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ESTUDIO CLÍNICO Y MOLECULAR DEL SÍNDROME FXTAS (FRAGILE X TREMOR ATAXIA SYNDROME) Investigadora principal: Dra. Montserrat Milà Recasens Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Duración: 3 años 1 1. Resumen El síndrome del cromosoma X frágil (FXS) representa la causa más común de retraso mental (RM) hereditario. El síndrome está causado por la ausencia de la proteína FMRP como consecuencia de una mutación dinámica, la expansión de un triplete CGG en el primer exón del gen FMR1. Hasta hace poco, se creía que los portadores de la premutación (50<CGG<200) eran completamente asintomáticos, ya que no presentan RM. En los últimos años, sin embargo, se han asociado dos patologías a este estado de portador: fallo ovárico prematuro (POF), que afecta a un 20% de las mujeres portadoras de la premutación, y un nuevo tipo de ataxia. Esta última afectación ha sido recientemente descrita como un nuevo síndrome neurodegenerativo progresivo: síndrome de ataxia y temblor asociado al cromosoma X frágil (FXTAS). FXTAS afecta a hombres y mujeres portadores de la premutación de más de 50 años. Clínicamente se caracteriza por temblor de acción, problemas de equilibrio y demencia. El objetivo principal de este proyecto es el estudio integral (clínico, molecular y epidemiológico) de FXTAS en nuestra población. Para ello se propone: 1) estudio del triplete CGG y de la metilación del gen FMR1 mediante PCR y Southern blot (sonda Stb 12.3); 2) expresión del gen FMR1 mediante cuantificación del mRNA en sangre periférica y por RT-PCR; 3) determinación de los niveles de FMRP en raíz de cabello por inmunohistoquímica; 4) estudio neurológico (ICARS y de la UPDRS); 5) resonancia magnética; 6) análisis de todos los resultados obtenidos. 2. Resultados 1. Caracterización molecular del gen FMR1 en familias SXF: el estudio de 128 familiares no portadores y portadores premutación y mutación completa de SFX ha permitido determinar los valores medios de mRNA y proteína que quedan resumidos en la tabla 1. 2 Tabla 1 N mRNA FMR1 rango proteína rango FMRP Normal 21 1,10 (0,88- 95% (80-100) 80% (70-100) 5% (0-12) 54% (8-93) 1,42) Portador 102 1,78 (0,905,28) Afectado 2 0 Afectada 3 0,65 (0,540,98) 2. Caracterización molecular del gen FMR1 en individuos FXTAS y noFXTAS: la caracterización molecular del gen FMR1 en los individuos portadores de la premutación (FXTAS y no-FXTAS) no ha permitido detectar diferencias estadísticamente significativas (tabla 2). Tabla 2 Sexo Edad CGGn mRNA FMR1 %FMRP FXTAS mujeres 68,1±12,8 101,7±33,9 1,7±0,6 82,3±10,9 No-FXTAS mujeres 57±7,5 89,7±40,2 1,4±0,4 84,3±11,9 P value - - 0,5 0,2 0,7 FXTAS hombres 67,5±4,6 88,5±23,8 1,8±0,7 84,9±12,4 No-FXTAS hombres 61±9,5 107,3±64,5 1,75±1 94±8,5 P value - - 0,5 0,8 0,4 - En el grupo de portadores de la premutación (FXTAS y no-FXTAS) se ha observado una correlación entre los niveles reducidos de proteína FMRP y los niveles elevados de mRNA FMR1 (figura 1). - En el grupo de portadores de la premutación (FXTAS y no-FXTAS) se ha observado que los niveles de FMRP disminuyen a medida que se incrementa el número de repeticiones CGG (figura 2). - En el grupo de portadores de la premutación (FXTAS y no-FXTAS) se ha observado que el incremento de la actividad transcripcional del gen FMR1 se correlaciona positivamente con el tamaño de la expansión (figura 3). 3 % FMRP 100 % FMRP 120 100 80 60 CGG repeat 210 120 80 60 40 40 20 20 190 170 150 130 110 90 70 0 0 0 1 2 3 4 50 5 70 90 110 130 150 170 190 210 50 0 CGG repeat FMR1 mRNA levels 1 2 3 4 5 FM R1 mRNA levels Figura 1. Correlación de los niveles de FMRP y mRNA FMR1 en el rango de la premutación. Figura 2. Correlación de los niveles de FMRP y expansión tripletes CGG en el rango de la premutación. Figura 3. Correlación de los niveles de mRNA FMR1 y expansión tripletes CGG en el rango de la premutación. - Al comparar la edad de presentación de FXTAS con el número de repeticiones CGG se detecta una correlación negativa (figura 4). - Al comparar la edad de presentación de FXTAS con los niveles de mRNA FMR1 se detecta una correlación negativa (figura 5). - No se ha podido determinar si existe correlación entre la edad de la muerte de los pacientes FXTAS y el número de repeticiones CGG, ya que tan solo dos individuos han muerto durante el estudio. Aunque estos dos pacientes han muerto a la edad de 82 y 79 años, con un número de repeticiones de 80 y 60, respectivamente. 85 85 Age of onset Age of onset 80 Spearman ’s rho = -0.2 p=0.4 80 Spearman ’s rho = -0.432 p=0.1 75 70 65 75 70 65 60 60 55 55 50 50 50 70 90 110 CGG repeat 130 150 170 1 1,5 2 2,5 3 3,5 FMR1 mRNA levels Figura 4. Correlación entre edad de presentación de FXTAS y expansión CGG. Figura 5. Correlación entre edad de presentación de FXTAS y niveles de mRNA de FMR1. 3. Caracterización neurológica FXTAS. La caracterización neurológica de los individuos FXTAS, además de confirmar las manifestaciones clínicas ya descritas por otros autores (Jacquemont et al., 2003), ha permitido identificar otros dos signos: demencia y sordera, características de la enfermedad. 4. Caracterización neuropsicológica FXTAS. En nuestra serie de pacientes FXTAS las alteraciones neuropsicológicas más relevantes han sido: alteración de la memoria (inmediata, de fijación y working memory), las alteraciones frontales (atención y enlentecimiento 4 cognitivo) y de las funciones ejecutivas, y el deterioro cognitivo progresivo de les características frontotemporales. 5. Caracterización neurorradiológica de FXTAS. La caracterización neurológica de nuestra serie de individuos FXTAS confirma las manifestaciones clínicas descritas previamente sin cambios reseñables (Jacquemont et al., 2003). 6. Transmisión FXTAS madres-hijas La revisión de las familias SFX, nos ha permitido identificar dos transmisiones madre-hija de FXTAS. Son los primeros casos descritos en que se pone de manifiesto este hecho, así como unas manifestaciones clínicas particulares (demencia) y una inactivación preferencial del cromosoma X. Estos casos han sido descritos con detalle en una publicación en Neurology. 7. Descripción de otras patologías asociadas a la premutación Después de contactar con 151 familias y formular preguntas telefónicamente o en persona sobre patologías asociadas a la premutación, se ha podido establecer que un 24,4% de las portadoras sufren fibromialgia y un 15,9% disfunción tiroidea. 8. Fibromialgia El estudio de 200 muestras del Banco Nacional de ADN procedente de mujeres con diagnóstico de fibromialgia, ha detectado 2 portadoras de la premutación. Por lo tanto, podemos establecer que la incidencia de la premutación FMR1 en el grupo de mujeres con fibromialgia es de un 1%, superior a la incidencia de portadoras en nuestra población general (Rife et al. 2003). Manuscrito en preparación que supondrá la identificación de un nuevo gen implicado en la etiología de la fibromialgia. 9. Determinación de niveles del transcrito ASFMR1 - El estudio de los niveles de expresión del transcrito ASFMR1 pone de manifiesto la falta de expresión en individuos afectos de SXF y ha permitido 5 establecer los rangos de expresión en individuos normales y portadores (tabla 3). - La comparación de los niveles de expresión de ASFMR1 entre individuos FXTAS y no-FXTAS no muestra diferencias significativas, indicando que los niveles de expresión de ASFMR1 no son un marcador para FXTAS (tabla 4). - Se observa un patrón de splicing de ASFMR1 diferente entre los individuos normales y los portadores de la premutación diferente. El splicing correspondiente a los transcritos -196/-1000 y +10243/+210 es distinto entre los individuos controles (rango CGG normal) portadores de la premutación (figura 6). No obstante, no se observan diferencias entre los individuos FXTAS y no-FXTAS. .- Determinación de los niveles del transcrito ASFMR1 en 67 individuos. Tabla 3 NÚMERO mRNA ASFMR1 CASOS rango Normal 16 1,38 (0,68-2,07) Portador 70 1,23 (0,53-2,37) Afectado 2 0,03 (0,02-0,03) Afectada 3 0,83 (0,49-1,16) - Determinación de los niveles del transcrito ASFMR1 en individuos portadores de la premutación FXTAS y no-FXTAS. Tabla 4 NÚMERO CASOS mRNA ASFMR1 rango FXTAS 12 1,32 0,53-2,37 No FXTAS 10 0,93 0,60-1,40 Figura 6.- Patrón de splicing de ASFMR1 correspondiente a los transcritos -196/-1000 y +10243/+210 en individuos normales y portadores de la premutación (N: normal, PM1 y PM2 portadores). 6 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos A lo largo de estos tres años se ha profundizado en el conocimiento de FXTAS y de las patologías asociadas a la premutación, alcanzando el objetivo principal del proyecto. La implicación más directa y evidente para la práctica clínica ha sido la difusión de FXTAS entre los profesionales médicos, entrando a formar parte de la práctica clínica de rutina en el estudio de las ataxias espinocerebelosas. Se ha llevado a cabo una gran difusión mediante sesiones clínicas, cursos, jornadas, presentaciones en congresos nacionales e internacionales y publicaciones científicas nacionales e intencionales. Les acciones translativas derivadas del proyecto han sido: 1. La creación y consolidación de un grupo multidisciplinar (neurólogos, neurorradiólogos, psicólogos y genetistas) especializados en el estudio de FXTAS que apoya y difunde la enfermedad a otros especialistas y familiares que la sufren. 2. Diagnóstico de FXTAS en 15 pacientes. Actualmente estos pacientes reciben tratamiento específico y personalizado y se ha iniciado un ensayo clínico. 3. Incorporación del estudio de la zona repetitiva del gen FMR1 en el protocolo de estudio de los trastornos de movimiento. 4. Mejora en el consejo genético de los portadores de la premutación en les familias SXF. 5. Identificación de un gen implicado en la etiología de la fibromialgia. 7 4. Publicaciones Pagonabarraga J, López-Mourelo O, Rodriguez-Revenga L, Xunclà M, Gómez-Ansón B, Milà M, KulisevskyJ. Reported hearing impairment in FXTAS. (Sotmès). Xunclà M, Badenas C, Domínguez M, Rodríguez-Revenga L, Madrigal I, Jiménez L, Soler A, Borrell A, Sánchez A, Milà M. Fragile X syndrome prenatal diagnosis, parental attitudes and reproductive responses. Reprod Biomed Online. 2010 Oct;21(4):560-5. Epub 2010 Jun 16. IF 2,062 Rodriguez-Revenga L, Pagonabarraga J, Gómez-Anson B, López-Mourelo O, Xunclà M, Milà M. Motor and mental dysfunction in women with FXTAS: two families with mother-daughter transmission. Neurology. 2010 Oct 12;75(15):1370-6. IF 8,172 Rodriguez-Revenga L, Madrigal I, Pagonabarraga J, Xunclà M, Badenas C, Kulisevsky J, Gomez B, Milà M. Penetrance of FMR1 premutation associated pathologies in fragile X syndrome families. Eur J Hum Genet. 2009; 17: 1359-1362. IF 3,564 Milà M, Madrigal I, Kulisevsky J, Pagonabarraga J, Gómez B, Sánchez A, Rodríguez-Revenga L. Fragile X tremor ataxia syndrome (FXTAS): a new kind of spinocerebelar ataxia associated to fragile X syndrome premutation carriers. Med Clin (Barc) 2009;133: 252-254. IF 1,231 Rodriguez-Revenga L, Santos MM, Sánchez A, Pujol M, Gómez-Anson B, Badenas C, Jiménez D, Madrigal I, Milà M. Screening for FXTAS in 95 Spanish patients negative for Huntington disease. Genet Test. 2008; 12: 135-138. IF 1,120 8 Rodriguez-Revenga L, Madrigal I, Alegret M, Santos M, Milà M. Evidence of depressive symptoms in fragile-X syndrome premutated females. Psychiatr Genet. 2008; 18: 153-155. IF 2,696 Premutation alleles in the FMR1 gene are associated with fibromyalgia. (Manuscrito en preparación.) 9