Download Mutaciones del DNAmt asociadas a enfermedades genéticas

Universidad de Zaragoza
Genética de enfermedades
mitocondriales
Julio Montoya
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular
CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER)
Universidad de Zaragoza
Enfermedades Genéticas
Mitocondriales
Grupo de trastornos originados por defectos
en el sistema de fosforilación oxidativa que
conlleva una deficiencia en la producción de
ATP.
Oxidative phosphorylation system
(OXPHOS System)
C. I
C. II
C. III
C. IV
C. V
Total
Number
subunits
> 43
4
11
13
14
> 85
Codified in
mtDNA
7
-
1
3
2
13
Herencia de las enfermedades genéticas
mitocondriales
•Mendeliana.Para genes mitocondriales codificados en el DNA nuclear
•Materna
Para genes mitocondriales codificados en el DNA mitocondrial
Enfermedades originadas por
mutaciones en el DNA
mitocondrial.
Caracteristicas del Sistema
Genetico Mitocondrial
Mapa genético
del mtDNA
humano
16.569 pb
1.000-10.000 copias/cel.
37 genes
Información compacta
Genética Mitocondrial
• Herencia Materna
• Segregación mitótica
• Efecto Umbral
• Alta Velocidad de Mutación
•Carencia de recombinación
Herencia del mtDNA
Hae II polymorphism
Genética Mitocondrial
• Herencia Materna
• Segregación mitótica
• Efecto Umbral
• Alta Velocidad de Mutación
•Carencia de recombinación
E
O
Z
A
B
C
Genética Mitocondrial
• Herencia Materna
• Segregación mitótica
• Efecto Umbral
• Alta Velocidad de Mutación
•Carencia de recombinación
U
M
B
R
A
L
REPLICACION
SEGREGACION
% DNA MUTADO
0
20
40
60
80
Enfermedades asociadas a daños en el
DNA mitocondrial
Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON)
Síndrome de Leigh
Síndrome de NARP
Síndrome de MELAS
Síndrome de MERRF
Oftalmoplejia crónica progresiva externa
Síndrome de Kearns-Sayre
Síndrome de Pearson
Cardiomiopatía
Síndromes de depleción
Tipo de muestra biológica a analizar
• Histología: Biopsia muscular
• Actividades enzimáticas: Biopsia muscular
•
•Genética:
Ideal: el tejido mas afectado
Mutaciones puntuales de herencia materna: Sangre
Deleciones-depleciones: Tejido mas afectado (músculo, hígado,…)
Análisis genético
Daños en el mtDNA
•Mutaciones puntuales en tRNAs, rRNAs
y en genes codificantes de proteínas
•Deleciones
•Depleción
Mutaciones mas carácterísticas
SÍNDROME DE LEIGH: T8993G, T8993C
SÍNDROME NARP: T8993G
MELAS: A3243G, tRNALeu
MERRF: A8344G
NEUROPATÍA OPTICA HEREDITARIA DE LEBER:
G3460A, G11778A, G14484A
- Mas de 150 descritas, muchas de ellas solo una vez
- Herencia materna
Síndrome de Leigh
• Regresión psicomotora Alteraciones respiratorias
• Lesión núcleos de la base
• Anatomia Patológica: lesiones espongioformes
desmielinización, proliferación vascular y astrocitosis.
Variables:
Vómitos, rechazo alimento, alteraciones de la
deglución. S. Piramidal. S. Extrapiramidal
Nistagmus, atrofia óptica. Parálisis Oculomotoras.
Hiperproteinorraquia Leucodistrofia.
I:2
I:1
S: <5%
?
II:1
II:2
S: >95% VC: 87%
S : 84%
Mutaciones asociadas
T8993G ATPasa 6
T8993C ATPasa 6
Universidad de Zaragoza
A new pathologic mtDNA mutation in the
cytochrome oxidase subunit I, in a child with a
very mild phenotype
Examination at 13 yo
Normocephalia
Low weight
Growth retardation
Pes cavus
Moderate mental retardation
Anorexia
Generalized muscle atrophy
Weakness with fatigability to climb stairs
EMG: myopathic pattern
Lactate
Lactate
Pyruvate
Organic
acids
CSF
Aminoacids
Blood
CPK
LDH
Haemogram
Laboratory
parameters
Plasmatic
carnitine
Hepatic
ultrasound
scan
ECG
Audiometric
test
Hyperintensity
caudate nucleus
RMI-S
EMG
Lactate peak in
Cortex atrophy
fronto-temporaloccipital regions
Mitochondrial disease?
Myopathic pattern
Muscle biopsy
Morphological analysis
Subsarcolemmal accumulations of mitochondria
Atrophic type II fibers
Histochemical analysis
Most of the muscle fibers: COX-negative
Some type I COX-positive fibers
Absence of ragged- red fibers (RRF)
Hematoxiline-eosine staining
Complex IV staining
Subsarcolemmal acumulation of
mitochondria
Respiratory chain activity
Specific activity
(nmol/min/mg prot)
NADH:cyt c oxidoreductase
(Complex I+III)
Succinate:cyt c oxidoreductase
(Complex II+III)
Patient
Control
range
12 (m)
12-56 (m)
6 (85.7%) (m)
6.5 (f)
7-24 (m)
2.4-17 (f)
mU/UCS
Patient
41 (38.3%) (m)
21 (28.0%) (m)
0.24 (f)
Control
range
107-560 (m)
75-149 (m)
0.14-1.0 (f)
Succinate:DCPIP oxidoreductase
(Complex II)
9 (m)
4-10 (m)
31 (93.9%) (m)
33-69 (m)
SDH (+PMS)
10 (m)
10-25 (m)
34 (59.6%) (m)
57-239 (m)
Decilubiquinol:cyt c oxidoreductase
(Complex III)
81 (m)
55-259 (m)
279 (45.7%) (m)
610-1760 (m)
Cytochrome oxidase
(Complex IV)
26 (44.1%) (m)
33 (f)
59-170 (m)
16-48 (f)
Citrate synthase (CS)
290 (m)
27 (f)
71-200 (m)
11-29 (f)
Isolated C-IV deficiency
90 (15.3%) (m)
1.22 (84.1%) (f)
590-1300 (m)
1.45-3.13 (f)
Multienzymatic deficiency
Where to check for mutations?
Clinical symptoms: ETC disease
ETC:
-ETC: multienzymatic deficiency:
- mtDNA depletion, deletion
- Mitochondrial tRNA mutations
-CIV deficiency:
- Mutations of CIV genes encoded in mtDNA
- Mutations of CIV structural or assembly genes encoded in
nDNA
Muscle biopsy: No RRF and COX negative fibers:
- Mutations of CIV assembly genes encoded in nDNA
Molecular-genetic analysis
Deletions, mtDNA Depletion
Sequencing of CIV genes encoded in mtDNA
CO I, COII , CO III subunits
CO I
G6955A
Gly351Asp
Not found in more than 4,000 sequences from patients and controls of all around the world
Molecular-genetic analysis
Whole mtDNA sequence
MT-GENE
GENETIC VARIANTS
MT-RNR
m.750A>G (MT-RNR1), m.961T>G (MT-RNR1), m.1438A>G (MT-RNR1)
MT-T
rCRS
MT-ND
m.4769A>G (S-p.MT-ND2), m.13759G>A (NS-p.MT-ND5:Ala475Thr)
MT-CYB
m.15326A>G (NS-p.MT-CYB:Thr194Ala)
MT-CO
m.6955G>A (NS-p.MT-CO1:Gly351Asp)
MT-ATP
m.8448T>C (NS-p.MT-ATP8:Met28Thr), m.8860A>G (NS-p.MTATP6:Thr112Ala)
MT-DLOOP
m.195T>C (MT-DLOOP), m.263A>G (MT-DLOOP), m.309Ci (MT-DLOOP),
m.315Ci (MT-DLOOP), m.16265A>C (MT-DLOOP), m.16293A>G (MTDLOOP), m.16311T>C (MT-DLOOP)
Haplogroup H11
Requirements to be pathologic…
Controls/Haplogroup
- 4020 mtDNA pusblished sequences
- Haplogrupo H11
Heteroplasmy
% of mutation
Requirements to be pathologic…
G6955A: GGT
GAT Gly351Asp (COI)
Conservation indexes of different aminoacid positions
Mutations
Mammals
(227)
Aves
(125)
Reptils
(50)
Amphibia
(73)
Fishes
(322)
No
Vertebrates
(510)
Total
(1307)
%
(100)
S142F
227
125
50
73
322
411
1208
92.4
L196I
226
125
49
72
321
441
1234
94.4
M273T
227
125
50
73
321
493
1289
98.6
I280T
227
125
50
73
322
502
1299
99.4
G317S
227
124
50
73
322
494
1291
98.8
Media 96.7
G351D
227
125
50
73
322
505
1302
99.6
This change never has described in humans but it has been found in S. cerevisiae and
Rhodobacter spheroides and all of them are respiratory deficient mutants
Transmitochondrial cybrids
BrEt
Glc, Pir, Ur
TK-
TK+
rho0
PEG
BrdU
Ur -
Glc, Pir
Daños en el mtDNA
•Mutaciones puntuales en tRNAs, rRNAs
y en genes codificantes de proteínas
•Deleciones
•Depleción
Enfermedades asociadas a daños en el
DNA mitocondrial
Oftalmoplejia crónica progresiva externa
Síndrome de Kearns-Sayre
Síndrome de Pearson
Encefalomiopatías
Daños en el mtDNA
•Mutaciones puntuales en tRNAs, rRNAs
y en genes codificantes de proteínas
•Deleciones
•Depleción
Depleciones de mtDNA
Músculo
Hígado
mtDNA
18S rRNA
mtDNA/nDNA
% depleción
8.8
0.72
89
4.4
0.37
91.5
Secuenciación del gen de la desoxiguanosina kinasa (dGK) y de timidina
kinasa (TK2) en pacientes con formas hepatocerebrales y miopáticas del
síndrome de depleción del mtDNA, respectivamente.
Síndrome de depleción de mtDNA
Forma miopática: TK2
Forma hepatocerebral: DGUOK,
MPV17, POLG, SUCLG1, PEO1
Forma encefalomiopática: SUCLA 2
Forma cerebrorenal: RRM2B
In vitro oöcyte nuclear transplantation
Donor oöcyte
MELAS oöcyte
Enucleate
IVF
Normal embryo