de sodio
pH5 0.3M, y 2 volúmenes de Etanol absoluto. Cada muestra fue resuspendida en 30 l de agua libre de
RNAsas
RT-PCR
El RNA fue cuantificado y amplificado mediante la generación de hebra sencilla de cDNA usando la
retrotranscriptasa reversa SuperScript II RT (Invitrogen) y Random Primers siguiendo las
instrucciones del fabricante.
PCR
La secuencia de los primers amplificados fue la siguiente:
Gen
Secuencia de cebadores
Tº
Producto de amplificación
Bcl-XL
F: 5'- GAAACCCCTAGTGCCATCAA- 3'
60
190
55
150
55
130
R: 5'-GGGACGTCAGGTCACTGAAT- 3'
BAX
F: 5'-GGCACAAATCTGATGATGTTTGCA- 3'
R: 5'-GGTTCTTTCCCTTAGTGAAAGC- 3'
H2A
F: 5' -TGCGAGTCTTCTTGTTGTCG- 3'
R: 5'-AGTTTCCTGTGGGTCGAGTG- 3'
Las muestras de cDNA se amplificaron para los cebadores respectivos en una reacción final de 20l
(Tris-HCl 1mM, KCl 50mM, MgCl2 2.5mM, Cebadores 1M cada uno, Taq 2U) cDNA 1l. Un ciclo
a 95º seguido de 45 ciclos a 95º 30s, 55º/60º 1 min, 72º 1min, y un ciclo final de 72º 5 minutos. Los
productos de amplificación se corrieron en un gel de agarosa al 2% y se tiñeron con Bromuro de
Etidio.
3. Resultados
Tinción con Anexina para determinar la concentración de Malatión que causa el 50% de ovocitos en
apoptosis (DA50).
Figura 1. a) Ovocitos control, madurados y denudados (10X) b) Ovocitos control, madurados y
denudados teñidos con Anexina (10X) c) Ovocitos Malatión 500M teñidos con Anexina (40X)
los verdes color claro son apoptóticos y los rojos corresponde a los necróticos.
Cuadro1. Determinación de la dosis apoptosis 50 (DA50) del Malatión durante la maduración in vitro
de ovocitos mediante la tinción Anexina V y su observación y registro en el microscopio de
fluorescencia. n=3
Malatión (M)
Vivos (%)
Apoptóticos (%)
Necróticos (%)
0
100
97.6
89.4
2.37
7.7
2.37
2.9
200
350
500
77.8
81.1
45.2
14.5
18.9
48.8
9.8
0
6
Figura 2. Los ovocitos fueron madurados in vitro (MIV) en presencia de diferentes
concentraciones de Malatión (0, 100, 200, 350 y 500M). Mediante una regresión lineal se
determinó que la DA50 es 475uM de Malatión
Amplificación del cDNA
Figura 3. Amplificación de los genes H2A consitutivo, Bcl-XL antiapoptótico y Bax
proapoptótico.a partir del cDNA de las muestras. 1) cDNA obtenido de Hígado de cerdo 2)
cDNA obtenido de ovocitos control 3) cDNA obtenido de ovocitos expuestos a Malatión 475M
.
4. Discusión
En este estudio se analizó el efecto del Malatión como posible inductor de la apoptosis en ovocitos
cultivados in vitro, ya que trabajos previos han reportado que este insecticida afecta la transcripción de
genes mitocondriales durante la gametogénesis y desarrollo embrionario de mamíferos [8, 9]. Las
concentraciones usadas en este trabajo son comparables a las que se han encontrado en sangre después
de exposiciones no tóxicas al plaguicida [6, 11].
La tinción con Anexina V ha demostrado ser una técnica confiable en la detección de células en
apoptosis ya que existen experimentos que demuestran la correlación entre cambio o rompimiento del
potencial de membrana con la tinción de células mediante este marcador [12]. De acuerdo a los
resultados obtenidos mediante la tinción con Anexina V (Tabla1, y figura1), el porcentaje de células en
apoptosis es dependiente de la concentración de Malation. Aunque las concentraciones reportadas en
este trabajo son mayores a los reportados en otros trabajos, células mononucleares (0-100M) y
fibroblastos (0.001- 120M) [3, 6] coinciden en la tendencia de las células expuestas al plaguicida, en
presentar un comportamiento donde la apoptosis es dependiente del tiempo y la dosis de exposición al
plaguicida. Es posible que en los ovocitos las concentraciones requeridas de Malatión para provocar el
50% de células en apoptosis sea más alta que la reportada en otras células debido a que el ovocito se
encuentra rodeado por capas sucesivas de células del cumulus las cuales pueden estar amortiguando el
efecto del plaguicida.
Se determinó que la concentración a la cual el Malatión provoca la apoptosis del 50% de los ovocitos
cultivados in vitro es de 475M (DA50), resultado que coincide con la dosis de inhibición de la
fertilización in vitro (443M) previamente reportada por Ducolomb et al. [13].
Por otra parte, cuando se amplificaron los genes de apoptosis Bcl-Xl y Bax a partir del cDNA obtenido
de los ovocitos madurados in vitro, se obtuvo la señal del gen constitutivo de la histona H2A y del gen
antiapoptótico Bcl-Xl en ambas condiciones, es decir ovocitos control y ovocitos expuestos a la DA 50
de Malatión. Contrario a lo esperado, no fue posible obtener señal de expresión de Bax en los ovocitos
expuestos al organofosforado. Aunque los resultados presentados en otros trabajos señalan que a dosis
no colinérgicas el Malatión provoca la apoptosis [3, 6], no mencionan mediante que ruta se dispara el
proceso, en un caso miden caspasa 9 además de la degradación del DNA [6] lo que sugiere que el
Malatión induce la apoptosis mediante la ruta intrínseca. No existen sin embargo, estudios
preliminares que indiquen mediante que ruta el Malatión inicia la apoptosis.
Estudios previos han reportado el aumento de la expresión del RNAm de Bax y de la proteína BAX en
ovocitos madurados en estrés antes de ser eliminados por apoptosis [14]. Por otro lado, ovocitos de
rata adulta tratados con doxorubicina, un anticarígeno, mostraron un aumento en la expresión de BclXL con la subsecuente supresión de Bax [15]. Es posible que los ovocitos tratados con Malatión hayan
recurrido a una sobreexpresión del gen antiapoptótico Bcl-XL para inactivar el efecto de su contraparte,
el producto de Bax, por lo que, sólo es posible ver la expresión Bcl-XL.
Sin embargo, se ha reportado la expresión de BAD en ovocitos obtenidos de ratas adultas maduras
antes de ser eliminados por apoptosis [16]. Por lo anterior, es posible que la apoptosis de los ovocitos
expuestos a Malatión sea disparada por alguna de las proteínas del grupo BH3 (BAD, BID y/o BIM),
las cuales inician la señalización de apoptosis cuando hay estrés celular mediante la unión e
inactivación de las proteínas BCL2 y BCL-X, o bien mediante la unión y activación de las proteínas
BAX o BAK.
5. Conclusiones
El Malatión produce apoptosis en ovocitos madurado in vitro expuestos a este plaguicida. Sin
embargo, es necesario hacer una caracterización completa de las vías de activación y de los efectores
incluyendo la expresión de otros genes pro-apoptóticos y efectores para determinar mediante qué ruta
el Malatión inicia la apoptosis.
Agradecimientos
Citas
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