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CENTRO MEDICO NACIONAL 20 DE NOVIEMBRE
Subdirección de Enseñanza e Investigación
Coordinación de Investigación
No. de Registro ________
PROTOCOLO
Unidad Médica:
Teléfono/ext.
Título:
Centro Médico Nacional “20 de Noviembre”
Coordinación de Investigación
52 00 50 03 ext. 14609
EVALUACIÓN DE LAS MUTACIONES G2019S y G2385R DEL
GEN NUECLEAR LRRK2 Y POLIMORFISMO DE NUCLEOTIDO
ÚNICO (SNP) EN EL GEN ND3 Y H A10398G y T4336C DEL
ADN MITOCONDRIAL EN MESTIZOS MEXICANOS CON
ENFERMEDAD DE PARKINSON ESPORÁDICA (EPE)
Investigador responsable:
TUTOR
Investigadores asociados:
Para presentar en:
Para publicación en:
NOMBRES
Silvia García
Ramon M. Coral
Carlos Galaviz
Luis Dávila Maldonado
Carlos Cuevas García
Juan Carlos Falcón
Erika Meza Dávalos
Sergio Sauri Suárez
Lucino Castillo
Bertin Martínez Silva
Manuel Hernández
Luz Berenice López Hernández
Liana Patricia Canto
CONACYT
Revista Especializada en el tema
Para ser llenado por la Jefatura de Investigación
Fecha de recepción:
Fecha de
aprobación:
Fecha de
terminación:
Fecha de informes
Informes trimestrales, semestrales y anual
parciales:
Evaluación de
% de avance por etapa
informes:
FIRMAS
1. Problema.Pregunta específica que dio origen a este estudio
La enfermedad de Parkinson esporádica (EPE) es una enfermedad neurodegenerativa que ocupa el
segundo lugar en frecuencia en el mundo occidental la cual causa gran incapacidad funcional y la
erogación de grandes sumas a los diferentes sistemas de salud. Se desconoce su etiología y hasta el
momento no existe ningún tratamiento que modifique la historia natural de la Enfermedad, la cual
evoluciona a la incapacidad funcional, postración, en 30% demenciación y la muerte en término de
10-15 años a partir del diagnóstico. Existe evidencia de que los primeros síntomas de la enfermedad
aparecen cuando la depleción de neuronas dopaminérgica alcanzó el 70%, y a través de estudios
neuroifuncionales se ha llegado a determinar que el periodo entre el inicio de la perdida de células
neuronales hasta una despoblación del 70% es de alrededor de cinco años, tiempo en que
podríamos, sí encontramos marcadores moleculares, actuar de manera profiláctica.
¿Las mutaciones G2019S y G2385A del gen LRRK2 y los Polimorfismos de Nucléotido (SNP)
A10398G, Y T4336C del ADN mitocondrial modifican el riesgo de padecer Enfermedad de
Parkinson no familiar en mestizos mexicanos?
2. Hipótesis
La hipótesis de trabajo plasma el concepto que el investigador tiene del problema y la solución del
mismo. Es una suposición comprobable, basada en ciertos indicios y que se formula afirmando o
negando algo de lo que se tiene certeza; debe ser clara y precisa.
Las mutaciones G2019S y G2385A del gen LRRK2 y los Polimorfismos de Nucléotido (SNP)
A10398G y T4336C del ADN mitocondrial modifican el riesgo de padecer Enfermedad de
Parkinson no familiar en mestizos mexicanos
3.- Antecedentes
La Enfermedad de Parkinson Esporádica (EPE) es un padecimiento neurológico, degenerativo y
progresivo que afecta primordialmente el movimiento y de etiología desconocida; es el segundo
trastorno neurodegenerativo que motiva consulta neurológica. 1 Pese a los múltiples estudios sobre su
génesis y los avances en su tratamiento aún no ha sido posible modificar la progresión de la
enfermedad. Se describió en 1817 por James Parkinson; se caracteriza por temblor de reposo,
bradicinesia, rigidez y más tardíamente alteración de los reflejos posturales, 2 en 30% de los casos
demencia.3 Se calcula que afecta 1 millón de personas en USA, 0.3% en población general y 3% en
individuos entre 65-90 años, solo 5 -10 % se inicia antes de los 40 años; su prevalencia varía entre
100-350 por 100,000 en la población general de raza blanca y aumenta a más de 600 por 100,000 en
población mayor de 75 años;4 en Europa las cifras ascienden a 3600 en 100,000 en individuos
mayores de 85 años.5 La expectativa de vida se reduce en la EPE ya que estos sujetos tienen un
riesgo de dos a cinco veces más de morir en relación a sus controles. 6 Histopatológicamente se
caracteriza por la muerte selectiva de poblaciones heterogéneas de neuronas, principalmente
dopaminergicas de la pars compacta de la sustancia nigra de cuya pérdida derivan la mayoría de las
manifestaciones clínicas de la EPE las neuronas más afectadas se localizan en los complejos
nucleares de las áreas A8, A9 y A10; otros grupos afectados son neuronas catecolaminéregicas y
serotoninérgicas de núcleos ceruleus y del rafé respectivamente, neuronas colinérgicas del núcleo
basal de Meynert, hipotálamicas, neuronas corticales particularmente del cíngulo y corteza entorrinal,
células del bulbo olfativo, ganglios simpáticos y neuronas parasimpáticas del intestino. 7 Las neuronas
remanentes en el SNC presentan inclusiones intracitoplásmicas que se tiñen con anticuerpos contra
ubiquitina y alfa-sinucleína denominados Cuerpos de Lewis evento cardinal en la patogénesis de la
enfermedad. La participación de agentes externos para el desarrollo de la EPE fue manifiesto debido
a la exposición a metil-fenil-tetrahidropiridina (MPTP), sustancia que daña selectivamente a las
neuronas productoras de dopamina;8 esta situación se ve reforzada por la asociación existente entre
varias enzimas relacionadas a especies reactivas de oxígeno a las cuales son muy vulnerables estas
neuronas, ambas situaciones parecen ejercer una acción sinérgica en la muerte celular. 9 No existe un
marcador biológico para el diagnóstico in vivo de la enfermedad por lo que el cuadro clínico es
fundamental para este propósito, así el inicio asimétrico de los síntomas y la adecuada respuesta a la
levopodopa son dos elementos clave; sin embargo, en estadios tempranos el diagnóstico no es fácil,
estudios retrospectivos que incluyeron centros neurológicos con expertos en EPE hubo correlación
clínica e histopatológica (autopsia) del 75%,10 por tal razón, se han creado diversos criterios
diagnósticos para la EPE, entre los más aceptados están los Criterios Clínicos del Banco de Cerebros
de la Sociedad de Enfermedad de Parkinson del Reino Unido, 11 cuya certeza diagnostica es cercana
a 90%; los puntos que evalúan son: a) Síntomas esenciales para el diagnóstico del síndrome
parkinsónico; b) criterios de exclusión para el diagnóstico de la EP; y c) criterios de apoyo del
diagnóstico de la EP. Anexo 1. Koller et al.,12 diseñaron otra herramienta que establece que para el
diagnóstico de EPE definitivo los siguiente criterios: a) Existencia por un año o más de los tres signos
motores cardinales de la enfermedad: temblor de reposo o postural, rigidez y bradicinesia, y b)
respuesta a la administración de levodopa, al menos en una dosis diaria de un gramo durante un mes
y que produzca moderado o marcado grado de mejoría que perdure un año o más; y una lista larga
de criterios de exclusión. Los Criterios para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson por el
Advisory Council of the National Institute of Neurological Disorders and Stroke, US National Institutes
of Health inclute: A. Signos motores cardinales: Temblor de reposo distal (3-7 Hz); Rigidez;
Bradicinesia; Inicio asimétrico. B. Criterios de exclusión: Inestabilidad postural precoz; Fenómeno de
“congelamiento”; Alucinaciones no relacionadas con la farmacoterapia; Demencia precoz; Parálisis de
la mirada vertical; Disautonomía grave no relacionada con la farmacoterapia y Causas claras de
parkinsonismo sintomático. Finalmente y debido a que ninguna manifestación clínica resulta
suficientemente sensible y específica por sí misma Gelb et al.13 han propuesto varias combinaciones
de los criterios clínicos mencionados e identificar diferentes niveles de diagnóstico: posible, probable
y definitivo (anexo 2).
La EP en jóvenes es rara, suele ser familiar de trasmisión mendeliana autosómica dominante y
autosómica recesiva;14 en pacientes con EP de inicio temprano se advirtió un patrón de trasmisión
autosómica recesiva, Lücking et al. 15 encontraron mutaciones en el gen de Parkina-1 en 49% de 73
familias con al menos un individuo afectado antes de los de 45 años. Otro de los genes que ha sido
estudiado en familias afectadas es el de alfa-sinucleína, proteína presináptica que posiblemente
participa en la plasticidad neuronal, se encuentra localizado 4q21l;16 la participación de esta proteína
en la patogénesis de la enfermedad es de trascendencia, existen varías mutaciones demostradas en
este gen: G209A; C88G de trasmisión autosómica dominante relacionada con una evolución clínica
parecida a las formas esporádicas de la enfermedad; otra mutación se localiza G188A, es rara, se
vincula a demencia; recientemente a 158 casos en 28 familias (de trasmisión autosómico dominante)
con al menos un afectado, se les estudió polimorfismo conformacional de cadena única (SSCP), en
una familia de ascendencia griega se observó, mutación en A53T, y en otras se demostró una
penetrancia reducida de esta mutación. 17 Al menos 16 alteraciones genéticas han sido documentadas
en los pacientes con EP y aunque la mayor parte de ellas se asocian a una trasmisión mendeliana
existen otras cuya trasmisión queda aún obscura.18 Valente et al. mapearon 1p36 (PARK6),
encontraron que las mutaciones de PINK1 (PTEN-induced kinase 1) se asociaron a PARK6,
identificaron en tres individuos consanguíneos dos mutaciones que afectan el dominio PINK1-cinasa.
Los cultivos celulares sugieren que PINK1 se localiza en la mitocondria y podría ofrecer un efecto
protector sobre la célula, dicho efecto se perdería a causa de un polimorfismo o una mutación y, en
tales circunstancias sería susceptible el efecto deletéreo del estrés oxidativo. 19 El gen de DJ-1
codifica ubiquitina proteína conservativa codificada por el mtDNA cuya función mas o menos conocida
es el de “etiquetar” proteínas y escoltarlas hasta el proteosoma para ser degradadas en éste; también
se ha asociado en la respuesta al estrés oxidativo; Bonifatu et al. encontraron que mutaciones de DJ1 están asociada a PARK 7 en una forma monogénica de EP, lo que apoya que la falta de DJ1
coadyuva a la neurodegeneración. 20 La mayor parte de los genes mencionados están relacionados
con el desarrollo de formas de la EP familiares, sin embargo, al evaluarles en pacientes con la
enfermedad esporádica (donde conforme se incrementa la edad de aparición de la EP hay menor
número de individuos afectados en la familia), la frecuencia de mutaciones disminuye
ostensiblemente. Teniendo en consideración que la mayoría de los casos de la EP son esporádicos,
los diferentes investigadores se han dado a la tarea de buscar genes asociados con estas formas de
la enfermedad. Posiblemente el gen más importante relacionado con la EPE sea la cinasa 2 rica en
repetidos de leucina (LRRK2) también denominada dardarina, este gen fue descrito inicialmente en
una familia japonesa y posteriormente en familias de la región vasca (de donde viene su nombre que
significa temblor).21 La mutación G2019S en ese gen es un factor de peso como causa del Parkinson
tanto familiar como esporádico en poblaciones de todo el mundo; 22 es la primera mutación conocida
que es común en razas diferentes. El gen (LRRK2) tiene 51 exones, codifica para una proteína de
2517 aminoácidos cuya función no se conoce; tiene 5 dominios funcionales que son un dominio rico
en aa repetidos de leucina, un dominio ROC (ras guanosina trifosfatasa), un dominio C-terminal de
ROC, un dominio WD40 (repetidos de g-transducida) y un dominio catalítico de tirosin cinasa. En un
inicio se encontraron 6 mutaciones diferentes,23 actualmente se han detectado más de 41
mutaciones,22 la séptima mutación la G2019S fue descrita por Gosal et al en el 2005, 24 esta mutación
parece ser más frecuente que cualquiera de las otras asociadas a la enfermedad. A la fecha, solo la
mutación R1441S se observó en el 8% de los pacientes con la EP (tanto familiar como esporádico)
del País Vasco.21 Haugarvoll et al25 estudiaron la mutación de R1441C en EPE y la comparaon con La
presenciad e mutación G2019S, la edad promedio de inicio de la enfermedad en su grupo de estudio
fue de 60 años (30–79) menos del 20% iniciaron antes de los 50 años, en tanto que >90% de los
mayores de 75 años desarrollaron síntomas de la enfermedad, no encontraron diferencias entre
ambas mutaciones y la EPE; el análisis de haplotipo sugirió 4 tipos independientes para la mutación
de R1441C. Una mutación recientemente identificada en población china es la G2385R.26 La
mutación 6055 GA produce un cambio aminoacídico G2019S se encuentra localizada en el exón 41
en el dominio MAPKKK que se conoce está involucrado en la transducción de señales provocando un
efecto sobreactivador a través de la hiperfosforilación de sustratos; sin embargo, Ishihara et al. 27 en el
2006, evaluaron algunos pacientes con mutaciones en estado homocigoto y heterocigoto sin
encontrar diferencias en su evolución clínica, aunque fue frecuente en pacientes con EPE. La
mutación 7153G>A produce el cambio G2385R en el dominio funcional WD40 de la proteína LRRK 2
generando un cambio conformacional en el mismo, sus efectos funcionales no se conocen; 26 la
evaluación de esta mutación, es a través de secuenciación automatizada el gen NURR1 (un factor de
transcripción) el cual se expresa en las neuronas dopaminérgicas y en la substancia nigra.28 Un
reporte en 2002 mostró un incremento de la frecuencia del polimorfismo en el intrón 6 del gen NURR1
(N16P) en pacientes con EPE y EPF comparados con controles (6.7% vs 0.9%) pero solo en
homocigotos,29 la evaluación de esta mutación es a través de un RFLP. 30 El gen SNCAIP fue
identificado en 2003 codifica la proteína sinfilina-1, la cual es el constituyente principal de los cuerpos
de Lewys en los pacientes con EPE, 31 la expresión de este gen genera la silfilina-1 (con 919
aminoácidos) y la silfilina ambas producidas por el cerebro y localizadas en la terminales sinápticas.,
aunque ambas inteactúan con otras proteínas su función todavía no se conoce. La silfilina-1 en 2003
fue evaluada en 328 pacientes alemanes con enfermedad de EPF y EPE, se observó en ambos la
presencia de una mutación 1861C>T que genera el cambio de arginina por cisteína en la posición 621
R621C; esta mutación no fue encontrada en 702 cromosomas de voluntarios alemanes sanos. 32
Finalmente, se sabe que quienes tienen antecedentes familiares cuya EPE inició antes de los 67 años
poseen un riesgo relativo RR de 2.3 de padecer la enfermedad el cual no se modifica si la EPE
aparece después. 23 Un estudio longitudinal en Iceland que incluyó 560 pacientes con EPS de
aparición después de los 50 años demostró que el RR de padecer EPE con un IC de 95% fue de 6.7
(4.3-9.6) para hermanos; 3.2 (1.2-7.8) en descendentes y 2.7 (1.6-3.9) para tíos y sobrinos, estos
investigadores concluyeron que el factor genético es tan importante como el ambiental en la génesis
de la EP que aparece después de los 50 años. 33 Por otro lado se han estudiado al menos 16 genes
nucleares relacionados con la etiología de la EPE en diferentes poblaciones, de éstos 9 se han
caracterizado y se ha demostrado que participan en a la vía de degradación proteica en el
proteasoma que les confiere vulnerabilidad asociada a la edad y al balance Ach/dopamina; el
cromosoma 7 ACHE/PON locus 1 parece que ser una región clave para el control de este balance. 34
Haciendo un recuento de la revisión anterior consideramos que evaluar las dos mutaciones mas
frecuentes documentadas G2019S Y G2385A en el LRRK 2 (Gen más claramente involucrado en
EPE) podría darnos información sobre su asociación en población mestiza mexicana con EPE.
Otro elemento fundamental en la patógena de la EPE es la evaluación de DNA mitocondrial (mDNA),
para entender mejor este punto es necesario hacer un breve recordatorio de los aspectos
fisiopatológicos y la importante intervención de la mitocondria en el proceso de muerte celular en esta
enfermedad; sí bien la etiología de la EPE se desconoce, se sabe que existe un defecto en los
neurotransmisores centrales a consecuencia de una pérdida más o menos selectiva de las neuronas
productoras de dopamina, localizada en la parst compacta de la sustancia nigra y aunque hay otras
neuronas que se pierden, éstas son las mejor estudiadas ya son las responsables de los problemas
motores en la EP;35,36 está ampliamente demostrado que la muerte neuronal y la disminución de
neurotrasmisores son eventos centrales en la enfermedad y aún es motivo de un afanosos estudios el
origen de estos sucesos;37 la parts compacta de la sustancia nigra tiene alrededor de 450 000
neuronas dopaminérgicas, las cuales disminuyen con la edad, sin embargo, en los enfermos con EPE
este proceso se encuentra “acelerado” y “anticipado”; ,38 el parkinsonismo observado posterior a la
epidemia de gripe asociada a encefalitis de Von Ecónomo a principios del siglo pasado fue el primer
suceso que hizo suponer la influencia de eventos externos asociados al desarrollo de la EPE, una
observación posterior de gran trascendencia en la compresión de la EPE, fue la asociación de un
cuadro parkinsónico severo asociado a la exposición de MPTP (1 Metil, 4 Fenil, 1,2,3,6
Tetrahidropiridina),39,40 donde se pudo documentar la declinación de las células dopaminérgicas, así
como de los precursores de dopamina, seguido de una inesperada perpetuación del fenómeno, lo que
permitió obtener un modelo humano e in vivo de la enfermedad. A partir de estas observaciones se ha
especulado que posiblemente la exposición a uno o varios agentes externos, en una etapa temprana
de la vida, en un individuo con predisposición genética dispare los mecanismos de muerte celular
mediada por apoptosis.35,41,42 Aquí dos puntos críticos aun no resueltos ¿por qué la selectividad de la
muerte neuronal? y ¿cuáles son los mecanismos pre-existentes (predisposición genética)? Dos
aspectos llamativos ocurren en las neuronas susceptibles a morir: la Disfunción Mitocondrial y en el
Metabolismo Oxidativo,35,41,42 elementos clave encontrados en la exposición de MPTP.
La disfunción mitocondrial.- el MPTP tiene efectos inhibitorios sobre el Complejo I (NADHObiquinona de Oxidoreductasa) en la cadena de transporte iónico mitocondrial lo cual produce la
liberación de poderosas sustancias oxidantes y radicales libres de oxigeno. Un hecho relevante es
que se han evidenciado cambios en el mtDNA (DNA mitocondrial) 41,42 como preludio de una cascada
metabólica donde participan activamente mecanismos de excitotoxicidad, niveles inadecuados de
factores neurotróficos, expresión de epítopes del HLA (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) y
quizá, un metabolismo anormal de los precursores de dopamina, lo que en conjunto contribuyen en el
daño y muerte neuronal.43 La vinculación entre las alteraciones del mtDNA y la muerte de la neurona
es motivo de especulaciones y acucioso estudio, es pues pertinente recordar algunas particularidades
del material genético contenido en las mitocondrias humanas. El mtADN se autorreproduce de
manera semi-automática cuando la célula divide, al igual que el ADN bacteriano es una molécula
bicatenaria, circular, cerrada, sin extremos. En los seres humanos esta constituido por 16.569 pb,
conteniendo un pequeño número de genes distribuidos en dos cadenas H y L (pesada y ligera). Cada
mitocondria contiene entre 2 y 10 copias de la molécula de ADN, en él están codificados dos ARN
ribosómicos, 22 ARN de transferencia y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa. El
número de genes en el mtADN es de 37| en contraste a los 20.000-25.000 genes del ADN nuclear
humano). El mtADN se hereda solo por vía materna, tradicionalmente se ha considerado que cuando
un espermatozoide fecunda un óvulo éste se desprende de su cola y con ella del material
citoplasmático, sin embargo, se ha demostrado que las mitocondrias del espermatozoide pueden
penetrar en el óvulo, pero no llegan a heredarse ya que son marcadas por la ubiquitina y
degradadas. Otra característica importante mtADN es que no se recombina, por lo que los únicos
cambios son debidos a mutaciones a lo largo de generaciones; la proteínas que se generan a partir
del mtDNA intervienen en la fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria, aportan un número
especifico de proteínas para cada uno de los complejos de esta cadena (Complejos I al V) y aunque
su participación es importante no todas son codificadas por el mtDNA ya que otras son transcriptos
del DNA nuclear y así esta función indispensable para la obtención de energía celular es a partir de
una quimera genética.44 Los cálculos han concluido que, en los mamíferos y en concreto en el
hombre, cada 10.000 años aproximadamente surge una mutación en una de las bases del mtADN
(esto no es del todo cierto, aunque sí lo es para el fragmento que más mutaciones sufre, este consta
de unos 500 pares de bases); es decir, la diferencia entre una mujer que hubiera nacido hace 40.000
años y un descendiente directo por vía materna que viviera en la actualidad sería por término medio
de 4 bases mutadas en esta región. Bryan Sykes 45 profesor de Genética Humana en el Instituto de
Medicina Molecular en Oxford asegura que todos los europeos provienen de siete mujeres, las siete
hijas de Eva, la más antigua habría vivido hace 45.000 años y la más moderna hace unos 15.000
años. La antepasada común más moderna de todos las seres humanos, se remontaría a unos
150.000 años. Este conocimiento es de vital importancia para realizar antropología forense en
diferentes poblaciones. A partir del conocimiento de que, las neuronas “marcadas” para sucumbir en
la EPE presentan cambios en el mtDNA y disfunción de este organelo diferentes investigadores han
centrado sus estudios en estos eventos.46 El estudio del mtDNA en el EPE no ha sido tan exhaustivo
como del DNA nuclear, sin embargo, éste como los sucesos asociados a las fallas de la fosforilación
oxidativa, la ubiquitinación proteína y su degradación proteosómica han motivado exhaustivas
investigaciones. Sí bien la inhibición del el complejo I de la cadena respiratoria -CICR- (cadena de
transporte de electrones) mitocondrial tanto en la sustancia nigra (SN) como en las plaquetas es un
acontecimiento que se ha observado de manera consistente, 47 la manera que participa el mtDNA es
todavía motivo de investigación en la forma esporádica a enfermedad. El mtDNA codifica siete sub
unidades proteicas CICR de ello su vinculación con el riesgo de padecer EPE; 48 análisis bioquímicos
utilizando células citoplasmática híbridas (Cybrids) han demostrado defectos en el CICR en pacientes
con EPE lo que ha llevado a hipotetizar que aberraciones en el mtDNA pueden favorecer la EPE; 49
Muy significativo fue observar que estos sistemas Cybrids producían una cantidad excesiva de
moléculas reactivas de oxigeno lo que generaba aumento del estrés oxidativo y ello incrementaba la
expresión de proteínas antioxidantes (bcl-2 and bcl-XL), esto es interpretado como una “señal” de
estrés celular y como consecuencia a esta señal se genera la formación de mitocondrias anormales
con cuerpos de inclusión proteicos; modelos experimentales han demostrado que los inhibidores de la
actividad del CICR –rotenona- produce manifestaciones clínicas de la EP, estas manifestaciones se
asocian a degeneración selectiva de neuronas dopaminérgicas en las sustancia nigra y acumulación
citoplasmática de ubiquitina y alfa sinucleina; estos hallazgos sustentan que las alteraciones del CICR
podrían ser el mecanismo primario en la susceptibilidad a la muerte neuronal en la EP y la implicación
del mtDNA en la génesis de la EPE;.50,51 en base a lo anterior algunos investigadores han estudiado la
disfunción en la expresión mtDNA en la EPE y pese a que se han observado no han sido
suficientemente explicados.
En 2003 van der Walt y cols.52 evaluaron SNPs (Polimorfismo de Nucleótido Único) del mtDNA en 609
pacientes con EPE y 340 controles todos europeos de raza blanca, fueron clasificados de acuerdo a
la caracterización europea en haplogrupos; los haplogrupos J y K demostraron asociarse a una
disminución en el riesgo de padecer EP (RR de .55; IC .34-.9; p < .02 y RR 0.52, IC 0.30–0.90; p .02
respectivamente) el SNP 10398G mostró un potente efecto protector (RR 0.53; IC 0.39–0.73; p
.0001) efecto que fue mayor en el genero femenino (RR 0.43; IC 0.27–0.71; p .0009); también
encontraron que SNP 9055A de ATP6 poseía un efecto protector solo en las mujeres estudiadas (RR
0.45; IC 0.22–0.93; p .03). El SNP 10398G produce un cambio no conservativo de treonina por
alanina dentro del NADH deshidrogensa 3 (NAD3) del CICR lo que, al parecer, reduce el estrés
oxidativo. Autere et al.53 determinaron el total de sustituciones no sinónimas vs. sinónimas en los 7
genes del mtDNA que codifica para el CICR de en 230 pacientes con EP, ellos encontraron que, de
acuerdo a las clasificación europea por haplogrupos, aquellos cercanos a HV y KU presentaron
menor número de aminoácidos remplazados y una menor relación de sustituciones no sinónimas vs.
sinónimas JT y IWX. En los haplogrupos JTIWX hubo mayor número de aminoácidos remplazados en
los pacientes con EP que desarrollaron demencia; estos investigadores concluyeron que un exceso
de mutaciones no sinónimas en los genes mitocondriales que codifican para el CICR en JTIWX
incrementa el riesgo de que los pacientes con EP progresen demencia. Ghezzi et al.54 evaluaron
mtDNA en 620 pacientes italianos con EPE no encontraron diferencias en las frecuencias en el
haplogrupo J SNP 10398G como otros estudios, en tanto que el haplogrupo K fue significativamente
menor entre los pacientes con EPE de aquí que este haplotipo le confiera cierto efecto protector en la
población estudiada. En 2005 Huerta y cols.55 evaluaron 271 pacientes con EPE y 230 controles en
una población del norte de España (provincia de Asturias) encontraron una mayor frecuencia en al
SNP 4336T/C SNP del gen tRNA con el alelo 4336C en mujeres con EP (RR= 4.45; 95% IC=1.23–
15.96; p =0.011). De los genes del CICR que fueron secuenciados (ND1 a ND5) en quienes fueron
positivos para 4336C sin que se encontraran mutaciones. Este grupo también encontró que la
frecuencia de 10398G era menor en pacientes con EP (p =0.009; RR =0.53) Esta investigación, en
nuestra opinión, es la de mayor importancia para sustentar nuestro estudio por las semejanzas entre
esta población y la población mestiza mexicana, los autores concluyeron que el alelo 4336C
incrementó el riesgo de padecer la enfermedad entre mujeres y el 10398G tuvo un efecto protector en
ambos géneros. Estos mismos autores un una publicación posterior buscando vinculación entre los
genes de la sintetaza de Oxido Nítrico (SON) y EPE estudiaron a 450 pacientes con EP y 200
controles ratificaron el hallazgo de su anterior publicación y no hubo asociación con ningún gen que
codificara para SON.56
4. objetivo(s)
constituyen las metas hacia las cuales están orientados los intereses del investigador. deben ser
pertinentes, factibles y trascendentes.
1. Conocer sí de la mutación GS2019s del gen LRRK2 se encuentra asociada al EPE,
2. Conocer sí la mutación G2385a del gen LRRK2 en pacientes con EPE.
3. Conocer la frecuencia de SNP A0398G en el gen ND3 y T4336C del ADN Mitocondrial en
pacientes con EPE.
4. Sí esto se estable, entonces es posible establecer haplotipos y/o haplogrupos potenciales
de susceptibilidad y en base a la correlación con criterios diagnósticos internacionalmente
aceptados establecer el riesgo y/o el curso clínico de la enfermedad
5. justificación
Argumentación que explica todos aquellos satisfactores que se consideran relevantes para la unidad,
el instituto, el país y para la ciencia médica.
La EPE es una de las enfermedades nerurodegenererativas más frecuentes en el mundo; en México
se calcula una prevalancia de 8-12 por 1000 en población general. Esta enfermedad afecta
negativamente en el desempeño familiar, social y laboral del individuo quien suele percibirse como
una “carga” para sus allegados; el impacto económico por pérdida laboral no esta cuantificado en
nuestro país pero en naciones de primer mundo representa una gran carga para el estado, y en este
tenor, siendo un padecimiento crónico, progresivo e incurable la erogación en los diversos gastos por
atención medica van incrementándose logarítmicamente después de los cinco años de enfermedad;
esto ubica al padecimiento como un problema de salud publica. Más aún, en el conocimiento de que
la población de nuestro país ha incrementado sus esperanza de vida y éste, como otros
padecimientos similares aumentan su frecuencia en relación directa al aumento de la edad. Otro
elemento muy trascendente, es el conocimiento de que la EP tiene una fase subclínica de alrededor
de cinco años -entre el inicio de la perdida neuronal y el primer síntoma- lo que nos ofrece una posible
ventana diagnóstica y terapéutica temprana por lo que encontrar una herramienta para detectar estos
individuos es uno de los propósitos de este estudio. En este contexto, pese a que este es un
problema de salud (segunda causa de enfermedad neurodegenerativa) no se han evaluado los genes
involucrados en la enfermedad en individuos mestizos mexicanos lo que podría ofrecernos, al menos,
parte del instrumento que estamos buscando; esta población posee características genotípicas
propias de ello la necesidad de conocer sí la enfermedad esporádica se asocia a ciertos cambios en
el genoma nuclear identificado en otras poblaciones. La aportación más valiosa que nosotros
visualizamos en esta investigación es la determinación de SNPs en genes mitocondriales dadas las
implicaciones bien demostradas de este organelo en la fisiopatología de la EPE y las particularidades
del la estructura y comportamiento del genoma mitocondrial. En este momento se sabe que diferentes
eventos participan en la generación de la EPE y se acepta que sus génesis de multifactorial donde
elementos del ambiente pueden incidir o disparar la parición de la EPE pero en un sistema biológico
susceptible. Diferentes genes parecen tener coparticipación, sin embargo, parecen estar más
relacionados con las formas hereditarias de la enfermedad, es decir aquellas de aparición temprana y
patrones de segregación familiar bien establecidos. Algunos de los genes que se han encontrado en
pacientes afectados con EPE entre ellos el gen LRRK2 este gen inicialmente se encontró en
pacientes japoneses con formas autosómicas dominantes de la enfermedad. En población vasca se
encontraron diferentes mutaciones K1114K, I1122V, R1441C, R1441G, Y1699C Y I2020T entre
pacientes con la enfermedad, sin embargo, al evaluar individuos con EPE se encontró asociación con
una mutación en particular, la 6055G>A que produce un cambio aminoacídico el G2019S en el
dominio MAPKKK involucrado en la transducción de señales y un efecto sobreactivador
hiperfosforilando sustratos. La frecuencia de la mutación en pacientes con EPE es mayor que en la
población control, si bien la homocigosidad de la mutación no ha demostrado poseer un efecto más
¿sobreactivador? en sus efectos como era esperable su estudio será . Una segunda mutación del gen
LRRK2, LA 7153G>A que produce un cambio aminoacídico G2385R sin se conozcan los efectos
funcionales. Si bien hay una gran numero de de genes nucleares involucrados elegimos aquellos que
más solidamente se han asociado a la EPE. En relación al genoma mitocondrial, la cantidad de
estudios son sustancialmente menores y en población blanca; los genes involucrados en la
codificación de las subunidades proteicas del CICR. El SNP T4336C se ha asociado a un riesgo
mayor de padecer la EPE en tanto A10398G se ha documentado su efecto protector, este último ha
sido documentado en varios estudios de ello que sea evaluado en nuestros pacientes.
6. Diseño
Forma previamente definida, en la que los elementos serán sujetos a las condiciones establecidas en
el estudio.
6.1. Tipo de Investigación
Estudio, transversal, analítico, abierto y comparativo
6.2. Grupos de Estudio
6.2.1. Grupo problema. Grupo que incluye los factores que se espera modifiquen las variables en
estudio
1. Pacientes diagnosticados con Enfermedad de Parkinson en base a los criterios del banco de
cerebros del Reino Unido
2. Ambos géneros, mayores de 40 años
3. Mestizos mexicanos
4. acepten participar en el estudio
6.2.2. Grupo testigo. Grupo similar al problema en las variables relevantes pero que no incluye los
factores que se espera modifiquen las variables en estudio.
Señalar si el estudio incluye este grupo ( X )
1. Sujetos sin padecimientos neurológicos, mayores de 65 años.
6.2.2.1. Tamaño de la muestra.
Asumiendo una relación de caso:control 1:2 y una diferencia de 0.14 en la frecuencia de los genotipos
de interés, con un valor de significancia (α) de 0.05 para 2 colas de distribución y un poder de 0.80,
se obtiene el siguiente tamaño de muestra:
K1a
0.29
0.68
K1c
0.47
0.09
25
.09 (25+.9)/ 2 = .17
p = .17
q = .93
2
Zá
n=

ã
Z-alfa
n=
 2 p x q + Z⠁ (p1 x q1) + (p 2x q2)
2
(p1
p2)
ã
ã
2 (.17) X .83

ã
+ Z-alfa (.25 x .75) + (.09x .91)
= 85.2
( .25 - .09)2
Casos = 86 ≈100
Controles = 172 ≈200
6.2.2.2. Criterios de inclusión. Aspectos que necesariamente deberán tener los elementos en
estudio
1. Pacientes diagnosticados con Enfermedad de Parkinson en base a los criterios del banco de
cerebros del Reino Unido
2. Ambos géneros, mayores de 50 años
3. Mestizos mexicanos
4. Aceptación del paciente y firma de Carta de Consentimiento Informado.
6.2.2.3. Criterios de exclusión
Todos aquellos datos cuya existencia obligue a prescindir del sujeto como elemento de estudio, a
pesar de reunir los requisitos de inclusión.
1. Síndromes de Parkinson -Plus & Atrofia de Sistemas Múltiples. Enfermedad neurológica de
conocida trasmisión mendelina.
2. Parkinsonismo secundario
3. Enfermedad neurológica progresiva de cualquier naturaleza.
6.2.2.4. Criterios de eliminación
Causas que obliguen a retirar al sujeto como elemento del estudio una vez que ha sido incluido en la
investigación
1. Muestras que no sean procesadas adecuadamente.
6.3. Cédula de recolección de datos (Adjuntar)
Formato donde se anotarán todas las variables por investigar y que se llenará con los datos de cada
elemento en estudio
6.4. Descripción general del estudio
Detallar el cuándo, cómo, qué, a quién. Incluir los instrumentos que se usarán para la recolección de
datos
EPE cumple criterios de BBUK
Sujeto control de 65 años o más
Evaluación clínica por
neurólogo
participante en el estudio.
Se hará hincapié en los
factores de riesgo conocidos.
Se solicitará la carta de
consentimeinto escrito
informado para este estudio y
para otros estudios genéticos
afines.
Se obtendrán 10 ml de
sangre periférica
Se obtendrá
DNA
Se obtendrá
DNA
nuclear
mitocondr
ial
GS2019S y G2385A del
gen IRRK2
SNP10398G en el gen ND3 y
H SNP 10298A y 4336C
1.
6.5. Calendario de actividades (Cronograma trimestral, semestral y anual) (Adjuntar)
Se adjunta cronograma
6.6. Análisis de datos
Genero:
Edad: en años cumplidos:
Clasificación clinica de la Enfermedad
Presencia de mutaciones:
Presencia de SNPs:
Variable dicotómica
Variable numérica discreta.
Variable cualitativa ordinal
Variable nominal dicotómica
Variable nominal
Variable nominal dicotómica
Variable nominal
6.7. Métodos matemáticos para el análisis de los datos (consultar asesor).
Seleccionar los métodos de análisis estadísticos de los datos derivados de la investigación.
6.7.1. Chi cuadrada (X2) para comparar proporciones entre dos o más grupos ( )
6.7.2. "t" de Student. Para comparar promedios entre dos grupos ( X )
6.7.3. Análisis de varianza. Para comparar promedios entre más de dos grupos ( X )
6.7.4. Coeficiente de correlación. Para determinar el grado de asociación entre dos variables ( X )
6.7.5. Tablas actuariales de sobrevida. Para poder pronosticar la esperanza de vida ( )
6.7.6. Otros. Especificar
Estadística descriptiva para las variables generales de los pacientes.
Se hará una evaluación de las frecuencias genotípicas de cada una de las mutaciones y
polimorfismos estudiados en cada uno de los pacientes y en cada uno de los grupos y se
hará un análisis a través de tablas de contingencia RR e IC.
Las variables numéricas continuas serán comparadas con prueba de T student no pareada.
Las frecuencias Haplotipos por expectaminación-maximación.
Desviaciones de equilibrio de Hardy-Weinberg se evaluaran con prueba de chi
cuadrada.Diferencias alélicas, genotipicas y haplotipicas entre grupos con serán analizadas
con prueba de chi cuadrada.
8. Financiamiento
8.1. Costo de la investigación
Recursos financieros necesarios para realizar la investigación
(favor de indicar los exámenes de laboratorio y gabinete y el numero de veces que se
realizaran durante el estudio).
Se solicitará financiamiento de FOSEC
8.2. Especificar patrocinadores
Anexar carta compromiso
No aplica
9. Aspectos Éticos
En esta Sección se explicarán con detalle los riesgos y peligros de la investigación, así como
las medidas que deban tomarse para evitar procedimientos inadecuados. El paciente o sus
familiares deberán ser informados de su participación en la investigación y deberá ser
recabada su conformidad por escrito, en los casos que se considere necesario. (Anexar carta
de consentimiento)
Se anexa carta de autorización. . (anexo 3)
Los riesgos de está investigación relacionadas a la toma de una muestra de sangre periférica
9. Hoja de recolección de datos.
Se anexa carta de autorización. . (anexo 4)
ANEXOS
Anexo 1. Criterios Clínicos del Banco de Cerebros de la Sociedad de Enfermedad
de Parkinson del Reino Unido
Anexo 2. Genes asociados al desarrollo de EP
Anexo 3
Carta de Consentimiento Escrito Informado
“EVALUACIÓN DE LAS MUTACIONES G2019S Y G2385A DEL GEN LRRK2 Y LOS POLIMORFISMOS DE
NUCLÉOTIDO (SNP) A10398G, Y T4336C DEL ADN MITOCONDRIAL EN MESTIZOS MEXICANOS CON
ENFERMEDAD DE PARKINSON NO FAMILIAR”
México, D. F., a _________ de_________________________del año _________
Yo____________________________________________________________autorizo mi participación en el
proyecto de investigación titulado “EVALUACIÓN DE LAS MUTACIONES G2019S Y G2385A DEL GEN
LRRK2 Y LOS POLIMORFISMOS DE NUCLÉOTIDO (SNP) A10398G, Y T4336C DEL ADN
MITOCONDRIAL EN MESTIZOS MEXICANOS CON ENFERMEDAD DE PARKINSON NO FAMILIAR”
El objetivo de este estudio es conocer -mediante un estudio de laboratorio- acerca de la modificación en diversos
genes (estructuras que poseen el material de la herencia) que pudieran condicionar o predisponer para padecer
la Enfermedad de Parkinson.
Se me ha explicado que mi participación consistirá en: aportar la información para un cuestionario acerca de
diversos factores de riesgo para desarrollar Enfermad de Parkinson, la toma de una muestra única de 10
ml de sangre, procedimientos que serán realizados por los Investigadores Responsables del Estudio.
Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, molestias y beneficios
derivados de mi participación en el estudio, que son los siguientes:
Riesgos y molestias:
a. Por la toma de sangre:
Malestar y dolor leve, formación de hematoma o morete en el sitio donde se extraiga a sangre (del
piquete de la vena).
b. por la extracción de sangre:
Ninguna
Beneficios:
Se generará información para determinar la asociación entre modificaciones (polimorfismos) en genes y el
desarrollo de Enfermedad de Parkinson, lo que posiblemente permitirá hacer prevención y ofrecer un tratamiento
oportuno.
Entiendo que conservo el derecho de retirarme o retirar mi muestra biológica (sangre) del estudio en
cualquier momento en que lo considere conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo.
Asimismo, se me ha informado que esta muestra será almacenada a -20°C durante un período de 10
años en la División de Medicina Geonómica del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, ISSSTE, México, D.
F. para su uso en el citado proyecto algún otro que implique la valoración de polimorfismos genéticos, a
partir de la toma de la muestra y pasado el periodo mencionado las muestras serán desechadas.
El investigador responsable se ha comprometido a darme información oportuna sobre cualquier información que
pudiera ser ventajoso para mi tratamiento, así como a responder cualquier pregunta y aclarar las dudas que le
plantee acerca de los procedimientos que se llevarán a cabo, los riesgos, beneficios o cualquier otro asunto
relacionado con la investigación o con su tratamiento.
El investigador responsable ha brindado la seguridad de que no se me identificará en las presentaciones o
publicaciones que deriven de este estudio y que los datos relacionados con mi privacidad serán manejados en
forma absolutamente confidencial. Para cumplir lo anterior, el investigador utilizará para la creación de la base
de datos (que tendrán mi información clínica, así como las respuestas del cuestionario acerca de mis datos que
se me aplicará), número de folio (NO se empleará mi nombre) para identificarme y de esa forma conservar mi
anonimato.
Datos de los investigadores responsables a los cuales puede comunicarse en caso de dudas o preguntas
relacionadas con el estudio.
En el Centro Médico Nacional “20 de Noviembre” ISSSTE: Comisión de Ética del CMN “20 de Noviembre”
Dr. Abel Archundia García Presidente, 1er. Piso del edificio D, Subdirección de Enseñanza e Investigación,
Calle San Lorenzo 502, esquina Av. Coyoacán, Col. Del Valle, Delegación Benito Juárez, C.P. 03100 Teléfono:
52003530; ext. 14629
Dra. Silvia García, y Dr. en C Ramón Mauricio Coral Vázquez, Coordinación de Investigación 1er. Piso del
edificio D, Subdirección de Enseñanza e Investigación, Calle San Lorenzo 502, esquina Av. Coyoacán, Col. Del
Valle, Delegación Benito Juárez, C.P. 03100 Teléfono: 52003530; direcciones electrónicas:
[email protected] y [email protected].
En el Centro Medico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), Dr. Carlos F.
Cuevas García, correo electrónico: [email protected].
En el Instituto de Ciencias Médicas y de la Nutrición “Dr. Salvador Subirán”, Dr. Luis Dávila Maldonado,
correo electrónico: [email protected]
____________________________
Investigador Responsable
____________________________
(Nombre completo y firma) Testigo
__________________________________
(Nombre completo y firma) Paciente
_________________________________
(Nombre completo y firma) Testigo
anexo 4
Hoja de recolección de datos
“EVALUACIÓN DE LAS MUTACIONES EN LOS LOCUS G2019S Y G2385A DEL GEN LRRK2 DNA
NUCLEAR Y POLIMORFISMO DE NUCLEOTIDO UNICO (SNP) 10398G, 10298A Y 463636C DEL ADN
MITOCONDRIAL EN MESTIZOS MEXICANOS CON ENFERMEDAD DE PARKINSON NO FAMILIAR”
Ficha de identificación:
Nombre completo del paciente _____________________________________________________________
Edad (años Cumplidos):__________ Genero:(Fem.) (Mas). Ocupación_____________________ Lugar de
nacimiento_______________________Lugar de residencia ____________________ Estado civil: (soltero)
(casado) (viudo) (divorciado) (otro)__________________
Antecedentes familiares: Lugar de nacimiento de
Su padre:_____________________________________su madre:__________________________________
Abuelo Paterno:_______________________________Abuela Paterna _____________________________
Bisabuelo Paterno:_____________________________Bisabuela Paterna ___________________________
Abuelo Materno: ______________________________Abuela Materna: ____________________________
Bisabuelo Materno: ____________________________Bisabuela Materna: __________________________
Antecedentes del paciente:
Escolaridad:
Primaria / secundaria
Preparatoria /nivel técnico
Licenciatura
Postgrado:
Especialidad
Maestría
Doctorado
(
(
(
(
(
(
)
)
)
)
)
)
Historia de Tabaquismo:
(si)
(no)
Sí es positivo:
(cigarrillo) (puro) (pipa)
Tiempo de consumo (en meses)____________Cantidad promedio (cigarrillos al día) _________ o equivalente
(gr. tabaco)___________________
Contacto con pesticidas
(si)
(no)
Sí es positivo: ¿Cuál?___________________¿Cuando?_________________
Tiempo de contacto (en meses)__________
Contacto con neurotóxicos
(si)
(no)
Sí es positivo: ¿Cuál?___________________¿Cuando?_________________
Tiempo de contacto (en meses)__________
Historia del padecimiento:
Fecha de Inicio de la Enfermedad de Parkinson mes /año ________________ Edad del paciente al inicio de la
enfermedad
(años
cumplidos)__________Tiempo
de
evolución
de
la
enfermedad
(en
meses)_________________ Temblor esencial previo a la EPP (si) (no) Periodo___________________
Estadificación según
Höen&Yarh
Höen&Yarh
Deterioro Intelectual
(si)
(no)
off
on
(1) (1.5) (2) (2.5) (3) (3.3) (4) (4.5) (5)
(1) (1.5) (2) (2.5) (3) (3.3) (4) (4.5) (5)
Diagnóstico_____________________________
Medicamentos antiparkinsonianos (en cualquier etapa de la enfermedad): L-dopa
Anticolinérgicos
(si) (no)
Dopamiméticos
(si) (no) Amantadina
Inhibidores MAO (si) (no) Inhibidores tricíclicos
(si) (no) Antihistamínicos
Otros________________________
(si) (no)
(si) (no)
(si) (no)
Recopiló la información________________________________Fecha______________________
Anexo 5
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